細胞内ターゲティングアプリケーションのための固体脂質ナノ粒子（SLNs）

サマリー

>jove_content<この研究では、生体適合性ナノ粒子の超小さな集団を合成する方法と、それらの細胞相互作用を評価するためのいくつかのin vitro方法が説明されました。

要約

ナノ粒子ベースの送達媒体は、細胞内ターゲティングアプリケーションに大きな期待が寄せられており、細胞シグナル伝達と遺伝子発現を特異的に変化させるメカニズムを提供しています。以前の研究では、局所薬物送達およびバイオマーカー検出アプリケーションのための超小型固体脂質ナノ粒子(SLN)の合成が実証されました。SLNは、有望な薬物送達手段として浮上したナノ粒子送達システムのよく研究された例です。この研究では、SLNに蛍光色素を充填し、粒子と細胞の相互作用を調べるためのモデルとして使用しました。相転移温度(PIT)法は、生体適合性ナノ粒子の超微小集団の合成に使用されました。ナノ粒子-細胞相互作用研究に先立って適切な投与レベルを確立するために、3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルフェニルテトラゾリウムブロマイド(MTT)アッセイを利用しました。さらに、初代ヒト真皮線維芽細胞およびマウス樹状細胞を色素負荷SLNに経時的に曝露し、毒性および粒子取り込みに関する相互作用を蛍光顕微鏡およびフローサイトメトリーを用いて特徴付けた。この研究は、ナノ粒子送達システムとしての超小型SLNが、さまざまな細胞タイプの細胞内ターゲティングに適していることを示しました。

概要

ナノ粒子ベースの送達ビヒクルは、特に細胞のシグナル伝達および遺伝子発現を変化させるメカニズムを提供する、細胞内標的化用途のための大きな期待を示しています。これらの車両は、細胞応答に影響を与え、標的組織内の所望の効果を達成するように設計された薬物、タンパク質、および核酸を装填することができます。ナノキャリアの多くの種類は、脂質、ポリマー、シリコン、及び磁性材料を含む、治療的および診断的利益のために検討されています。これらのシステムは、ローカライズによる薬物送達のためのそれらの潜在的に魅力的であり、全身毒性の低減と、標的組織に治療濃度を増加させました。

固体脂質ナノ粒子（SLNs）は近年、有望な薬物送達ビヒクルとして浮上しているナノ粒子送達システムのよく研究例です。 SLNsは、容易にバイオセンシング^1、化粧品^2、およびTを含む複数の用途のために処方することができますherapeutic配信^3-7。それらの有用性は、それらが生体適合性を高め、その結果、吸収性、非毒性脂質から完全に構成されているという事実から生じます。合成中に、親油性薬剤は、それによって、非経口投与のための薬剤の溶解性および適合性を増大させる、SLN車両に組み込むことができます。 SLN車両はまたそれらの分解およびクリアランスを減少させ、治療効果を最大化し、カプセル化された治療薬を安定化させるのを助けます。これらの車両は、体温^3,4,8,9での安定性のために、制御放出製剤、長時間作用のために特に適しています。重要なことには、脂質ナノ粒子中の薬物のカプセル化は、薬物分子の固有の薬物動態プロファイルを変化させます。これは、狭い治療指数を有する薬物の制御放出を可能にすることによって潜在的な利点を提供します。 SLN内蔵治療薬の放出速度は、脂質の分解速度または中の薬物の拡散速度に基づいて調整することができます脂質マトリックス。

SLNsは、しばしば、特定の標的組織に蓄積するように操作されています。例えば、そのサイズ（通常は10を超えるnm）は、腫瘍組織の漏れやすい血管系は、堆積を促進する循環に保持を増強します。また、粒子の投与経路は、リンパ節^10,11のような特定の生理学的構造を標的とする可能性のある生体内分布を変化させることが示されています。標的組織における沈着すると、ナノ粒子の適切な細胞の相互作用および最終的な内在化を達成することは、選択的に、セル¹²のうち、イオンおよび分子の流れを制御するために、細胞膜の能力に困難です。細胞取り込みを容易にするために、ペプチド、小分子、およびモノクローナル抗体^13,14を含む特異的なリガンドを持つナノキャリアを変更することが可能です。受動浸透とナノ粒子の能動輸送の両方を含むいくつかのメカニズム細胞膜を横切って、以前^{3,12,15に記載されています} 。一般的に、細胞-ナノ粒子相互作用は、細胞型または細胞周期相^12とセル固有のパラメータに加えて、サイズ、形状、表面電荷及び表面化学を含むナノ粒子の物理化学的特性に影響されることが実証されています。

