蝸牛細胞の変性を誘導するための迅速かつ信頼性の高いテクニック：耳毒性剤送達のためのマウスラウンドウィンドウアプローチ

サマリー

動物モデルの蝸牛に耳毒性物質を導入するための様々な方法が存在します。提示されているのは、丸い窓のニッチに耳毒性物質を送達するための外科的プロトコルです。この手順は信頼性が高く、標的を絞った蝸牛内病変を作成し、マイクロアーキテクチャへの機械的損傷を回避します。蝸牛の自己修復・再生の検討が可能です。

要約

研究者は、哺乳類の聴覚系を研究するために、さまざまな動物モデルと調査技術を利用してきました。蝸牛とそれに関連する神経経路に関する基礎研究の多くは、モデル蝸牛をさまざまな耳毒性物質に曝露することを伴います。これにより、研究者は蝸牛構造への標的損傷の影響、場合によってはそれらの構造の自己修復または再生を研究することができます。蝸牛への耳毒性物質の送達にはさまざまな技術が存在します。特定の技術を選択する際、研究者は、不注意による全身毒性の誘発、外科的処置自体によって生じる蝸牛損傷の量、望ましい病変の種類、動物の生存率、および結果の再現性/信頼性など、多くの要因を考慮する必要があります。現在確立されている技術には、非経口注射、腹腔内注射、鼓膜経注射、内リンパ嚢注射、およびリンパ周囲灌流を伴う蝸牛瘻造設術が含まれます。これらの各方法は成功裏に利用されており、文献で詳しく説明されています。しかし、それぞれにさまざまな欠点があります。ここでは、耳毒性物質を丸い窓のニッチに直接局所適用する技術を紹介します。この技術は、内耳の構造に非侵襲的であり、確実に標的を絞った病変の迅速な発症を引き起こし、全身毒性を回避し、動物内制御(対側耳)を可能にします。このアプローチから得られた結果は、聴覚の病態生理学、蝸牛細胞の変性、および急性損傷に対する反応性再生能力の理解を深めるのに役立ちました。今後の研究では、この方法を用いて、難聴と闘うための遺伝子治療や幹細胞移植を含む介入研究を実施する可能性があります。

概要

調べでは、聴覚系の正常な機能だけでなく、難聴の病態生理学を研究するための動物モデルの広い配列を使用しています。これらのモデルは、様々な病理学的過程に対する介入研究を実施するために非常に有用であり、ヒト対象における翻訳アプリケーションのための基盤となります。蝸牛とそれに関連する聴覚経路に関わるほとんどの研究では、損傷や混乱のある程度は、システムに導入されなければなりません。多くの場合、被害は意図的に研究者が正常な機能上の病変だけでなく、そこから回復するための蝸牛能力の効果を研究することができ、特定の病変を作成することを目的としています。損傷を導入するための特定の動物モデルおよび/または技法（複数可）を選択する場合、要素の数は、可能な限り最高の結果を達成するために考慮しなければなりません。技術の直接的および間接的な影響がかもしれないが、様々な動物モデルは、介入に対して異なる応答することができます望ましい結果に完全に有害。ほとんどの場合、理想的な内耳損傷プロトコルは、全身毒性を回避し、迅速かつ確実に損傷を生じさせる、正確で一貫性のある病変を作成し、かつ、機能的な細胞及び分子の変化のさらなる研究を可能にするために存続することになります。理想的には、これらの方法も可能な限り繊細なマイクロアーキテクチャと蝸牛の電気化学的勾配を維持することになります。

現在までに、研究者らは、内耳損傷を誘導するために多くの技術を確立することに成功しました。これらのほとんどは、いずれかの全身または外科的アプローチを経て耳毒性薬に蝸牛をさらす伴います。テクニックは、非経口注射、腹腔内注射、経鼓膜注射、内リンパ嚢の注入、および外リンパ灌流と蝸牛が含まれています。これらの技術は、フロセミド、ゲンタマイシン、ウアバイン、およびヘプタノールなどの耳毒性剤、種々のを導入するために使用されてきた^。1-5特定の蝸牛病変の作成に成功したが、上記の技術にも制限を認めています。全身注射は動物に対して非常に毒性であることができ、意図しない蝸牛侮辱と一貫性のない結果に関連付けられてもよいです。後者の欠点はまた、トランス鼓膜注射と関連しています。そのような蝸牛及び外リンパ灌流などの技術は、迅速かつ信頼性の高い病変を誘発することができる一方で、内耳の構造と機能に直接侵襲的です。外科的アプローチの多くは、技術的難易度の高いに関連付けられており、このようなマイクロポンプの注入器のような動物で異物を残す必要があります^。2-4,6-8単一の技術は欠点のないではない、と研究者らは、選択する必要があります彼らの実験のニーズに合わせて慎重にする方法。ここでは、詳細には、成体マウスにおける耳毒性薬剤の局所送達のために、丸い窓の隙間（RWN）アプリケーション技術を説明します。

