Nailfold Capillaroscopyを使用して、毛細血管密度の定量のための再現性のコンピュータ化された方法

Summary

毛細血管鏡検査は、微小循環中の毛細血管を直接視覚化するための、非侵襲的で効率的で、比較的安価で習得しやすい方法論です。 しかし、これまでのところ、毛細血管鏡検査データの定量化に利用できる複雑なソフトウェアプログラムの信頼性について記述した論文は1件だけです。 ここでは、標準化されたアルゴリズムを使用してキャピラリーを定量するためのシンプルで信頼性の高いプロトコルを紹介します。

Abstract

Capillaroscopyは、効率的で、直接微小循環を可視化するための方法論を学ぶために、比較的安価で容易な非侵襲的です。 capillaroscopy技術は、潜在的に価値のある皮膚科、眼科、リウマチおよび心血管臨床のさまざまなアプリケーションにつながる、患者の微小血管の健康への洞察を提供することができます。さらに、腫瘍増殖は、腫瘍内微小血管密度を測定することによって定量することができる血管形成に依存してもよいです。しかし、技術の無い標準化に現在ほとんどありませんし、現在まで唯一の出版物はcapillaroscopyデータを定量するための現在利用可能な、複雑なコンピュータベースのアルゴリズムの信頼性を報告します^。1本論文では、アルゴリズムをカウント新しい、より簡単な、信頼性の高い、標準化された毛細血管を説明nailfold capillaroscopyデータを定量します。このような単純な、再現性のあるコンピュータ化されたcapillaroscopyアルゴリズムは、より多くのを容易にするであろう研究者や臨床医の間で技術の普及。多くの研究者は、現在の結果のユーザ疲労や主観を促進し、手でcapillaroscopy画像を解析。本稿では、再現性、半自動計数アルゴリズムに加えて新たな、簡単に使用できる自動化された画像処理アルゴリズムを説明します。このアルゴリズムは、主観を削減しながら、数分で画像の解析を可能にします。トレーニング時間の最小量は、（我々の経験では、1時間未満）が技術を習得するために必要とされます。

Introduction

微小血管イメージングは、多くの潜在的な臨床用途に急速に成長している分野である^。2例えば、癌専門医は、可能な治療の選択肢への腫瘍と洞察力の状態に関する貴重な情報が得られる、腫瘍血管新生の程度を決定するために微小血管イメージングを使用しています^{。3 4}しかし、 nailfoldのcapillaroscopyは、おそらく微小血管イメージングの最もコスト効率的で広く適用可能な形態です。研究者らは、血流量を研究し、毛細血管の形態を調査するために、ビデオnailfoldのcapillaroscopyを使用しています^{。5 6}両方のビデオと静止画nailfoldのcapillaroscopyをレイノー現象や、全身性硬化症などの様々な結合組織疾患の診断と治療の世話をするために補助剤です^。2

Nailfold capillaroscopyは、同様に、様々な潜在的な心血管系の用途を有します。 nailfold capillaroscopyを使用して現在の研究は示唆していますその糖尿病1型および2型の患者が異常な毛細管形態の有病率が高いを示し、まだ非糖尿病個体と比較して変わらない毛細血管密度を有する^。7-8 Capillaroscopyも高血圧で実験的に研究されてきました。減少毛細血管密度につながる構造毛細管希薄非高血圧個体と比較して、高血圧の個体において実証されている^。9-10これらの古い高血圧患者とは対照的に、構造的な希薄化を示し、より最近の研究はことを示した（40および上記の平均年齢）若い高血圧患者は（40歳未満の平均年齢）構造的希薄化することなく、機能的な希薄化を持っている^。11これは、機能的な希薄化を前に発生し、構造的な希薄化に時間をかけて進行し得ることを示唆しています。

興味深いことに、このようなペリンドプリル/インダパミドなどの特定の降圧薬で処置された高血圧患者はノルムを表示しましたアル毛細血管密度および治療 ​​後内皮機能、ACE（アンジオテンシン変換酵素）阻害剤または利尿剤で処置したものは、同程度の血圧制御にもかかわらず、低毛細血管密度を維持しながら¹²は、これは、いくつかの降圧薬は、毛細管を逆にすることによって毛細血管密度を正規化することを示唆しています高血圧によって生じる希薄化。また、他の研究者は、食塩摂取量の減少は高血圧の個体の両方の機能的および構造的な毛細管希薄の逆転につながることが示されている^。13

