マルチ電極アレイ上に成長させた器官脊髄共培養における機能的再生の調査

中枢神経系（CNS）の器官型切片培養物は、神経発達の神経変性に到達する様々な生理学的および病理学的現象を研究するために広く使用されています。解離細胞培養物と比較して、器官のスライスは、無傷の細胞構築と地元のシナプス回路をより複雑にするという利点を提供します。同時に、組織は 、インビボのコンテキスト全体の複雑さが関与することなく、孤立したように分析することができます。また、選択したセルに簡単に繰り返しアクセスが保証され、細胞外環境を精密に制御することができ、通常、in vitroモデルは、 それらのインビボ対応よりも低コストです。近年、様々な研究が対応する生きている動物^1,2対長期培養の発達プロファイル間の顕著な類似を発表しました。それは、様々なCNSレジオの神経回路が示されていますNSは、開発中に自発的なネットワーク活性を発現し、器官スライスが部分的にこの現象^{3-7を維持すること} 。単離された脊髄調製物は、特にリズム生成⁶および神経回路¹の形成を研究するために使用されています。

器官型スライスの自発的活動を記録する方法は、マルチ電極アレイ（MEAの）の上で培養するそれらです。これらのデバイスは、同時に多数の細胞からの活動電位によって生成された細胞外電位（マルチユニット記録）を監視することができ、複数の電極を含んでいます。 MEA記録の高い時間分解能が与えられた神経回路内の正確な活性の動態を再構築するために使用することができます。さらに、パッチクランプ技術とは対照的に、ニューロンは、それらの動作に影響されないという事実の長期測定し、結果を可能にする、非侵襲的です。

Fまたは、本研究の目的は、器官脊髄共培養およびマルチサイト記録の組み合わせは、脊髄内の機能再生を研究するために使用されました。成人高等脊椎動物の脊髄の損傷から回復する可能性が限られているので、別の戦略は、脊髄損傷後の再生を促進するために研究されています。これまでのところ、皮質脊髄路は、通常、調査のための選択のモデルシステムとなっています。これらの実験は、一般的に高価な時間のかかるであり、単一のグループ内の高い変動に起因する大型動物のコホートを必要とします。また、証拠が脊髄固有の接続（完全脊髄内に閉じ込めているニューロン）は、脊髄損傷⁸後の回復過程において極めて重要な役割を果たしうることを示唆しています。これらの繊維は、繊維路を昇順と降順の干渉を受けずに、生体内で勉強することは困難です。 BonniciとKapfhammer ^{9は、長手方向の}脊髄を使用しました別のアプローチとして、出生後のマウスのスライス培養。機械的な病変を行った後、彼らは半定量的に脊髄セグメント間の軸索の形態学的再生を分析しました。彼らは成熟した年齢で切断培養における病変部位を横切る少なくはなく、なし、軸索を観察しました。 7日後に損傷 - これとは対照的に、若い段階で病変した培養物は、5軸索再生の高い量を表示しました。しかし、機能的な接続のための証拠が提示されませんでした。

したがって、機能的再生の調査を可能にする脊髄固有の繊維のインビトロモデルにおける代表の開発は、脊髄の再生過程についての知識を拡張するための貴重なツールになります。

動物のケアは、スイスの地方自治体（AMTエリーゼLandwirtschaftウントナチュールデKantonsベルン、Veterinärdienst、Sekretariat Tierversuche、承認NRS。11分の52と14分の35）によって承認されたガイドラインに従いました。これらのガイドラインは、欧州共同体指令63分の2010 / EUと一致しています。

注： - サブステップを含む、5すべてのステップ1のための滅菌機器およびソリューションを、層流フード内で作業。

MEAの作製

注：のMEAは、ガラス基板、微細加工金属電極とSU-8ポリマー絶縁層で構成されている（またTscherter ら ^{3を参照）。}本研究の目的のために、市販のMEAは、カスタマイズされた電極アレイの配置（ 図1 A＆B）に注文しました。 68の電極は、電極の自由は300μm幅の広い溝、電動式によって二つのゾーンに分割されている長方形の格子状に配置されていますiCalのリードと絶縁。各電極のサイズは40×40μmであり、それらは中心に中心から200ミクロンだけ離間しています。四つの大きな接地電極は、記録部位の周囲に配置されています。彼らは、サイズの他の標準的な市販のMEA（X 21ミリメートル21ミリメートル）とは異なり、彼らは決まった記録室がありません。