Fiの最初以来^9。鳥類モデルにおける感覚有毛細胞の変性にゲンタマイシンの影響を研究しながら、関連する毒性を回避しながら、この技術は、全身ゲンタマイシンアプリケーションよりも著しく信頼性病変を産生することができることが見出された1998年Husmannら、A我々の研究室を含む他の研究者の数は、大成功にこの技術を利用してきました。 2004年には、ハイトら。マウスモデルに適応し、ゲンタマイシンの様々な濃度に浸した吸収性ゼラチンスポンジでRWNを充填することにより、病変の大きさを制御する能力の増強を説明^。10パルムグレンら、2010年には、ベータ-ブンガロトキシンの耳毒性の効果を研究し、強力台湾の毒の要素が成体ラットのRWNにその水性形態を適用することにより、クレートをバンド¹¹に加えて、我々の研究室から以前の研究の数は、フロセミドの耳毒性の影響を研究するための円窓のアプローチを利用していますE、ウアバイン、およびヘプタノール。これらの研究の^5,6,12-15結果が蝸牛流体と健聴のイオン恒常性の重要性を実証した、らせん状神経節と蝸牛外側壁における細胞増殖能力を発見し、私たちの理解をさらに促進年齢関連の聴力損失。

次のアプローチは、外科的に耳介後部切開や骨鼓膜のブラの部分unroofing経由で中耳にアクセスすることが含まれます。これは、選択された耳毒性剤を直接適用することができるRWN、膜の優れた露光が可能になります。液剤その後RWNのカップ状の中空内のプール（またはゆっくりRWNに詰め飽和吸収性ゼラチンスポンジ担体から排出）とは、蝸牛前庭の外リンパ腔への円窓膜を介して拡散します。直接的な蝸牛は、このアプローチでは行われません。この技術の利点は、内耳のマイクロアーキテクチャの保存、回避が含まれます全身毒性の内、動物管理の耳、効果の迅速な開始、特定の蝸牛細胞型において選択的変性の手当（ 例えば 、I型ヘプタノールの処理によって誘導さウアバイン露出と蝸牛II型線維細胞と神経節ニューロンスパイラル）かつ再現性/信頼性の高い結果。この技術は、ラット、モルモットおよびスナネズミを含む他のげっ歯類、の間にいくつかの変更にも適用することができます。欠点は、急な技術的な学習曲線と時間で一点に制限され、耳毒性侮辱の相対的な制限があります。

プロトコル

動物研究のすべての側面は、適切な制度的動物実験委員会のガイドラインに従って行いました。ここで説明するすべての脊椎動物の動物実験手順は、サウスカロライナ州の（MUSC）施設内動物管理使用委員会（IACUC）の医科大学のガイドラインの下で承認されました。

1.モデル選択

1. 使用直前まで、制度的なプロトコルごとに日常的介護を備えた低ノイズビバリウムでの動物モデルを維持します。動物研究施設（性ARF）で、振動の安定性を維持、ノイズ減衰、昼間の照明、準備スペース、表面仕上げ、シール及びコーキング、およびNIHの基準を満たす換気。
   注：低ノイズビバリウムの性ARFやメンテナンスのための国立衛生研究所（NIH）のガイドラインがに見直されることがあります。 http://www.orf.od.nih.gov/PoliciesAndGuidelines/BiomedicalandAnimalResearchFacilitiesDesignPoliciesandGuidelines/
2. 全ての実験について、実験の耳のように右耳を使用しています。左耳の内動物管理として機能し、外科的に変更されません。
3. 途中または外耳感染の兆候を事前に動作モデル動物を検査します。潜在的な徴候は、動物の耳からの流体の排液または膿、炎症耳介組織、及び/又は嗜眠を含むことができます。これは珍しいですが、注意している場合、さらに手術を回避し、適切に動物を扱います。

2.術前手続き

1. ケタミンの腹腔内（IP）注射（100mg / kg腹腔内）およびキシラジン（20 mgの/ kgのIP）を介して手術前に、動物を30分と任意の周術期手順を麻酔。正つま先ピンチ反射によって判断されるようにケタミン（25 mgの/ kgのIP）およびキシラジン（5mg / kg、IP）の低用量で、必要に応じて麻酔を補足。用量における年齢適切な調整を用いたマウスのための制度許可するプロトコルに準拠した投与を決定します。
2. フル秒をチェックしますモデルのedation。通常の呼吸速度、（マウスで）立ち直り反射の欠如、およびペダルと眼瞼（つま先ピンチ）反射の欠如によってマークされ説明されたプロトコルの全体のための麻酔のステージ3面を確認してください。麻酔のこのレベルで動物を維持します。これは、手術中に痛みや術中動き、出血、および間質液の漏れを最小限に抑えるために最も重要です。
3. 閉ループ加熱パッドを用いて37.5℃で、動物の体温を維持します。
4. ブプレノルフィンの皮下注射を介して鎮痛を管理します。任意の外科的な不快感を最小限にするために鎮痛としてブプレノルフィン（手術前は0.1mg / kgのSQ回30分）を提供します。基本投与および制度承認されたプロトコル上で選択したモデルに適切な代替。良い無菌操作が実施されている場合は抗生物質の使用は必要ありません。痛みや苦痛の徴候がある場合、動物は、術後鎮痛を受けます。
5. pH値を実行します術前ysiologicテスト。動物の犠牲に聴性脳幹反応（ABR）検査および/または手術前と直前の両方の歪み製品光音響放射検査（DPOAE）を実行すると、マウスの聴覚上の選択された耳毒性剤の効果のための客観的な測定として機能します。

