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方法論記事

粒子追跡マイクロレオロジーによりバイオフィルムの機械的特性のその場でのマッピング

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DOI：

10.3791/53093

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2015年12月4日

 ,  ,  , 
1Interdisciplinary Graduate School, Nanyang Technological University, 2Singapore Centre on Environmental Life Sciences Engineering, Nanyang Technological University, 3School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, 4Centre for Marine Bio-Innovation, University of New South Wales, 5School of Biological, Earth and Environmental Sciences, University of New South Wales, 6School of Biotechnology and Biomolecular Sciences Sciences, University of New South Wales

この記事について

サマリー

Particle-tracking microrheologyは、材料の粘弾性を調査します。ここでは、この手法を使用して、細菌バイオフィルムのさまざまなマトリックス成分の粘弾性、クリープコンプライアンス、および効果的な架橋の役割を決定します。マトリックスは、バクテリアによって分泌される高分子物質とその成分がバイオフィルムの構造と機械的特性を決定します。

要約

細菌細胞は、細胞外高分子物質(EPS)に自分自身を包み込むことにより、バイオフィルムとして知られる表面付着バイオフィルムコミュニティを形成することができます。EPSは、細菌細胞を収容する物理的および保護的な足場として機能し、タンパク質、外多糖類、DNAなどのさまざまな材料で構成されています。EPSの組成は変化する可能性があり、これによりバイオフィルムのメカニズム特性が再モデル化され、環境の手がかりに対する応答として、ストリーマーなどの代替バイオフィルム構造がさらに開発またはサポートされます。それにもかかわらず、EPSコンポーネントがバイオフィルムの機械的特性と機能にどのように寄与するかについての定量的な説明はほとんどありません。物質の流れを研究するレオロジーは、多くのバイオフィルムが流動条件で成長し、常にせん断応力にさらされるため、バイオフィルムに特に関連性があります。また、表面上のバイオフィルムの広がりに関する測定と洞察も提供します。ここでは、粒子追跡マイクロレオロジーを使用して、開発中のバイオフィルムのさまざまな部分におけるさまざまなマトリックス成分の粘弾性と効果的な架橋の役割を調べます。このアプローチにより、研究者はバイオフィルムのメカニズム特性をマイクロスケールで測定することができ、バイオフィルムの制御とエンジニアリングに役立つ情報が得られる可能性があります。

概要

ほとんどの細菌細胞は、両方のプランクトン（自由生活）と成長1の表面に付着した（固着）モードを採用することができます。成長の表面接続モードでは、細菌細胞が分泌し、バイオフィルムを形成するために、細胞外高分子物質（EPS）を大量に身を包みます。 EPSは、主にタンパク質、エキソポリサッカライド、外DNAで構成され、バイオフィルム形成2に不可欠です。これは、細菌が空間的に区別するために使用することが可能な物理的な足場として機能し、有害な環境条件と宿主応答から細菌を保護します。 EPSのさまざまなコンポーネントは、バイオフィルム形成3で異なる役割を持っており、EPSの成分の発現の変化は劇的にバイオフィルム構造体4 を改造することができます。 EPS成分も分子5のシグナルとして機能することができ、最近の研究では、それらの移動およびバイオフィルム差分を案内するために微生物細胞と相互作用する特定のEPSのコンポーネントを示していますerentiation 6-8。

EPSの研究は大きく、EPS 9,10の特定のコンポーネントで欠損変異によって生成したバイオフィルムの形態学的な分析に基づいて進んでいます。また、EPSは通常、マクロスケール（バルク特性評価）11で特徴づけられます。形態学的には、しかし、定量的なディテールやバルク特性評価を欠いて、平均値を返し、バイオフィルムの異質内に存在する詳細を失うことができます分析します。マイクロスケールでのEPSのメカニック特性のリアルタイム特性評価に進行する増加傾向が存在することになります。このプロトコルは、粒子追跡マイクロレオロジーは、 緑膿菌バイオフィルム4の粘弾性および有効な架橋のマトリックス成 ​​分ペルとPSLエキソポリサッカライドの時空間的効果を決定することができる方法を示しています。