1. 少なくとも30秒毎、100％エタノール（2×）、70％エタノール（1×）および蒸留水（2×）で消毒すすぎMEAについ​​て。乾燥してみましょう。きれいなガラスシャーレ（150ミリメートル×25ミリメートル）で12のMEAと蓋を閉じる - 10を置きます。
2. 120℃で20分間オ​​ートクレーブのMEA。室温で保管してください。
3. -20℃でのMEAや店舗のアリコートのために（材料のリストを参照）塗布液を調製します。
4. 個々の滅菌ペトリ皿（35ミリメートル×10 mm）の各MEAを置きます。
5. 電極の上に150μlの冷やした塗布液を入れ、シャーレの蓋を閉じるために冷却されたピペットを使用してください。約10分後の上部に気泡を確認必要に応じて、そっと電極とは、ゴム被覆スパチュラでそれらを削除します。 RTで1時間休ませてください。
6. 吸引し塗布液残基、出生前および胚の神経細胞のために最適化中、蒸留、滅菌水で2倍と1倍を洗います。 MEAのが翌日まで使用されていない場合は、インキュベータO / Nで37℃の蒸留、無菌水に保管してください。それ以外の場合は、室温で直接乾燥させてください。

器官培養物の調製および増殖に必要な2成分

1. カルシウムを含まない洗浄溶液を準備（材料のリストを参照）。
2. 洗浄溶液中に鶏のプラズマを再構成（1：1、軽く振って、泡の形成を避けるため）、約20分間、3000×gで遠心分離し、滅菌チューブに明確な内容をデカント。小分け-20℃でクリオチューブやストアに200μlの。
3. それに応じてウシ血漿（200 U / ml）および滅菌フィルター（0.2μmの孔のフィルター）からトロンビンを再構成。小分けcrytに200μlの-20℃でotubesと店舗。
4. 30の文化のための栄養培地100mlを（材料のリストを参照）を作製。

3.脊髄組織の解剖

注：胚の数に応じて、手順の収率は約25のために、脊髄切片 - 35共培養し、無菌条件下で層流フードの内部に用意されています。

1. 筋肉内注射によって母動物にペントバルビタール（0.4ミリリットル）の致死量を適用します。ペダル引っ込め反射をチェックすることにより、深い麻酔を確認してください。断頭により帝王切開と犠牲によってE14ラット胚を提供します。
2. 滅菌、チルド、洗浄溶液で満たされたペトリ皿に胚のボディを転送します。
3. 一つの完全な横断後肢上記メスで切断し、前肢上記の別のものを実行し、本体から手足を削除します。次に、脊髄Coを含むバック片から独立した内臓に前頭面で切断してくださいRD。
4. スライスは、ディスク装着に一度脊髄一つを含むバックピースを転送し、225の厚さで切断 - 組織チョッパーで250μmです。刻んだ組織に洗浄溶液の液滴を入れて、35ミリメートル滅菌、チルド、洗浄溶液で満たされたX 10ミリメートルペトリ皿にスパチュラでスライスを転送します。
5. 個別に各スライスについて、離れて残りの組織から脊髄を解剖。添付の後根神経節を残します。
6. スライスは、4℃で1時間休ませてください。

4.多国間環境協定の脊髄組織のスライスのマウント

1. インキュベーター内で無菌栄養培地をウォームアップ（37℃、酸素化のために軽く緩め蓋）。
2. 焦点の電極アレイで立体顕微鏡下でペトリ皿で​​室温、ゴム被覆ヒントを滅菌ピンセットで位置MEA。 、きれいなダストフリー、および無菌の電極アレイ上に鶏のプラズマ6μlの滴を中央に配置します。小さなへらを使用して、慎重にスライドさせ腹側がプラズマ液滴に互いに対向有する2つの脊髄切片。スパチュラで電極に触れないでください。
3. 鶏のプラズマ液滴の周りにトロンビンの8μLを追加します。トロンビンピペットチップを使用して、慎重に2つのスライスを中心に鶏プラズマ/トロンビン混合物を混合して広がりました。ここでも、直接脆い電極アレイを触れないでください。ただ、凝固する前に、余分な鶏のプラズマ/トロンビンを吸引。
4. MEA /文化アセンブリは、37℃のインキュベーター内部加湿チャンバー内で約1時間座っている間、高湿度を維持するためにペトリ皿に蓋を。
5. 慎重にペトリ皿に蓋をし、約30分間インキュベーターに戻し、培養室に栄養培地10μlを添加します。
6. 、ローラーチューブに無菌の、ゴムで覆われたヒントを各MEA /文化アセンブリを配置栄養培地の3ミリリットルを追加し、しっかりふたを閉めます。 5％のCOでインキュベーターで2回転数 - 1で回転するローラードラムにローラーチューブを置き
7. in vitroで 7日後に栄養培地の半分を変更します（DIV）、その後1 -週2回。