3.外科の準備と配置

1. 手術前に、制度の規格ごとにすべての機器を滅菌します。手順の間に不要な努力と動きを避けるために、一貫性のある滅菌し、組織的に手術器具やフィールドを準備します。典型的な機器は、鋭い解剖はさみ、宝石商のヒント、耳科ピック、耳科キューレット、およびバイポーラ電気焼灼装置（ 図1）を有する金属鉗子のいくつかのペアを含んでいる必要がありました。
2. 準備し、0.7×1で1.25×で〜（ワイプの小さな三角形の部分を切断することにより、事前にlabwipesから作られた紙の芯を滅菌します。75）及び（〜1.25）に一方の手の親指と人差し指の間でしっかりとそれをねじります。しっかりツイスト、非常に薄い芯の作成手順の成功に最も重要です。手術前に15〜20ウィック（ 図2）の合計を準備します。
3. すぐに制御された方法で鼓室胞の骨を穿孔するために歯科用ドリルを使用してください。 1または2 mmのテーパ状の先端を有するベルト式歯科用ハンドドリルを使用することが好ましいです。手術顕微鏡は、プロトコルを完了するために必要です。 （ステップ4.7を参照してください）
4. 28 G 1/2 "針を用いて1mlのツベルクリン注射器に選択した耳毒性剤を含む水性溶液0.2mlを予め描きます。通常、薬剤の1滴（〜10μl）を完全にマウスRWNを満たすのに十分です。鋭いベベルチップにより、基礎となる構造体への損傷を防止しながら、金属は、鈍い先端の注射針は、薬剤の送達を容易にします。気泡が不注意RWNを満たし、および/または適切防ぐことができますように、注射器内の空気を排出ラウンドウィンドウ自体への薬剤の適用。
5. 電気グルーミングバリカンを使用して、ポスト耳介皮膚から毛を削除します。肩帯の尾側に吻方耳介-頭部しわから伸びるゾーンに毛皮を削除します。横方向に下顎角の背側、矢状正中線から脱毛を拡張します。適切な毛皮の除去は、クリーンでクリアな手術野を維持するために非常に重要です。静かに意図された手術部位からの切り抜きを磨きます。
6. 制度のプロトコルごとに準備された領域の皮膚を滅菌します。 2分間円形に局所的にエタノールと交互にベタジン（ポビドン/ヨウ素）を適用します。他の薬剤には、機関のガイドラインに従って置換することができます。
7. 手順の間に一定の身体の位置を維持するために平らな面に動物を置きます。 36-38℃で、動物の体温を維持するために、手順の間に身体の温度を制御するために、プラットフォームに身体下に置かれた小さな加熱パッドを使用します。 OVEしないでくださいこれは重篤な皮膚の損傷および/または早期の安楽死に軽度につながる可能性のような動物をrheat。
   1. バイトブロック/ヘッドホルダ装置を経由して、動物の頭部を固定します。長軸に沿って、5mmの間隔でそれを介して掘削2〜4ミリメートルの直径の穴に真鍮から機械加工2cmのバイトブロックによって0.5cmに活用。この治具の周りに動物の口を開いて、動物の大きさに応じて、穴の一つに、上部中切歯にフィット。静かな場所でそれを保持するために、動物の鼻の背側（ 図3）上に小さなクランプを締めます。
   2. バイトブロック/ヘッドホルダを強固にU字状の関節アーム（ 図3）の中央部に接続されていることを確認してください。 「U」の左腕に1センチメートル広い棒を固定し、左側のヘッドレストとしてロッドを使用します（右側が常に作動側です）。
   3. 一度しっかりとヘッドホルダに固定、左側臥位にマウスを回転させます。ボディcarefuを置きLLY平らな操作面上のそれが手順を通して安定であり、頸椎に過度のねじり応力を避けることができますようにします。
8. 4倍、10倍が可能な手術用顕微鏡を置き、手術野の上に20倍の倍率。これは、以下に説明両手の外科プロトコルに最適ですとして顕微鏡はハンズフリーでの地位を維持することができることを確認します。
9. 小血管や組織の解剖の焼灼アシストするためにすぐに利用可能な位置に微傾い宝石商のハンドピースとバイポーラ対応焼灼ユニットを配置します。これはまた、重い出血に遭遇しなければならない必要があるかもしれません。