パッシブマイクロレオロジーは、簡単かつ安価であるRH日付12,13の材料の空間microrheologicalサンプリングの最高のスループットを提供eology方法。受動的なマイクロレオロジーでは、プローブ球体は、サンプル中に配置され、熱エネルギー（k BはT）によって駆動されるそれらのブラウン運動は、ビデオ顕微鏡が続きます。いくつかの粒子が同時に追跡することができ、粒子の時間依存座標は、従来のランダムウォークに従ってください。したがって、平均して、粒子は、同じ位置にとどまります。しかし、粒子の変位の標準偏差または平均二乗変位（MSD）は、ゼロではありません。粘性流体が流れているので、時間が進むにつれて、粘性流体中の粒子のMSDは、直線的に増加します。これとは対照的に、粘弾性又は弾性物質で見られる高分子架橋は、彼らが流れに抵抗するのに役立ち、かつ粒子がMSD曲線（ 図1A）でプラトーにつながる、その変位の限らになります。この観察は、関係を次のMSDαt αは、物質の弾性と粘性の寄与の割合を関連している拡散指数であるα、>アップ。 MSDはまた、恒久的に上に変形する材料の傾向である、クリープコンプライアンスを計算するために使用することができる粘性流体にα= 1、粘弾性物質で0 <α<1、及び弾性物質でα= 0で移動する粒子について時間とは、どのように簡単に材料のスプレッドを推定します。

粒子の大きさ、密度、および表面化学はmicrorheological実験の正確な適用に重要である（この場合、バイオフィルムマトリックスのポリマーは、 図1Bを参照）について検討システムに関して選択されます。まず、粒子は、粒子自体よりもはるかに小さい構造を持つ物質のレオロジーを測定します。物質の構造は、粒子、額面の動きと同様の規模のものである場合ticleは、個々の構造の形状や向きによって乱されます。しかし、粒子の周囲の構造が非常に小さい場合、この効果は小さく、粒子（ 図1B）に均質な環境を提示し、平均化。第二に、粒子の密度は、媒体（1.05グラムml -1の水性媒体のための）沈降を回避し、慣性力が無視できるようにしていることのようになります。ポリスチレンラテックス粒子のほとんどは、上記の基準を満たしています。運動は、物質の構造と熱エネルギーとの衝突によって駆動される、ランダムであれば、粒子のMSDのレオロジー解釈にのみ有効ですとして理想的には、粒子がバイオフィルムマトリックスのポリマーと相互作用しません。これは、プローブ粒子は、プレバイオフィルムの成長表面に結合するか、バウンスする傾向があるかどうかをチェックすることによって観察することができます。しかし、バイオフィルムへの魅力の欠如にもかかわらず、粒子がマトリックスに組み込むことができる必要があります。また、バイオフィルムの物理化学的不均一性は、異なる粒子は、バイオフィルムの異なる領域におけるプローブとして、より適している可能性があります。したがって、異なるサイズおよび表面化学の粒子は、バイオフィルムに適用されるべきです。

このように、粒子のMSDは、異なる成分がレオロジーに寄与し、バイオフィルムの拡散方法に関する有用な情報を提供することができます。さらに、異なるプローブの使用は1つがバイオフィルムの空間の物理化学的不均一性に関する情報を導出することができます。この方法は、バイオフィルムの機械的特性に影響抗菌治療を試験するために使用される、またはバイオフィルムの機械的特性は、別の種の導入によって変更されたかを調査するために、混合種バイオフィルムに適用することができます。粒子のMSDはまた、バイオフィルムの分散を特徴付けるために有用であり得ます。このような研究は、潜在的にAバイオフィルムの治療を改善する、バイオフィルムの我々の理解に役立つであろうND便利な活動のためのバイオフィルムのエンジニアリング。