5.機械病変

1. 焦点の組織と実体顕微鏡下で栄養培地なしペトリ皿にローラーチューブと場所のうち、滅菌、ゴムで覆われたヒントをMEA /文化アセンブリを取ります。視覚的に2つのスライスが融合していることを確認します。
2. MEA上のゴム被覆ヒントをピンセットを配置することによって安定したMEA /文化アセンブリを持ちます。
3. 組織切片に近いMEAの溝に手術用メスの刃を配置します。むしろ水平にメスを持ちます。
4. メスアップハンドルが、手術用メスの刃がベースからブレード「ロール」は先端と、それによって溝をカバーする組織を切断するようにMEAの溝に滞在させ持ち上げます。
5. 25 G針先端necess場合と重度の残留組織の接続進。溝内の領域でのみ動作し、入札の縁に手を触れないでください。
6. ローラーチューブに戻し、MEA /文化アセンブリを配置します。培養に新鮮な栄養培地の3ミリリットルを提供し、インキュベーター内でローラードラムに戻し、それらを配置します。

自発的活動の6電気生理学的記録

1. DIVの選択された番号の後に2脊髄スライス間の機能的再生を調べるために、（材料のリストを参照）、顕微鏡で記録チャンバーにMEA /文化アセンブリをマウントし、約500μlの細胞外溶液を適用します。
2. システムを安定させるために最初の記録の前に10分を待ちます。
3. RTでMEAの各アクティビティ検出電極からの約10分間の録音の基本的な自発的活動の2倍。
4. 安定細胞外の条件を確実にするために、すべての記録セッションの後に細胞外溶液を交換します。
5. ネットワークを脱抑制をきたすために、細胞外溶液の共同適用ストリキニーネ（1μM）とgabazine（10μm）をntaining。録音を開始する前に、少なくとも2分間待ちます。

7.データ解析

注：細胞外に記録された活動電位の検出のために各電極の標準偏差とその後の弁別に基づいて検出するために使用します。この手順はTscherter ら ³に詳細に記載されています。

1. 標準的な手順^3（ 図1F）に応じて、ラスタープロットの各電極の検出ニューロンの活動を表示します。
2. 決定し、表示する10ミリ秒のスライディングウィンドウ内応じてチャンネルのイベント数を合計することにより、各スライスの合計ネットワークアクティビティは、1ミリ秒のステップだけシフトした （図1GおよびTscherter ら³参照）。
3. 各スライスの個々のバースト（いくつかの電極の上に表示されるアクティビティのクラスタ）で検出します。したがって、、対応するネットワーク全体の活動の最小のピーク活性のしきい値を設定し、各バーストの開始とバースト終了を定義します。例えば、適切な閾値は、平均バースト振幅の25％であり、バースト開始は時の時間ウィンドウ内の最後のイベントであることによって、少なくとも5ミリ秒、バースト終了の時間ウィンドウ内の最初のイベントであることによって定義することができます。少なくとも25ミリ秒（Heidemann ら ^{10を参照）。}
4. 機能的再生を定量化するために2つのスライス間の同期バーストの割合を計算します。これを行うには、1スライス内のバーストおよび他のスライスで次のバーストとの間の待ち時間を計算します。
   注：バースト対は待ち時間、平均バースト長よりも小さい場合、「同期化」と呼ばれます。特に、多くのアクティビティとの共培養では、可能性は両側が偶然に選ばれた待ち時間ウィンドウでバーストを開始することが存在します。この事実は、SYの割合の定量化に考慮しなければなりませんnchronizedバースト。計算の詳細についてはHeidemann ら ^{10を参照されたいです} 。