この技術の様々な潜在的な臨床応用にもかかわらず、ほとんどの標準化は、毛細血管密度画像を定量するための技術であります^。2日に、研究者は毛細血管密度の結果のみが正確な場合、イントラオブザーバーと観察者間の両方の観点から、再現性があることを発見しました同じ領域が毎回カウントされている^{。1,14 15} 注目すべきは、以前の研究者は、主に遅く、主観的なプロセスである裸眼^{、9 16 17 18を}使用して手動でキャピラリーカウントを行いました。

毛細血管画像の定量のための標準化された、コンピュータベースのアルゴリズムは、理論的にcapillaroscopyの臨床応用を促進する、より少ない主観で、より効率的かつ再現可能なデータ分析を提供しています。一部の研究者は、確かにnailfold capillaroscopic写真からデータを定量するために、コンピュータベースのプログラムを使用していた^{。1,6 19 20}しかし、現在までの唯一の出版物は、capillaroscopyデータを定量化するために利用可能な複雑なソフトウェアプログラムの信頼性を説明し^1、このプログラムは次のように複雑です以前にまったく同じ視野をカウントするための要件によって上記の。ここでは、することが可能標準化されたアルゴリズムを使用して、毛細血管を定量するための簡単​​な、信頼性の高いプロトコルを提示複数の視覚的なフィールドの使用。複数の視野を使用すると、手続きを簡素化するだけでなく、毛細血管数の正常な生物学的変化の評価を可能にするだけでなく。

本研究の目的は、毛細管定量プロセスを標準化し、再現性、効率的なコンピュータベースのアルゴリズムを記述することです。これらの方法は完全に自動化されていないが、彼らは非常に少ないユーザー入力を必要とし、絵の迅速かつ信頼性の高い定量を提供します。

Protocol

注：キャピラリーの画像を取得するための取得プロセスは、以前に公開されていると、対応する画像取得と解析コンピュータプログラムでデジタルスチルカメラを用いて達成される^{11 21}この実験室分析のために静止画像を利用していないビデオ、分析のための画像取得を単純化します。以下は、画像から毛細血管を定量するための新しい技術が記載されています。

1.画像強調処理

1. モノクロデジタルカメラとデジタル画像を取得します。このようなカメラで支配者として知られている長さの物体を撮影することにより、既知の大きさの物体に画像を調整します。このプロセスは、正確に測定し、処理後の毛細血管を計数するためのコンピュータプログラムを可能にします。理想的には最高の精度のために、レチクル（それにエッチング定規とガラスの科学的に製造された作品）を使用する必要があります。 1mm角の画素数を測定しますコンピュータプログラムを使用してボックス。
   注：このプロトコルの再現性と標準化の鍵となるのは、主にカウントさ1ミリメートル²ボックスの適切な配置に依存しています。
2. 毛細血管を暗くし、毛細血管の可視化を最大化する背景を、軽減するコントラスト強調ツールを使用してください。背景からの毛細血管の初期分化は、後工程での画像の適切なトリミングのために重要です。使用して画像を調整することでこれを行ってくださいにこのクリックを行うには「最適ヒストグラムを。」：キャプチャ、強度、画像ヒストグラム、ベストフィット。
3. 新しいイメージとしてキャピラリーカウント用の関心領域（ROI）をトリミング（、関心領域を選択します）。 1ミリメートルに等しい530ピクセルで画像を較正することによって決定された1ミリメートル²ボックスを使用してください。トリミングされた画像は、画像の一番上に毛細血管ループの頂点を配置していることを確認してください。
4. したがって、すべての将来像の調整が均等に適用される画像を平らに画像。で、この表示することができません：、プロセスタブ、2Dフィルタを平らに、「明るい、 "オブジェクトの幅のBG強度が「75」適用します。
5. 毛細血管を最大限に可視化されるように画像のコントラストを上げます。これを行うには、クリック：75にコントラストを上げ、タブ、ディスプレイを調整します。
6. プロセス]タブ、2Dフィルタ、スペックル除去、カーネルサイズ7×7をクリックすることにより毛細血管の縁を滑らかに画像をスペックル除去、適用されます。
7. 毛細血管が黒で、背景が白になるように画像のコントラストを確定。 「ベストフィット」モデルにヒストグラムを調整することによって、この手順を実行します。
   注：処理された画像は、次の手順を実行してどのように見えるかの例については、代表的な結果では、図2を参照してください。

キャピラリーカウント/定量毛細血管密度の実行2.