4.外科的アプローチ

1. 顕微鏡の倍率の下で1〜1.5センチ耳介後部切開、auriculocephalicしわに約6〜8ミリメートルの尾を作成するために、鋭いハサミやメスの刃を使用しています。背側正中線から成体マウスでは、切開横方向に下顎の角度に近い点に十分です。根底にある血管構造を維持するために深く切削慎重を避けます。
2. 可変厚さのものとすることができる皮下脂肪層を介して慎重に鈍的切開を実施します。改善された露光に必要に応じて脂肪を安全に除去することができます。外頸静脈は、この領域を横断し、この構造体への損傷は失血と手術野の洪水の大量の原因となり腹内側方向に解剖するときは注意してください。吸収性ゼラチンスポンジおよび/または綿ペレットで任意の過度の出血を制御します。重い出血のため、バイポーラ焼灼を使用してください。
3. 脂肪層が適切に分割されると、子宮頸部筋肉を公開します。吻方下顎の角度を覆う中央にさらさ手術領域内cleidomastoideusの大きな筋肉体、腹側外頸静脈、および耳下腺組織を含む重要な構造に注意してください。重要なランドマークは、小さな神経brancです耳介（ 図4）に向かって吻側延長するcleidomastoideusの後部/背側縁を包み込む（脳神経XIの）時間。
4. 穏やかに後方/背側方向にcleidomastoideus筋肉体を後退させる（ 図4、図5）。優しく筋肉の体を包む透明筋膜を分けます。同様に、静かに反対（前方/腹側）方向（ 図5）における耳下腺と外頸静脈を撤回。
5. cleidomastoideus筋本体の良い後退すると、鼓膜ブラの骨膜の光沢のあるドームは、ビュー（ 図6）に来ます。ブラの尾側の側面には、より深い子宮頸部筋肉、sternomastoideusの挿入は、ビュー（ 図6）に来ます。背と水疱ドームの吻側側面に見えるようになる顔面神経を保持します。 shaft--使い捨てシリコーンに埋め込まれた自己保持リトラクター（滅菌チタンを配置掘削前に）貼り付けます。
6. 両手技術では、静かに下にある骨を露出するようにバイポーラジアテルミーと水疱の骨膜を分割。鉗子や耳科キューレットを使用して、静かに広く水疱ドームを露出する周方向に骨膜を高めるとプッシュ。
   注：ステップ4.6中耳空間の外科的なビューを最大化することが重要です。掘削後の水疱腔に出血および/または間質液の漏れを回避するために細心の、穏やかな軟組織の取り扱いを利用します。
7. 適切に露出した水疱ドームの際に、ブラの吻側側面を横切って延びるドームの尾マージン（鼓膜を表す）目に見えて不透明なラインとの間に、歯科手術用ドリルで水疱の骨を介して2mmのパイロット穴を開けます （図7）。このようあぶみ骨動脈などの根本的な構造を保つためにのみ骨をドリルスルーするように注意してください。 <（水疱の骨の未屋根を容易にするために、近くの第2のパイロット穴を開け強い>図7）。
8. 宝石商の先端ピンセットを使用して、背側及び尾側方向（ 図8）に水疱骨をキャップを取ります。高倍率で断片的に骨を削除します。この動脈から出血する手順を損なう可能性があるとして、水疱キャップの直下にあるあぶみ骨動脈を、穴を開けたりしないでください。まだ丸い窓の隙間（ 図8）に優れた可視化とアクセスを可能にしながら、中耳への過度の流体侵入を防止するために除去骨の量を最小限に抑えます。

耳毒性剤の5ラウンドウィンドウアプリケーション

1. ビューに真正面RWNをもたらすためにヘッドホルダに微妙な回転調整を行います。 RWNは、一般的に中耳空間の背と尾側の側面に位置し、耳のカプセル骨のカップ状のくぼみとして表示されます。ほとんどの場合、あぶみ骨動脈がこの1〜2ミリの腹側/吻側を実行します。 RWNは時々TUCすることができます水疱ドームの急性角度の下で末梢ヒツジシラミバエ。このような場合には、動物の頭の注意深い位置決めが最も重要です。
   1. 乾燥骨が可視化されるまで、術前に用意した紙の芯を使用して、中耳とRWNにすべての可視流体を除去。
      注：耳毒性薬剤の約10μL（1滴）をRWNに適用されるように、これは、プロトコル全体の最も重要なステップで簡単に流体により希釈することができます。
2. 最大倍率の下では、それを完全に満たす、RWNに直接耳毒性薬剤の1滴（〜10μl）を適用するには1ミリリットルツベルクリン注射器に細かい口径の針を使用しています。あぶみ骨動脈を破壊し、ニッチが適切に充填されていることを指標として鈍いと曇った流体メニスカスのドライニッチの基部に小さな光反射の交換のために密接に観察しないように注意してください。
   1. エージェントは約10分の露光時間のためにRWN内休息できるようにします。この後、完全ワットエージェントをICKと同じエージェントの新しいアプリケーションと交換してください。エージェントの仕様に応じてアプリケーションの繰り返しを決定します。この手順の総露光時間は、典型的には30〜60分の範囲です。
   2. 手順の終了時に、完全にエージェント最後に1回逃がすとRWNに新鮮な薬剤を適用します。キャップされていない水疱の​​ままにして、手術部位の上に柔らかい組織を閉じるために鉗子を使用しています。
3. 4-0、非吸収性モノフィラメント縫合糸で皮膚のレベルで手術部位をシール。回復ケージ/駅で動物を置きます。定期的に操作以下の動物の臨床状態を監視します。ストレスを最小限に抑えるために、柔らかい食品と柔らかい寝具や補充を備えたハウジングを含む適切な環境条件下で動物を維持します。制度的IACUCプロトコルに従って将来の手順や術後の条件を決定します。
4. 楽器を殺菌するための制度IACUCプロトコルを使用します次の動物の使用前の。機器の使用との間の適切な冷却時間を可能にします。