8.文化の固定および免疫組織化学

1. 洗浄またはインキュベーションを含むすべての手順については、組織を通って溶液の適切な拡散を確保するために、傾斜テーブルの上に培養液を入れてください。
2. 記録セッションが終了した直後シャーレ（X 10ミリメートル35ミリメートル）でそれを入れて、細胞外溶液の約2mlを追加し、セットアップのうち、MEA /文化アセンブリを取ります。
3. in vitroでの時間の間に形成している周囲の細胞層からのスライスを分離するために、スライス10μlのピペットチップと円がかかります。文化を傷つけないように注意してください。なお、この工程を省略することも可能であるが、後に埋め込むことは、それが実行されたときに容易です。
4. 薄い非金属注射針を使用して外solutiで満たされた1mlシリンジと組み合わせて（素材リストを参照）優しく、MEAから文化を爆破します。
5. パスツールピペットの先端を取り外し、slivered端にゴム球をフィット。固定液（リン酸緩衝生理食塩水（PBS、0.1 M）を用いて4％パラホルムアルデヒド）に文化を転送するためにバックエンドを使用します。それはあまりにも小さく、文化が折り畳まれ、おそらく損傷を受けることになるので、転送のためにパスツールピペットの標準チップを使用しないでください。 4℃で2時間 - 1の修正。蒸留水でMEAをすすぎ、指先で組織残留物を除去するが、爪で傷つけたりしません。 4℃の蒸留水に保管したMEA
6. 少なくとも10分ごとに、PBS中の培養3回洗浄します。 4℃でPBS中に保存したり、直接染色手順で開始します。
7. 溶液（5％ヤギ血清、1％ウシ血清アルブミン、PBS中の0.3％の界面活性剤）をブロック内に少なくとも90分間培養物をインキュベートします。
8. ブロッキング溶液で希釈した一次抗体を加え、4℃で3泊インキュベートします。
9. lにおけるPBS中の洗浄3倍東30分各。
10. 室温で2時間、PBSで希釈した二次抗体を追加します。
11. 少なくとも30分ごとに、PBS中で洗浄3倍。
12. オブジェクトスライドで除去先端でパスツールピペットでスライスを転送します。過剰のPBSを削除して、メディアをマウントして埋め込みます。

E14ラット胚の脊髄に由来する共培養物の機能回復の可能性を調べるために、病変は、8〜28 DIVの時間ウィンドウ内で行われました。 2〜3週間後に、自発的なニューロンの活動は、多国間環境協定（ 図1 C＆D）で記録しました。細胞外に記録された活動電位は、個々の電極（ 図1E）のためにオフラインで同定されました。ネットワークアクティビティプロットが続くラスタプロットが生成されたこれらのデータ（ 図1F）、から側（ 図1G）ごとに別々に総活性を可視化しました。各スライスでは自発的活動は通常バーストで構成されています。スライスが機能的に接続されている場合は、これらのバーストは1スライスから他に伝播することができます。したがって、2つのスライスの間の同期バーストの量を定量的に機能的な再生を測定するために、計算されました。どのように変換intの詳細について異なるプロットoを行い、同期活動の割合を計算するための式は導出したか、Heidemann ら 10を参照してくださいされています。

全ての実験において、活動はまず、標準的な条件下で記録しました。第2のステップでは、シナプスの阻害は、細胞外浴溶液にストリキニーネ（1μM）とgabazine（10μM）を加えることによりブロックしました。この脱抑制は、バーストの定義、したがって、スライス間のバースト同期の決意を容易に延長されたバーストとバースト間隔でより規則的な活動パターン、通常つながります。

若い年齢で病変文化-後期（> 19 DIV）で病変文化が（ 図2のAを再生する能力の明らかな低下を示した（図7〜図9 DIV）は、2〜3週間後に病変同期活動の高い量を表示しました- F）。これらの知見は、その再生能力を示します脊髄切片培養において機能的接続の培養で3週間以内に、 インビボでのさらなる展開状態を示す、低レベルのために、 インビボでの胚の状態を表す、ハイレベルから低下します。

接続にはどのようなものは、実際には2つのスライス間のバースト同期に関与していますか？脊髄固有の接続に加えて、繊維は、運動ニューロンまたは後根神経節ニューロンから発生する可能性があります。これは、後根神経節ニューロンは、脊髄の切片10との間の機能的結合に関連しないことが以前に示されています。しかし、運動ニューロンの関与は可能性が残りました。運動ニューロンのニコチン性受容体13を介して脊髄ニューロンへのコリン作動性の接続を形成することが知られているので、脊髄の共培養物の活性は8 DIV、培養物は高度に同期活動10を示し 、時間、およびニコチンアンタゴニストMecamで記録しましたイルアミン（MEC、100μM）は、細胞外浴溶液に添加しました。 2つのスライスとの間の接続における運動ニューロンの参加は、同期活動の減少割合をもたらすであろう。しかし、これはそうではなかった（MEC：91.0±4.5％、N = 7;対照：93.6±4.6％、N = 7、P> 0.05、ウィルコクソンのマッチドペア検定）。これらの結果は、コリン作動性シナプスは、スライス間の機能の接続には寄与しないことを示唆しています。運動ニューロンはまた、CNS 11,15内のシナプスでのグルタミン酸を放出することが示されているので、これらの実験は、完全にそれらの関与を排除するものではありません。