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プロトコル

1.バイオフィルム栽培

  1. 細菌株の作製
    1. 1日前にバイオフィルムの栽培に、凍結した細菌培養物からの適切な成長培地2mlを接種することにより、浮遊性細菌培養液を準備します。ムコイドPのルリア-ブロス培地（10gのL -1のNaCl、10グラムL -1の酵母抽出物、および10gのL -1トリプトン）を使用します緑膿菌とそのΔ ペルとΔPSL欠損変異株。 37℃、200 rpmで振とうした条件で一晩インキュベートします。分光光度計を用いて0.40のOD 600に一晩培養を希釈します。
    2. 好ましくは、分解することなく、フローセルを撮像する顕微鏡部屋にすることができる移動局またはトロリーに、以前に記載14されたフローセルのセットアップを組み立てます。
    3. 2 Lまたは各フローセル5 Lボトルに無菌成長培地を準備します。最少培地M9（48ミリモルの Na 2 HPO 4、22 mMのを使用してくださいKH 2 PO 4、19 mMのNH 4 Clで、9のNaCl、2mMのMgSO 4を、および0.1mMのCaCl 2）Pの 0.04％グルコース（重量/容量）および0.2％（重量/容量）カザミノ酸）を補充し緑膿菌は、セルバイオフィルムを流します。
    4. マイクロ遠心チューブに小分け蛍光マイクロスフェアおよび9,391.2 gで遠心分離器で5分間滅菌H 2 Oにスピンダウン。前2 Lまたは5 L培地ボトルに増殖培地に添加するアジ化ナトリウム（消毒剤）を除去するために1ミリリットルの増殖培地中で上清と再懸濁を削除します。
      注：マイクロスフェアの異なるサイズが異なる濃度で来て、指示に応じて希釈してください。例えば、2.18×10 6マイクロml -1の各粒子サイズのを与えるために直径1.0μmのマイクロスフェアの120μlを、0.5μmの直径のミクロスフェアと成長培地の2リットルに0.2μmの直径のミクロスフェアの0.96μlの15μlのを分散させます。
    5. upstを培地ボトルを取り付けフローセルの連増殖培地全体設定を通って流れることを可能にします。流れを停止し、フローセルチャンバーに希釈した一晩培養を注入。細菌が約5.5×10 -3 Mの秒 -1、または蠕動ポンプで8回転数の流量で成長培地の流れを継続する前に1時間カバーガラスの基層にアタッチすることを許可します。
      注：バイオフィルムは、通常3-7日、室温（25℃）で栽培されています。
    6. また、静的な文化のセットアップのために、粒子と1ミリリットルの成長培地に一晩培養物10μlを加えることによって、微量遠心管中で一晩培養を100倍に希釈します。フローバイオフィルムに使用されるものに比べて約500倍の静的培養のための増殖培地中の粒子濃度を増やしフローセルバイオフィルムを常に補充される（例えば、増殖培地10mlに1.0μmの直径の球の600μLを洗浄し、再懸濁）粒子が、静置培養ではありません。
      1. 200を追加します。1; 8ウェルスライドチャンバーに粒子と希釈し一晩培養物のリットル。静的な条件の下で、37℃でインキュベートします。バイオフィルムは、通常、1日に栽培されています。バイオフィルムは、1日以上成長させると粒子と新鮮な増殖培地で毎日過ごした成長培地を交換してください。