6.術後プロシージャと蝸牛組織の収穫

1. ステップ2.5で説明したように、目的のポイントや屠殺前に、術後聴力の生理学的検査を行います。実験目的に応じて術後の手順を実行します。任意の術後日に動物を生け贄に捧げます。
2. IP注射を介した全身麻酔時には、制度的IACUCプロトコルごとに必要に応じて、動物を生け贄に捧げます。鋭いハサミを使用して、後頭部にちょうど尾動物を首を切ります。はっきり背側と腹側正中線に沿ってハサミで頭蓋を開き、広く普及。静かに側頭骨を露出するために、脳組織をかき出します。
   注意：蝸牛における露光後の変化を調査するための手順の数は、この時点から分岐することができますし、議論の項で述べたことになります。最もrelevan調査方法を決定します実験目的にトン。蝸牛が区画された後、電子顕微鏡が計画されている場合は、組織を事前に修正するために心臓カテーテルを使用しています。これは、この議論の範囲を超えて、他の場所の深さでカバーされている^。13
3. ハサミで頭蓋底から頭骨を切り、すぐに固定液に入れました。 RTで1.5時間、4％パラホルムアルデヒド中で直接骨を浸します。長い期間は、後の工程で、組織学的分析の結果を制限することができるように、固定時間を監視します。脱灰を、1mMエチレンジアミン四酢酸（EDTA）で浸水を介した時間の可変期間の骨を解剖しました。

結果

スティーブンスらは、上記のプロトコルを利用することにより、最近の研究では、男女の大人のCBA / CAJマウスをヘプタノール、丸窓拡散を介して公開された^。15ヘプタノールは、細胞を標的と、回復可能な損傷を生成することが知られているギャップジャンクション未カプラであります蝸牛側壁。研究の目的は、破損した要素の手術後の再生の研究を可能にする、対象と蝸牛損傷のための信頼性の高いモデルを作成することでした。手術前と手術後の聴力閾値は、機能的なエンドポイントを務めました。顕微鏡および免疫組織化学的染色技術は、形態学的変化を研究するために使用されました。 ABR閾値の有意な増加は、ヘプタノール処理マウス（ 図9）で観察されました。代わりに、ヘプタノールの生理食塩水の配達で、偽手術を受けた対照動物は、任意のテスト周波数でかなりの閾値シフトを示さありませんでした。

内向き整流に対する免疫染色カリウムチャネル（キール）4.1は、蝸牛の構造体の損傷/回復を可視化するための間接的な方法を務めました。これは、治療群と対照耳の間の再現性の高い差異を示しました。全体的な染色強度が著しく、これらの分野にターゲットを絞ったダメージを大量に示す、1〜3日ヘプタノール曝露後に血管条（STV）以内とスパイラル靭帯（SLF）の線維細胞の間で減少しました。 II型およびIV型SLFsの領域（ 図10）とSTV（ 図11）でキール4.1染色強度の特定の減少がありました。破砕核の完全性および染色体凝縮/細胞アポトーシスの典型的なブレブの証拠はまた、これらの蝸牛の領域における核counterstains（ 図10）に見られました。キール4.1染色の空胞のゾーンは、7日目に顕著に解決され、14日後に完全に存在しませんでした。キール4.1染色強度は、STVの分野で定量した場合には、処理された耳はのinitiを実証しましたアル谷は7日ヘプタノール露出（ 図12）後の制御の強さに向かって戻って重要な変化（P <0.05）が続きます。

図1.インストゥルメントを設定。計装の術前のセットアップの描写を。すべての機器は、無菌の手術領域内に容易にアクセスできる必要があります。典型的な計装2鋭い解剖ハサミを含み、耳キュレット、湾曲したシャフト耳科ピックで2-3ストレートおよび/または湾曲した先端宝石商の鉗子（後ローゼンで置換をピック - 図示せず）と、細かい曲がった先端宝石商の鉗子で電気焼灼器ヘッドピース。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

2.外科用品図 。 RWN環境を維持するための追加供給します。紙芯形成のためlabwipeの切り欠きを滅菌（左）、密に形成された滅菌ラボワイプ（中央）から作られた紙の芯、4ミリの綿ペレット（右）は丸い窓の隙間に過剰な体液や血液の洪水を拭くために使用されます。 クリックしてくださいここで、この図の拡大版を表示します。