1. 各画像には、手動で「対象オブジェクト」featurを使用して、明確に定義された毛細血管の一部を選択eはプログラムによってカウントされるオブジェクトとして認識されます。そして、カウントアルゴリズムによって無視される必要がある領域を基準として、「バックグラウンド」機能を使用して、背景の小さな部分を選択します。
   注：これらのハイライトの組み合わせは、バックグラウンドノイズを無視して、すべての毛細血管が強調表示されます。定量（カウント）プロトコルは、色や形態学に基づいて画像の一部を区別するためにコンピュータ機能を利用します。
2. 瞬時に撮像装置を用いて画像内のすべての毛細血管をカウントするカウント機能を使用してください。キャピラリとしてバックグラウンドノイズをカウントしないようにするために5ピクセルのカウントオブジェクトの最小直径を設定します。
3. より信頼性の高い評価を得るために、4つの画像 - 各個人のために、3の平均を数えます。
   注：画像は、カウンティング手順の間にどのように見えるかの例については、代表的な結果では図3を参照してください。

3.作成して画像処理を自動化するマクロの使用

注：時間を節約するために、マクロを自動的に一つ又は多数の画像上のプロセスの特定のシーケンスを実行するために作成することができます。これらの配列は、画像の修正を迅速にするためにカスタマイズすることができます。本質的には、これらのマクロは、画像を処理する方法を覚えて、迅速かつユーザー入力ですべての手順を実行します。マクロのない絵あたり約8分とは対照的に、12キャピラリー画像にカウントを実行すると、マクロ（画像ごとに2〜3分）で20〜30分の間、このラボを取ります。したがって、マクロを使用すると、手動で各個々の画像を処理するよりも3〜5倍、より効率的です。

1. マクロを作成するためには、「マクロの記録」を選択し、一つの画像の上に、上記の手順1と2で説明したようにステップとプロセスは、希望する実行します。今後の参考のために実行された画像処理の手順に基づいて、マクロに名前を付けます。ときUSIを将来の絵のマクロngを、単に「実行マクロ」をクリックして、プログラムが自動的に所望の画像（複数可）に記録された拡張機能が適用されます。
   注：このラボでは、数秒のメソッドの第1のステップの一つが、すべてを実行するマクロを使用しています。ユーザー入力を必要とする唯一のステップは、どこで画像をトリミングするために、ステップ1.2を選んでいます。

Results

この画像処理手順の目的は、それらが正確に定量することができるように、背景画像から毛細血管を区別することです。不完全な画像処理や過度の画像処理の両方が毛細血管を定量化するためのプログラムの機能に有害です。 図3に見られるように、不完全な画像処理は、バックグラウンドから区別する毛細血管を困難にします。これは、ユーザーが、上記のカウント方法が正確にいくつかの毛細血管を強調表示するユーザの能力に依存するため容易に毛細血管の境界を区別することができることが重要です。一方、 図3に見られるように、不要な画像処理手順の適用は、毛細血管のボケとしたがって、定量化プロセスに有害であり得るにつながる可能性があります。

最適に処理された画像は、30秒以内にカウントされ、明確ような背景から、毛細血管を区別することができます互いにだけでなく、個々のキャピラリー。処理された画像の例を図3に示すカウント画像と、 図2パートDに見られます。

Discussion

Nailfold capillaroscopyは、様々な腫瘍学、心臓血管、およびリウマチ疾患の用途のために、将来的に臨床的に有用なツールとして有望です。画像取得プロセスは、研究者の間でかなり一貫性のある、まだ画像処理及び分析のための多数の方法が現在存在します。メソッドは、現在のコンピュータと手動キャピラリー数が含まれています。彼らは時間がかかり、ユーザの主観と疲労にさらされるように手動カウントが問題です。現在のコンピュータベースの方法では、画像強調処理および定量プロセスの両方において、ユーザー入力の高レベルを必要とします。画像強調ステップが完全に自動化されているとしてここで説明する新しい方法は、比較的少ないユーザーのトレーニングや関与を必要とします。ユーザ入力のみが処理された画像内の背景からキャピラリを区別するために、最初に計数処理のために必要とされます。ここで説明するように自動化されたマクロを使用すると、マヌーよりも3倍から5倍より効率的です各個別の画像を処理味方。

capillaroscopyデータを定量する信頼性の高い標準化されたコンピュータベースのアルゴリズムが不足して...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Image-Pro Premier	Media Cybernetics, Inc	9.1	画像処理ソフトウェア