2.顕微鏡

  1. 3日目と5日、蠕動ポンプからの流れを切り、顕微鏡室にフローセルのセットアップを持って来ます。フローからドリフト（環境の変化によって、系統誤差の原因）を防止するために、フローセルチャンバーの入口と出口の近くにチューブを固定します。正立顕微鏡の顕微鏡ステージ上にフローセルを置きます。
    注：マイクロウェルのイメージングのために倒立顕微鏡を使用してください。
  2. 以下のために（3日目および5）さまざまな場所（微小コロニーとフラット未分化層）で、別の日に、バイオフィルムに埋め込まれたマイクロスフェアの動きのビデオを取るために40倍油浸対物レンズで蛍光顕微鏡を使用してください時間的・空間的な調査。長い時間をかけてイベントを調査するために、短い時間スケール（高速ダイナミクス毎秒25〜50フレームのフレームレートで例えば 1.5〜3分ビデオ）内で発生するイベント、低いフレームレートで長い動画を調査するために、高いフレームレートで短いビデオを撮影スケール（2.5〜5フレーム/遅いダイナミクスのための秒のフレームレートで例えば 15〜30分間のビデオ）。
    注：ビデオは、典型的には5~10の粒子を含み、ファイルサイズ、典型的に1.0から2.5 GBのです。大きい微小コロニーは、より多くの粒子を保持することができます。各カテゴリの5-10動画（異なる微小コロニーのとフラット未分化層内の異なる場所の例 5-10ビデオ）を取ります。バイオフィルムマイクロコロニー、チャネル、ボイドやフラット未分化の層から成ってもよい異種のアーキテクチャを有しています。
  3. フィジー/ ImageJの（例えばCZI、TIF）で読み取ることができる適切な形式で動画を保存します。
  4. 完成したVIDをスクロールしてドリフトのためのビデオをチェックEO粒子が同時に同じ方向に移動しないことを観察します。ドリフトは、Zステージの動き、フローセル内の電流、除振台、空気圧や温度変化の不均衡によって引き起こされ得ます。正しいマイナー通常顕微鏡ソフトウェアを備えた後処理技術を使用して漂流。ドリフトを補正することはできませんここで任意のビデオを破棄します。解像度（ピクセル/ UM）、フレーム、時間数：粒子追跡解析時に必要とされている以下のパラメータを、記録しておきます。
  5. 顕微鏡ステージからフローセルを取り外し、バイオフィルムを栽培継続する蠕動ポンプを再起動します。