図3.動物のヘッドホルダ 。ヘッドホルダとバイトブロックを描いた画像。ブロックの穴が合うと上の中切歯を固定します。クランプを静かな場所に動物を保護するために背側鼻の上に締め付けられます。ヘッドホルダの使用が成功した外科的OUTCのために重要ですOME。理想的には、これは手順の間にブラの外科的ビューを最適化するために、動物の吻側-尾側軸を中心に回転することができるはずです。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図4. Cleidomastoideus mの。基本的な齧歯動物の子宮頸部筋肉の解剖学と外頸静脈との関連を示した。回路図のグラフ。 cleidomastoideus筋は、外科的アプローチ中に最も容易に識別筋肉です。筋肉ボディの後部/背側後退が続く包み込む筋膜のリリース鼓室胞（黒丸）に向かって外科的切開を指示します。 アルを表示するには、こちらをクリックしてくださいこの図のargerバージョン。

5.外科露光領域図 。皮膚および皮下脂肪層を通して切開後の露光を示しています。ノートの構造ランドマークはcleidomastoideus筋（A）、外頸静脈（B）を覆う脳神経XIの枝、露出耳下腺組織（C）が含まれます。脳神経XI枝は、多くの場合、小血管に関連していると進む前に分割する必要があります。右画像を左に動物の吻側-尾側軸に対応する。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図6.府の公開LLA。cleidomastoideus及び周囲の構造の後退後の鼓膜ブラの暴露。著名なランドマークはcleidomastoideus筋体（A）は後方/背側、顔面神経（B）、および鼓膜水疱骨膜（C）の光沢のあるドームを反映してあります。また、鼓膜水疱（アスタリスク）の左尾側面でsternomastoideus筋の挿入に注意してください。ブラの背側と吻側側面で顔面神経の存在は、ブラの真の識別のための重要なランドマークとなっています。右画像を左に動物の吻側-尾側軸に対応する。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図7.丸い窓の隙間を公開私 。イメージtympaを描いNIC胞は完全に上を覆う骨膜の解剖後に露出。パイロットホールは最高の水疱ドームと吻側面内（鼓膜を表す）水疱を可視化し、微妙な不透明ラインの尾側端部との間の中間点に配置されます。第二に、隣接するパイロット穴は、水疱骨の容易非屋根を容易にすることができます。深い掘削の回避は、基礎となるあぶみ骨動脈を傷つけないように注意する必要があります。画像の下部に暗い、金属物体が、チタンの軟組織リトラクターである。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図8.正円窓ニッチIIを公開 。丸い窓の隙間（矢印）とあぶみ骨動脈の露出でキャップされていない鼓膜胞（赤構造20倍の倍率で見た1〜2ミリメートル）はニッチに横。ニッチは、多くの場合、ドームの尾側面で耳のカプセルに水疱ドームによって形成された鋭角の下に隠れた位置に配置します。それはニッチの完全な可視化は、前耳毒性剤又はウィッキングのアプリケーションに達成されることが必須です。間質液/血液は大きな穴が作成された空洞をあふれさせる傾向があったとして、アンキャッピング時の過剰な骨の除去はまた避けるべきである。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図9.代表的な結果-ヘプタノール性難聴と回復聴性脳幹反応の平均（ABR）しきい値（デシベルSPL）は、トーンピップの関数としてプロットしました。周波数。測定は、前露光（ブラック・コントロール）と術後日（POD）1、7、および14（レッド）に応じてグループ化されています。エラーバーはSEMを表します。図はスティーブンズらから再プロットしました。 2014年¹⁵ この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図10.代表的な結果は-ヘプタノール露出部I.ヘプタノールで処理された耳のカリウムインナー整流器の変更（キール）チャンネル4.1染色血管条内（STV）と耳を制御した後蝸牛損傷をターゲット 。 （A）キール4.1（緑）のための強力なstrial細胞親和性を有する対照耳の典型的な通常のキール4.1染色。 （B）POD1の治療耳。 DECRの大vacuolizedゾーン緩和キール4.1親和性がSTVキール4.1染色強度の全体的な減少に伴いSTV（矢印）内に見られます。核はヨウ化プロピジウム（赤）（B）で対比されています。 =15μmのスケールバー。図は、スティーブンスら、2014年¹⁵から再プロットした。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図11.代表的な結果-ヘプタノール露出部IIの後にターゲットを絞った蝸牛損傷耳を制御するために比較ヘプタノール治療耳のスパイラル靭帯（SL）の変更。。正常に見えるII型スパイラル靭帯線維細胞（II）と対照耳の典型的なSL内（A）ノーマルキール4.1染色（緑）。 （B）ヘプタノールトンII型スパイラル靭帯線維細胞、核破壊およびアポトーシス（矢印）と一致し、染色体の凝縮/ブレブの領域にキール4.1染色強度の著しい減少とreated耳。核はヨウ化プロピジウム（赤）で対比されています。 =15μmのスケールバー。図は、スティーブンスら、2014年¹⁵から再プロットした。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図12.代表的な結果- 。ヘプタノールの曝露後の蝸牛染色強度の回復は 4.1染色は暴露後の日の関数としてプロットキールの相対輝度を意味します。相対輝度はキール4.1ヘプタノールの御馳走で共焦点顕微鏡下での反射強度として計算されますエド耳は対照耳に同じの割合として採用。 POD14-28データは、曲線上の1点としてプールされることに注意してください。エラーバーは、平均の標準誤差を表している黒丸は、平均値を表します。相対輝度の有意な回復がPOD 7以降の日付（スチューデントt 検定 p <0.05、アスタリスク）の間で実証されました。図は、スティーブンスらから再プロットし、2014年^15は、 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