以前の研究は、転相温度（PIT）法^{17を用いて、16}の局所的バイオマーカー検出アプリケーション¹のためのサブ10 nmのSLNsの合成を実証しました。これは、温度を徐々に変化させながら²組成が一定のままで穏やかな合成方法です。加熱した溶液を連続的に攪拌しながら、それはナノエマルジョンで結果を室温に冷却します。このプロセスよりも小さい粒径を有する¹ SLNsの合成の結果は、以前に、脂質ナンの合成のための種々の方法を使用して報告しますoparticles ^17-22。得られたサイズスケール、20nm未満では、増加による表面積および増強された細胞の相互作用のための潜在的に細胞内標的用途のための利点を提供します。

蛍光色素または治療薬を送達するように設計さSLNsの概略図は、 図 1に示されている。SLNsは、脂質内部（例えば、直鎖アルカン）、親油性化合物（例えば、染料または治療剤）の取り込みを可能にし、界面活性剤の外部から成り水に囲まれた（例えば、線形非イオン性界面活性剤）。本研究では、SLNsは、蛍光色素を負荷した、粒子 - 細胞相互作用を研究するためのモデルとして使用します。初代ヒト皮膚線維芽細胞およびマウス樹状細胞は、毒性及び粒子の取り込みに対する相互作用を特徴付けるために、経時SLNをロードされた色素に曝露しました。 3-（4,5-ジメチルチアゾール-2-イル）-2,5- diphenylphenyltetrazoliumブロミド（MTT）アッセイはutiliました適切な投薬レベルを確立するために、ZED。蛍光顕微鏡およびフローサイトメトリーは 、in vitroでの粒子の取り込みを調べるために用いられる二つの方法でした。

主要な構成要素を示すSLNの図1の回路図。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

プロトコル

SLNsの1処理

1. SLNsの合成
   注：サブ20 nmのSLNs ^{1を準備するために} 、PIT法^{1,17,20を使用します。}
   1. 無菌技術、バイオ試薬や細胞培養グレードの試薬 ​​、および滅菌材料（ すなわち 、ピペット、ヘラ、バイアルなど）を使用します。
   2. SLNsの合成（ 図2）のための安全キャビネットを使用してください。
   3. 蛍光染料の0.6 mgの組み合わせバイアル（15ml）中にヘネイコサン（脂質、5重量/重量％の脂質濃度）0.10gを、で共溶融（ナイルレッド（NIR）を、近赤外濃度は、約0.3 mg / mlです） 90℃、および攪拌。
   4. 0.11グラムのポリオキシエチレン（10）オレイルエーテル（界面活性剤、5.5重量/重量％の界面活性剤濃度）を追加します。 90℃、攪拌で得られた混合物を共溶融。
   5. 混合物に滅菌水1.79グラムを追加し、90℃に加熱し、透明なナノエマルジョンが形成されるまで攪拌します。
      注意：継続的な攪拌および制御冷却、SLの下でNSが作成されます。これらの条件は、水中油型エマルションに油中水型エマルジョンの反転を引き起こします。このような脂肪滴へのNIRパーティションと親油性分子。
   6. 対照試料として機能するためには、蛍光色素を加えることなく、並行してナノエマルジョンを準備します。 0.10ヘネイコサンのGおよび0.11グラムのポリオキシエチレン（10）オレイルエーテル、バイアル（15 ml）を90℃で共溶融し、攪拌中に結合します。
      1. 混合物に滅菌水1.79グラムを追加し、90℃に加熱し、透明なナノエマルジョンが形成されるまで攪拌します。
   7. さらに、滅菌0.2μmのフィルターを使用して、各ナノエマルジョンを殺菌。
   
   SLNsの合成の図2の回路図。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
2. 粒子サイズとポルydispersity
   1. ガラスキュベット及び粒径を測定するために設計された装置を用いてSLNs ¹の粒子サイズおよび多分散性を測定するための動的光散乱（DLS）を使用します。
   2. サンプルの測定の前に、標準の準備と測定のための製造業者のプロトコルに従って二つの既知の規格の粒子サイズを測定します。
   3. 標準溶液の1.5 mlをガラスキュベットに充填し、試料と同じ測定条件を用いて、標準溶液を測定します。
      注意：前のステップでは、各標準のために繰り返しました。
   4. 調製したサンプルを測定します。それぞれについて、以下の実験のパラメータを使用します。100秒、水の屈折率（1.33）、水の粘度の実行時間を20°C（1.002 MPA・秒）で。
      注：この方法は、周波数を使用してナノ粒子のサイズを測定するために光をシフトしました。
   5. パルティの平均粒径および多分散性を報告CLEのサイズ分布。
3. 融点および融解潜熱
   1. SLNs ¹の熱挙動を調査するために、オートサンプラーおよび液体窒素冷却源を備えた示差走査熱量計（DSC）を使用します。
   2. 約25 mgのの質量と40μlのアルミニウムパンに調製されたままのSLNsをピペット気密DSC走査中に水分損失を最小限に抑えるために、ユニバーサルクリンパプレスを使用して、パンを密封します。
   3. 5〜80°Cから各ナノエマルションを測定します。
   4. 融点と谷が融点および材料の量で割ったDSCプロットの曲線下面積の積分を表し、DSCプロットから、融解潜熱が融解潜熱を表して報告します。