3.粒子追跡解析

  1. オープンソースソフトウェア（ImageJの）にプラグインTrackMateを使用することにより、粒子の軌跡を取得します。フィジーでダウンロードhttp://fiji.sc/Fiji。フィジーでビデオを開き、プラグインメニューの下、トラッキングとTrackMateを選択します。
  2. 目の設定を確認するか、調整Eウィンドウステップ2.4​​に記録されたビデオのパラメータを一致させるために、初期キャリブレーション設定を示唆しています。
  3. ImageJのを使用してTrackMate中の粒子を検出します。
    1. （例えば1000）のログ検出器」、入力された粒子径およびしきい値を選択します。紫色の円は、ビデオ全体の粒子に従うことを確認するには、「プレビュー」ボタンをクリックしながら、映像をスクロールします。必要に応じて直径値としきい値を調整します。紫色の円は空のスペースに表示された場合のしきい値を大きくします。十分ではない粒子が検出された場合のしきい値を減らします。検出に粒子を完了するために、次のボタンをクリックします。
    2. 「初期しきい値」で検出された粒子を追加または削除するオプションが提示された場合、次のボタンをクリックし、[ビューを選択 'と初期粒子検出が良好であった場合は調整せずに続行するには、Windows「フィルタを選択」を。
    3. OPTIの「簡易LAPトラッカー」を選択します「トラッカー方法を選択]ウィンドウのバーに粒子はほとんどバイオフィルムに焦点の外に移動しないと簡単に追跡されます。提案し、低リンクとギャップ閉鎖最大距離値を使用して、次へをクリックします。
    4. その粒子追跡は、粒子がTrackMateによって描かれたトラックに従うこと、および不要なまたは不足しているトラックがないことを確認するためにビデオをスクロールすることにより、良好であることを確認してください。さまざまなフィルタリングステップをスキップします。 「アクションを選択」最後のウィンドウに移動します。ドロップダウンメニューから「xmlファイルにエクスポートトラック」を選択し、「実行」をクリックします。トラックを保存するフォルダを選択してください。
      注：粒子軌跡とマイクロレオロジーの使用を分析するためのパブリックドメインで利用できる様々なプログラムがあります。 msdanalyzerとTrackArtは、MATLAB環境で実行粒子トラッキング解析プログラムの一例です。
  4. のメニューで選択することで、xmlファイル内の粒子軌跡をインポートするためにMATLABを準備MATLABファイル> ...パスを設定し、フィジーのパッケージに使用可能なスクリプトフォルダを追加します。
  5. msdanalyzerと粒子軌跡を分析するために、zipファイルまたはtar.gzファイルへのリンクをダウンロードat http://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/40692-mean-square-displacement-analysis-of-particles-trajectories .
    1. @msdanalyzerフォルダ15を抽出し、MATLABパスに属するフォルダにドロップします（ 例：C： Documents and Settings <ユーザー名> マイドキュメントは、MATLABを）。 MATLABを起動し、入力してアナライザを開始：
      MA = msdanalyzer（2、「ええと '、'秒 '）
      UMと秒は、ビデオ内の物理的な空間と時間の単位である場合。
      1. 次のように入力して、粒子の軌道をインポートします。
        [トラック、MD] = importTrackMateTracks（ 'ファイル名.xml'、 'C​​LIPZ」; 'scaleT'）
        MA = ma.addAll（トラック）;
        ここで「CLIPZ」は、2D映像のためのZディメンションを削除し、「scaleT」。
      2. 使用してグラフ上に軌跡をプロットします。
        ma.plotTracks;
        ma.labelPlotTracks;
      3. 使用して粒子のMSDのを計算します。
        MA = ma.computeMSD。
        ma.msd
      4. 各粒子のMSDのをプロットします。
        図
        ma.plotMSD
      5. ）3.5.1.4に3.5.1.1を繰り返して、同一categery（3日目に野生型微小コロニーに埋め込 ​​ま例えば粒子）の他のビデオから粒子軌跡を組み合わせます。
      6. アンサンブル平均または全ての曲線の平均値をプロットします。
        ma.plotMeanMSD
        リニアから対数スケールにy軸とx軸を変更します。長いラグタイムで、MSD曲線はより長い時間スケールでの不十分な統計にノイジーになります。 MSD曲線はまた、動的エラーに急激に上昇することがあります。曲線のこれらの領域は、ブラシツールを使用して除去することができ>曲線の終点を選択し、選択 'ブラッシング」するツールメニューの「ブラシのかけていないと削除」。
    2. でEzyfitをダウンロードhttp://www.fast.u-psud.fr/ezyfit/とMATLABパスに属するフォルダにEzyfitを追加する（ 例：C： Documents and Settings <ユーザー名> マイドキュメントは、MATLABを）。インストールefmenu MATLABワークスペースを入力してEzyfitメニューをインストールします。 FigureウィンドウにEzyfitメニューを使ってMATLABを再起動します。 Ezyfitメニュー」が表示フィット'>'パワー'>' * X ^ n 'の中で選択することで、べき乗則にMSDカーブフィットは、nは、推定拡散指数 αでした。
      注：msdanalyzerは、MSDカーブのフィッティングのためのMatlabの曲線フィッティングツールボックスが必要です。 Ezyfitはカーブフィッティングを行うことができ、代替とフリーソフトウェアです。
    3. 他の場所や時間に新しい粒子のMSDを計算するためのクリア現在の粒子軌跡とのMSD：
      明確な
    4. 媒体中の粒子の様々な平均MSD曲線（コントロール）を算出した後、および微小コロニーと様々な株の未分化領域、比較のために1つのグラフにカーブをコピーして貼り付けます。試料の剛性と低いMSD値で増加を架橋。フラット曲線は低いαを持っており、サンプルが高いαで急勾配の曲線よりも弾力性があります。
    5. カーブを選択し、そのような中央値と範囲として、データ統計を見て、「ツール」を参照してください。ビーズのMSDは、ビーズが関係に応じて埋め込 ​​まれた材料のJ（t）はクリープコンプライアンスに比例し、
      figure-protocol-1
      ここで、J =クリープコンプライアンス、D =粒子径、k個のB =ボルツマン定数、T =温度と t =時間。