ディスカッション

上記のプロトコルと代表的な結果は、男女両方を含むCBA / CAJのマウスモデルにおいて得られました。この近交系はよく研究を聞い中で「良い公聴会」標準と「正常な加齢」モデルとして確立されています。他の哺乳類のモデルでは、このプロトコルの使用の^16-23説明このテキストの範囲を超えています。読者はRWNアプリケーション技術は、哺乳類の内耳を研究するいくつかの利点を提供すること、しかし、注意してください。これらのうち、最も注目すべきは、繊細な解剖学的構造の直接の破壊および耳のカプセルの壁内に存在する生化学的勾配を回避することです。このような輸液ポンプの蝸牛および注入などの手順が直接永久閾値シフトにつながる内耳構造に違反する傾向を持っています。結果を分析する際に考慮しなければならないという事実。侵襲メトによって蝸牛側壁構造の破壊DSはまた、特定のゾーン効果のその場所に制限されている。このようなトランス鼓膜注射と注射剤として^15,24代替の非侵襲的なアプローチを信頼できない結果とに悩まされているフロセミドまたはヘプタノール、などの耳毒性剤の使用を制限することができます/または動物モデルへの全身毒性。この塗布方法は、上述のより侵襲的な方法とを近づいて一貫性のレベルを達成し、これらの欠点の両方を回避するために証明されています。

この技術の他の利点は、動物モデル及び既存の実験室インフラストラクチャに組み込む可能性の数とその広い適用性である含みます。後者に関しては、何も特殊な試薬や化学物質は、選択された耳毒性薬、麻酔薬、鎮痛薬とは別に必要ありません。耳毒性剤は、典型的に考える、長期間持続する溶液（5 ml）を十分に大きな容量で固定濃度で利用と混合され各アプリケーションをると、（マウスで）約10μLを使用しています。したがって、消耗品や機器の初期調達した後、研究者らは、時間のかかる溶液調製や材料の頻繁な交換から比較的自由です。この技術は、外リンパ輸液ポンプやcochleostomiesの注入を含む手順と比較したときに大きくなる可能性があり手術時間の短縮を提供しています。技術的な熟練のレベルに達すると、最初の切開から閉鎖に私たちの平均完了時間は、耳毒性薬剤について所望の露光の長さに応じて、1.5時間、典型的には20分でした。 3つまたは​​4つの手術は、容易に高い効率及び良好な結果を得るために増加した可能性を考慮して、一日で完了することができます。上述したように、この技術はまた、容易に、マウス、ラット、モルモットおよびスナネズミを含む齧歯類モデルの多様に適用することができます。

この方法の制限事項を中心にしています適度に急な学習曲線がそれをマスターするために必要と技術的習熟度に達するまで、期待される結果を減少させました。以下でより詳細に説明するように、外科的アプローチまたは手術野の不十分な視覚化の間に小さな誤差はほとんど常に予後不良につながります。このような丸い窓膜または希釈剤を間質液への薬剤のアクセスをブロックするサブミリメートルの厚さの気泡として初心者が認識に失敗することがあります微妙な所見は、それらを修正するために必要な精神運動能力を高く評価し、開発に時間がかかります。しかし、この手順を繰り返しパフォーマンスでこれらの障害は、簡単に前述の侵襲的な方法のいくつかの研究者により少なく困難な技術的な課題を克服し、構成しています。最後に、この手法は、蝸牛の損傷しか外科的露出時間中に一点で誘導することができる相対的な制限と関連しています。これは、ある程度克服することができます、ハイトらによって記載されたような薬剤に浸した吸収性ゼラチンスポンジでRWNを充填して¹⁰吸収性ゼラチンスポンジは時間とともに再吸収されますが、単独の水溶液の適用によって達成可能であるよりも長い露光時間を可能にすることができます。

この技術の完全な利点を実現し、任意の落とし穴を回避する研究者のためのためには、この技術の2つの重要な要素を認識することが重要である：1）一貫して中耳空間とRWNの可視化を維持します。 2）能力間質液および/または血液の自由な手術野を維持します。これらの元を達成するために、適切なヘッドホルダの重要性が強調オーバーすることはできません。動物の頭の確実な固定は、顕微鏡下で安定ビューを確保。微妙な計測機器が大幅に拡大した構造の配置を変更したときの重要性は容易に明らかになります。良い時間動物の吻側 - 尾側軸を中心に回転することができますEADホルダーは、サイトの研究者のラインで重要な動的な変更を容易にします。多くの場合、この軸の周りの回転の数ミリしか耳のカプセル骨のRWNと可視化の可視化の違いを意味することができます。常にビューを変更する機能も適切にニッチのと深さから削除される間質液を確保するために最も重要であるにも我々の経験、血液、結露、または間質液で第5部で説明したように耳毒性剤は、完全にアプリケーション間で削除されていることそれは、中耳空間が実験全体を妨害する能力を持って入ります。耳毒性薬剤の小さな量は簡単に余分な流体の小さな容積に接触することによって希釈することができる丸い窓（〜10μL）に適用し、これは驚くべきことではありません。このため、細心の外科的切開、鼓膜水疱と慎重preservatの断片的な脱キャップあぶみ骨動脈のイオンは、成功した実験結果に等しいです。