線維芽細胞と樹状細胞との2 SLNsの相互作用

1. 初代ヒト線維芽細胞の培養
   1. 文化初代ヒトFiの低血清成長サプリメント（LSGS）キットを補充したヒト皮膚線維芽細胞（媒体106）、培養用液体培地中で、製造業者の指示に従ってbroblasts。 80％コンフルエンスに達したときに、37℃、5％CO ₂および継代培養の加湿雰囲気中で細胞を維持します。
   2. MTTおよび画像解析の両方のために、96ウェルプレートで、種子細胞、ウェルあたり2×10 ^4細胞の密度で、前SLN暴露に37°のCO / Nで平衡することができます。
   3. 時間ゼロで、脂質濃度に関して、示された（ 図4）のように、完全培地中でSLNsを希釈し、それぞれにウェルあたり10μLを追加し、96ウェルプレートでよく複製します。
   4. インキュベーション期間中、37°C、5％CO ₂で細胞を維持します。
2. MTT毒性アッセイ
   1. SLNsとのインキュベーションの24時間後に、製造業者のプロトコールに従って、MTTアッセイを用いて細胞生存率を決定します。
   2. 細胞を1回洗浄し、各ウェル（100μl/ウェル）に新鮮な培地を追加します。新鮮な培地で交換する前に、10分間、70％のメタノール溶液中でインキュベートすることにより、コントロールウェルを殺します。
   3. マイクロプレートの各ウェルにMTT試薬（ウェルあたり10μl）を加え、37℃でO / Nインキュベートします。
   4. O / Nインキュベートした後、製造業者のプロトコルに従って提供される界面活性剤溶液（ウェル当たり100μl）を用いて細胞内のホルマジン結晶を可溶化します。
   5. RTでのインキュベーションの3時間後、マイクロプレートリーダーを用いて570nmの測定波長での吸光度の値を得ます。
      注：3-（4,5- dimethylthiazolyl-2）-2、5-​​ジフェニルテトラゾリウムブロミド（w / v）の1％未満であるべきで使用MTT試薬。
3. 蛍光顕微鏡
   1. SLNと線維芽細胞の投与後の特定の時点で、滅菌リン酸緩衝食塩水（PBS）で2回、線維芽細胞を洗浄し、冷70％メタノールで10分間固定します。
   2. 10分後PBSでメタノールを交換し、バンドパス（BP）50分の690 nmのフィルターセットを使用して、倒立顕微鏡を用いて画像をキャプチャします。
4. マウス骨髄樹状細胞の培養
   1. 以前^{23,24に記載されているように} 、マウス骨髄由来樹状細胞（BMDC）を誘導します。簡単に述べると、組換えマウス顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF、300 U / ml）および組換えマウスIL-4で2×10 ^6個/プレートで100 mmのペトリ皿中のC57BL / 10骨髄のプレートの単一細胞懸濁液（B細胞刺激因子、200 U / ml）を。 3日おきにメディアを変更します。
   2. 7日目に、0.5および5.0 / mlの脂質の最終濃度で皿に近赤外ロードSLNsを追加し、37℃、暴露の所望の長さのために、5％のCO _{2インキュベーター内で}細胞を維持します。
   3. 緩く広告を取り除くために（プレートを徹底的に洗浄し、50mlチューブにそれを収集、プレート内のすべてのメディアを吸引することにより、皿から細胞を回収4 mMのエチレンジアミン四酢酸（EDTA）を含むリン酸緩衝生理食塩水5mlの（PBS）とエラン細胞）。同じ50mlチューブで得られた細胞懸濁液を収集します。
5. フローサイトメトリーを介したSLNs定款の評価
   1. ポイント2.4.3で得られた細胞懸濁液の濃度を決定し、12ミリメートルX 75ミリメートルの丸底FACSチューブに3×10 ^5細胞を配布します。
   2. 1mlのPBSを添加し、次に4℃の温度で、400×gで5分間チューブを遠心分離して細胞を洗浄します。
   3. 上清を捨て、PBS / 2mMのEDTA /抗CD11cの-FITCモノクローナル抗体（ml最終0.25μgの/）を含む0.1％のウシ血清アルブミン（BSA）（染色緩衝液）100μlでペレットを再懸濁。暗所で氷上で30分間インキュベートします。
   4. 1mlのPBSで細胞を洗浄した後、4℃の温度で、400×gで5分間チューブを遠心します。
   5. 上清を捨て、それぞれを再懸濁染色緩衝液の400μlのペレット。細胞は現在、（おそらく青と赤のレーザーを装備した）フローサイトメーターでサンプルを取得するための準備ができています。
   6. 解析ソフトウェアフローサイトメトリーを用いて、細胞（FITC陽性）のCD11c +の集団に対してゲーティングし、（PerCPを-のCy5.5またはAPCチャネルで測定）SLNs関連蛍光の強度を比較することによって、DCによってSLNsの取り込みのレベルを評価します。