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結果

ボイド（バイオフィルム上記培地）、平野（細胞の未分化フラット層）と微小コロニーを（ 図2A内のラベルを参照してください）含まバイオフィルム、の異なる領域におけるバイオフィルムの局所的な粘弾性特性を調べました。日3〜5の成熟の間のバイオフィルムの粘弾性特性の経時変化も測定しました。空隙中の粒子のMSDは、純粋な媒体中での粒子のMSDに制御匹敵として使用しました。これとは対照的に、バイオフィルムの中に閉じ込め粒子が固定された位置で振動とMSDの値は、粘弾性材料の代表的なものから強く弾性ゲル（ 図3）の範囲でした。

ムコイドP.緑膿菌野生型およびそのΔ ペル変異株 （ 図2Aおよび図2B）は、それらのバイオフィルムで3日目までに細い平野に散在する微小コロニーを開発しました。 3日目のプレーンは、あまりにも薄かったですレオロジー特性の調査。ムコイドP.によって形成されたバイオフィルムの両方で3微小コロニー日に緑膿菌野生...

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ディスカッション

マイクロレオロジーは、微生物バイオフィルムなどの異種システム、で地元のレオロジー測定のための便利なツールです。これは、複数の時点にわたって同じ生物学的サンプル中のレオロジーの変化のリアルタイム監視を可能にする、非破壊的技術です。このプロトコルでは、粒子追跡マイクロレオロジーは、それらが弾力性とバイオフィルムマトリックスの効果的な架橋をどのように影響するかを調べるために、ペルとPSLエキソポリサッカライドの変異体に適用しました。ペルは、粘弾性と緩いバイオフィルムを好むのに対し、PSLは、高い有効な架橋を有する弾性バイオフィルムの開発を促進します。両方のエキソポリサッカライドを製造する場合、バイオフィルムの微小コロニーは、ペル以上のPSLの減少と一致して、バイオフィルムが成熟するにつれて少なく効果的に架橋になります。

異なる細菌種によって形成されたバイオフィルムは、異なるEPS組成を有します。ムコイドPの EPS本研究で用いた緑膿菌の株主consiエキソポリサッカライド16のSTS。他の種は、EPSの彼らの主要な構成...

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

この研究は優秀プログラムのその研究センターの下で教育シンガポール国立研究財団と省によってサポートされ、スタートアップ助成ナンヤン工科大学から（M4330002.C70）、およびACRFティア2（MOE2014-T2-2-172）教育省、シンガポールから。著者は、このプロトコルのデモに参加するためジョーイヤムクオックHoongに感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
フルオロスフィアInvitrogenF-88211.0 μm カルボン酸修飾を有する赤色蛍光 (580/605) マイクロスフェア
Zeiss Axio Imager M1Carl Zeissエピ蛍光顕微鏡
Masterflex L/S デジタルドライブ 07523-80Cole-ParmerEW-07523-80蠕動ポンプ
Flow Cell Chambersデンマーク工科大学
バブルトラップデンマーク工科大学
シリコーンチューブダウコーニング径3 mm、1 mm内径
透明ポリプロピレンプラスチックコネクタ コール・パーマー06365-831/16 in.(1.588ミリメートル)
バインダークリップチューブ
カバースリップThermo Scientific™Nunc™50 x 24 mm
シリンジ 3 mlテルモ
27  Gニードルテルモ
2  L ストレージ/メディアボトルVWR®
バイオフィルムのセットアップを保持するためのトロリー
外をクランプする

参考文献

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