上記の重要なステップが観察され、期待される成果はまだ達成されていない場合は、トラブルシューティングが開始すべきです。我々の経験では、それは、多くの場合、2つの手順要素の試用バリエーションを実行すると便利です。最初は耳毒性薬は円窓に補充される頻度を変更することです。使用される薬剤に応じて、全露光時間は、完全なウィッキング剤とのその後の交換毎に10分で、30分、1時間の間です。短い持続時間の露光した場合、全体的な露出を増やすと、エージェントより多くの時間は、円窓膜を横切って拡散することを可能にします。追加の暴露と補充も、上述のように血液、結露、または間質によって耳毒性物質の不必要な希釈を避けるために役立つことがあります。このアプローチを使用するときに不注意の危険性を増加させる傾向があるように注意が、しかし、維持されるべきですLYあぶみ骨動脈を傷つけ、および/またはRWNに間質液を導入します。

この技術は蝸牛生理学および病態生理学の研究に提供するもので重要です。この低侵襲的手法は、微妙な生化学的プロセスの詳細な研究を可能にし、蝸牛再生能力を評価することを目的とし研究を進めるに等しいされている^。12,24この外科的アプローチと露出は、他の派生技術の様々な全体に再生し、成功した結果がこれを使用して、この方法は、蝸牛幹細胞移植の研究で報告されている^。14大きな取引が蝸牛について不明のまま、しかし、この技術は、研究者に利用できる広い装備一式と一緒に、この知識のギャップを狭めることに役立ちます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1-ヘプタノール98%	シグマ-アルドリッチ	H2805	PubChem 物質ID 24895536
ケタセット注射剤	パターソン獣医	07-803-6637	濃縮物100mg / ml
(ケタミンHCl)	10 ml	スケジュール CIII 規制物質
Anased 注射剤	ロイド研究所	NADA# 139-236	濃縮物 20mg/ml
ブプレネックス 注射剤	パターソン獣医	07-850-2280	濃縮物0.3mg / ml
(ブプレノルフィンHCl)	5アンプル/ボックス	スケジュールCIII規制物質
ベタジンスキンプレップソリューションMedline		MDS093941	1 クォート スクリュートップボトル
0.9% 滅菌生理食塩水	可変		溶液と注射の混合用
手術顕微鏡	カールツァイス	32192
制御音響環境 サウンドブース	インダストリアルアコースティクスカンパニー
サージカルヘッドホルダー	カスタムメイド –	図3
カロライナ
ネック軟部組織リトラクター(ワイヤースペキュラム、チタン)1.75インチ	ワールドプレシジョンインスツルメンツ	555801L	最大スプレッド20mm
パテに埋め込まれて、ヘッドホルダー90N
デンタルベルト駆動ハンドドリル に	エメスコ	ヴィンテージアイテム
メスハンドルサイズ6	バードパー	カーMEDC-011990
#15c ステンレス鋼外科用メスブレード	バードパー	カーSKU:097-7215	ACE
外科供給コード
ストレートチップジュエラーズ鉗子	バーネル	MIL17304
アイリスはさみ湾曲メ	ドライン	DYND04026
アイリスはさみストレート	メドライン	DYND04025
スティーブンス腱切開術はさみストレート	メドライン	MDG3222111
ローゼンイヤーニードルストレートシャフト、軽く湾曲したチップ	MytaMed	Item# 6.56.00	図1は、角度付きシャフトピックを示しています。これは後にローゼンピックロー
ゼンイヤーニードルストレートシャフト、強く湾曲した先端	MytaMed	Item#6.56.01
キムワイプデリケートタスクワイパー に	Kimtechサイエンス	コード34155	ホワイト、サイズ4.4x8.4インチ。三角形にカットし、細い先端の芯に丸めます。
ハウスイヤーキュレット、6インチシャフト、ライトアングル	メドライン	MDG0396486
Gelfoam(吸着性ゼラチンスポンジ) サイズ100	Medline	IIS34201	代替品を作ることができます
綿ペレット #3 4 mm	リッチモンド	メーカーコード 100108
電気メス ユニット 100 E M/M	Elmed	リスト番号 52-5770	バイポーラおよびモノポーラ対応
1cc U-100 インスリン注射器 28G、0.5インチの長さの針	BD	製品番号:329410	耳毒性物質
23G、鈍い先端、1 インチの配送のためのオプション長さ	ケンドール	製品コード 8881202397	アブミ骨動脈を損傷するリスクが少ない耳毒性物質の制御された送達用
サージカルマスク	Uライン	S-10478
検査グレード ニトリル手術用手袋	Uライン	S-12549
精密バリカンWahl
PC-1 で5-0ナイロンブラックモノフィラメント縫合糸に置き換えることができます。13 mm 3/8 サークルニードル	エチロン	1855G	代替品を使用することができます。
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