結果

PIT法はSLNsを合成するために使用され、転相温度は、水浴を用いて決定しました。溶液が透明に見えるまで、サンプルをゆっくりと加熱し、穏やかに撹拌しました。ヘネイコサン脂質を使用して行わSLNsための転相温度は45℃である。 表1は、粒子サイズ、多分散性、融点およびSLNsの融解潜熱を要約します。上述した処理条件を用いて合成SLNsは、18.59と16.87ナノメートルの平均粒径と5.83と4.47の多分散性をそれぞれ（ 図3）と、制御SLNsおよび近赤外線ロードSLNsをもたらしました。 SLNs分散液の安定性は、二つの異なる貯蔵温度（4及び23℃）で6日間の粒子サイズを測定することによってモニターしました。粒径は6日間にわたって変化しなかった（データは示さず）。

SLNsの熱挙動をinvestigました示差走査熱量計を用いてated。合成SLNsは、それぞれ、制御SLNsおよび近赤外線ロードSLNsのためのC°38.0（0.4±）と（0.2±）36.8の融点を有します。対照的に、バルク脂質の融解点は、バルク...

ディスカッション

本研究では、SLNsの合成および細胞内標的化適用のためのそれらの適用が検討されました。これらの生体適合性ナノ粒子は、薬物送達、遺伝子サイレンシング、およびワクチン技術^25-30を含む複数の用途のための送達媒体として有望であることが示されています。超小型SLNsは容易なプロセスを使用して合成し、そして一次皮膚細胞および初代免疫細胞との相互作用を調べました。 SLNsは、モデルの治療貨物を務めた蛍光色素（NIR）のカプセル化を含むように設計されました。

PIT法はSLNを合成するために使用し、得られた粒子特性（粒子サイズ、多分散性、融点、および融解の潜熱）は、動的光散乱および示差走査熱量測定を用いて評価しました。細胞内標的のための粒子サイズおよび多分散分析は、狭い多分散性を有する超小型SLNsの合成を明らかにし、理想的なるアプリケーション。以前に報告されているように、粒径は、細胞間相互作用¹²に重要な役割を果たすことができます。ナノ粒子のサイズは、取り込み効率は、内在経路選択、細胞内局在、および細胞毒性^{12に影響を与える}

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Nile Red (NiR)	Sigma	19123	BioReagent、蛍光に適しています、≥98.0%
Heneicosane	Aldrich	286052	98%
Brij O10	ΣP6136	Brij 97、C18-1E10、ポリオキシエチレン (10) オレイルエーテル
水			滅菌ろ過、BioReagent、細胞培養に適した
シリンジフィルター0.2 & マイクロ;m Supor 膜低タンパク質結合	ライフサイエンス	PN4612	非発熱性
ナノトラック ウルトラ	Microtrac	のシリアル番号 U1985IS	Instrument
Differential Scanning Calorimeter	Mettlet-Toledo		Instument
Primary human fibroblasts	ライフテクノロジー	ズ C-004-5C	新生児 (HDFn)
ミディアム 106	ライフテクノロジー	ズ M-106-500	ヒト皮膚線維芽細胞の培養用の無菌液体培地です。
低血清増殖サプリメントキット(LSGSキット)	ライフテクノロジー	ズS-003-K	完全なLSGS
MTT細胞増殖アッセイキット	トレビゲン	4890-025-K	テトラゾリウム塩、3-[4,5-ジメチルチアゾール-2-イル]-2,5-ジフェニル-テトラゾリウムブロマイド(MTT)
Safire2マイクロプレート	リーダーTecan	の	機器
リン酸塩緩衝生理食塩水	Sigma	P5493	分子生物学用
組換えマウス GM-CSF	Peprotech	315-03	>97%、還元条件下でSDS-PAGEによる、銀染色で視覚化。
組換えマウスIL-4	Peprotech	214-14	>97%、還元条件下でSDS-PAGEによる、シルバーステインで視覚化。