運動ニューロンを同定するために、SMI-32と非リン酸化神経フィラメントHに対する免疫組織化学的染色を行いました。彼らは、スライス（ 図3A）に分布し、運動ニューロンのための代表的ないくつかのラベルに大きな細胞体を、明らかにしました。 SMI-32抗体はmotoneuroの細胞体を標識することが報告されていますNS 12と、この発見を使用しても文化13にも当てはまります。また、B-IIIチューブリンまたはのNeuNに対する一般的な神経細胞体の染色、 例えば、同様にグリア細胞体、 例えば 、GFAP抗体によるアストロサイトは、他の報告と一致していると、これらの細胞型の形態学的記述と一致しています（ 図3のB - D）。それにもかかわらず、SMI-32抗体を用いた軸索の標識は（ 図3E）についてです。予想に反し、この抗体を使用した場合、繊維の巨大なネットワークが表示され、それがリン酸化された神経フィラメントH（ 図3F）をラベルのSMI-31染色のようになります。この結果の一つの解釈は、ニューロフィラメントのリン酸化/脱リン酸化の発生調節がin vivoでの状況と比較して使用した培養物のようにタイトではないことが考えられます。同じ軸索におけるリン酸化および非リン酸化神経フィラメントの混合発生が正しくありませんでしたこの知見AIN。別の可能性は、SMI-32ラベルされた軸索は投射ニューロンから発生するということです。ツァンや同僚16は、 例えばは、クラークの列と中間外側セル列ニューロンは運動ニューロン以外に、SMI-32で染色されることが示されています。このようなニューロンの発音神経突起の増殖はまた、SMI-32陽性線維の豊かさを説明することができます。

図1.ディスプレイと自発的活動の分析。（A）MEAのダイアグラム。プラチナ覆われた電極は、黒、赤、透明ワイヤと黄色で、MEAの中央にある溝に描かれています。 （B）、MEAの中心部に位置する電極アレイのクローズアップ。図は親切に博士M. Heuschkelによって提供されています。 （C）8 DIV古いculturの明視野像E。スライスが成長し、互いに対向する辺に沿って融合しています。黄色のバーは、MEAの電極 - 絶縁フリー溝を表します。実験のスケールバー= 400μmの（D）のタイムライン。 E14ラット胚の二つの脊髄切片を、MEAの上に隣同士に配置されています。数日以内に、スライスは、互いに対向する辺に沿って成長し、ヒューズ。 8の時間枠で - 28 DIV、完全な病変が融合部位を介して実行されます。 2〜3週間後に自発的な活動が記録され、培養物は、免疫組織化学的染色のために固定されています。 （E）23 DIV古い文化の各個別電極の自発的活動の痕跡。明確に可視化するために、すべての第2のトレースのみが示されています。オレンジ色のトレースは、左側から右側のスライスから記録された活動、青色トレースを示しています。バーストのほとんどは、両者の間に同期されます。左スライスpのみで発生するバーストに矢印ポイントartially右スライスに伝播。右のスライスでの活動は、しかし応じ側の平均最大ピーク活性の少なくとも25％の選択されたしきい値に達しなかったため、バーストとして検出されません。右の倍率が最後に同期バーストのペアを示しています。 （E）に示す活動の（F）ラスタープロット。 （E）に示す活動の定義されたバースト（ベースライン下のバー）と（G）ネットワークアクティビティプロット。 Heidemann らから適応。10。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2.わけではありません同期活動に対する同期。（A、B）の文化のラスタープロットがlesione若い年齢でD（7時- 9 DIV）、標準的な条件（A）と脱抑制下（B）の下で同期活動を示します。 （C、D）の標準的な条件（C）および脱抑制下（D）下にない同期活動を示す（> 19 DIVで）昔の年齢で病変の文化、のラスタプロット。同期活動の（E、F）の平均割合は、標準的な条件（E）および脱抑制下（F）の下で記録された各個々の病変日のためにプロットしました。 3週間病変の日の後 - 記録は2を撮影しました。 Heidemann らから適応。10。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

Figure 3.免疫組織化学的キャラクタリゼーション。SMI-32との運動神経細胞体の（A）染色。 （B）は、成熟神経細胞体とそのプロセスのβ-IIIチューブリンラベル。 （C）GFAPとアストロサイトの同定。 （D）のNeuNと成熟した神経細胞体の標識。 SMI-31で識別される非リン酸化神経フィラメントH.（F）リン酸化ニューロフィラメントHの（E）SMI-32染色。 Heidemann らから適応。10。両方、SMI-31およびSMI-32で、繊維の大規模なネットワークは、培養で表示されていることに注意してください。バーAD = 20ミクロン、H＆F =100μmである。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

著者らは開示するものは何もない。