方法論記事

代謝分析のためのミトコンドリア富化画分の調製で

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DOI：

10.3791/53149

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2015年9月30日

 , 
1Biology Department, Adelphi University, 2Department of Ecology and Evolutionary Biology, Brown University

この記事について

サマリー

ミトコンドリアは、代謝と恒常性の調節において中心的な役割を果たしています。生物の生理機能に影響を与えるミトコンドリア代謝の微妙な変化は、全生物メタボロミクス研究で検出するのが難しい場合があります。ここでは、Drosophila melanogasterの微妙な代謝変化の検出を強化する単離法について説明します。

要約

ミトコンドリアはアミノ酸代謝、炭水化物代謝、脂肪酸酸化に関与しているため、ミトコンドリア機能の欠陥は、これらの複雑な病気に苦しむ人々の生活を危険にさらすことがよくあります。ミトコンドリアの代謝変化を検出することは、ミトコンドリアの障害と薬理学的薬剤に対するミトコンドリアの応答を理解するために不可欠です。ミトコンドリア代謝は代謝調節の中核ですが、ミトコンドリア代謝の微妙な変化の検出は、全生物または全組織抽出を使用して得られる他の細胞質代謝産物の過剰発現によって妨げられる可能性があります。

ここでは、ショウジョウバエの顕著なミトコンドリア代謝変化を検出した単離法について説明しています。これは、全ハエとミトコンドリア濃縮製剤の間で区別されます。この分析法の感度を示すために、遺伝的に多様なミトコンドリアDNA(mtDNA)を持つショウジョウバエのセットを使用し、それらをラパマイシンという薬剤に曝露しました。この方法を用いて、ラパマイシンがミトコンドリアの遺伝子型依存的にミトコンドリア代謝を修飾することを示しました。しかし、これらの変化は、代謝物がミトコンドリアに富んだ画分から抽出された場合のメタボロミクス研究では、はるかに明確です。対照的に、全組織抽出物は、mtDNAとは無関係に、薬物ラパマイシンによって媒介される代謝変化のみを検出しました。

概要

この手順の目標は、 キイロショウジョウバエを用いたメタボロミクス研究のために十分なミトコンドリア代謝物を得濃縮されたミトコンドリア画分を開発することです。我々の経験では、全細胞抽出法を用いたメタボロミクス解析は、 ショウジョウバエの微妙なミトコンドリアの代謝産物の変化を検出することができません。しかし、従来メタボロミクス解析にミトコンドリア分画、ミトコンドリア代謝産物シフトを同定するための感度を増加させます。

ミトコンドリアは、細胞が正常な機能1に必要なエネルギーの90％を提供する責任細胞小器官です。近年では、ミトコンドリアが単にアデノシン三リン酸（ATP）を産生するよりも細胞および生物機能においてはるかにダイナミックな役割を果たし、現在は代謝恒常性2,3の調節のためのハブとして認識されていることが認識されています。ミトコンドリアは、DISいる内共生プロセスの結果であります着色した微生物の系統は、15億年前の4〜合併しました。ミトコンドリアは、真の細胞小器官へと進化したように、内部共生からの遺伝子は、新興核ゲノムに組み込まれました。 37遺伝子は酸化的リン酸化5の酵素複合体のサブユニットであるミトコンドリアのタンパク質をコードする13の、ミトコンドリアDNAに残したままの動物では、今日、約1,500ミトコンドリアタンパク質は、核コードです。ミトコンドリアおよび核コンパートメント間の調整は、適切なミトコンドリア機能を維持するために必要とされます。

ここに記載された方法を用いて、我々は、ミトコンドリアと核ゲノムとの間の調整の操作から生じるショウジョウバエにおけるミトコンドリアの代謝変化を検出することができました。私たちは、その姉妹種DからするのmtDNAにショウジョウバエのひずみを使用しましたシミュ単一D.上に配置しました核背景6 メラノ 。この「中断」mitonuclear遺伝子型はDの 「ネイティブ」、または共進化mitonuclear遺伝子型と比較しましたそのネイティブDに同じ核ゲノムを運ぶメラノミトコンドリアDNAをメラノ 。 D.ショウジョウバエとD.シミュの mtDNAsは〜100アミノ酸とmitonuclear通信7,8に影響を与える > 500同義置換により異なります。私たちは、薬理学的なストレスに応答して代謝物のシフトを研究するために全体のフライを抽出し、ミトコンドリアの濃縮された抽出物を生成しました。ここでは、ミトコンドリアに富む画分を使用した場合、我々はDを運ぶネイティブ、共同発展の遺伝子型との間にミトコンドリアの代謝物の顕著なシフトを検出することを示しますショウジョウバエの mtDNAs と D を運ぶ破砕遺伝子型シミュのmtDNA。対照的に、これら2つの遺伝子型の間で代謝産物の変化は、全体のハエ抽出物を利用する通常の方法を用いて微妙です。したがって、この方法はmtDNAsがでミトコンドリアの変化を仲介する方法を理解するためのパスを提供しました異なる薬剤への応答。

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プロトコル

1.試薬およびソリューション

  1. フライ食品やメディアの準備
    1. 熱フライ成分90℃に設定したホットプレートで水にw / vの0.79パーセント寒天11％の砂糖、2％自己消化酵母、5.2％のコーンミール、。均質やや密な混合物が得られるまで定期的に攪拌します。各食品を飛ぶmlの5と100バイアルの合計フライ食品の550ミリリットルの最終容量を準備します。
    2. 、加熱源から削除食品がダウン80℃に冷却するまで、時々攪拌し、95％エタノールに溶解した0.2％tegosept-4-ヒドロキシ安息香酸メチルを加えます。
    3. 2等量の食品を分割します。他のボリュームへの1つのボリュームとエタノール1.1 mlにエタノールに溶解したラパマイシンの50mMの1.1ミリリットルを追加します。ラパマイシンおよび食品へのエタノール溶液を攪拌します。温度が薬を追加する前に、50℃に低下していることを確認してください。
  2. 分離バッファ
    1. 単離緩衝液[225mMのマンニトール、75mMのスクロース、10mMの3-（N <500mlのを準備します/ em>のモルホリノ）プロパンスルホン酸（MOPS）および1mMエチレンジアミン四酢酸（EDTA）、2.5 mg / mlのウシ血清アルブミン（BSA）]水に。
    2. 水酸化ナトリウムを用いてpHを7.2に調整します。初期のpHが酸性になります。
    3. ソリューションを殺菌し、4℃でそれを保存するために、0.22μmの細孔径を有する滅菌フィルターの保存瓶を使用してください。
  3. 洗浄バッファー
    1. 水で洗浄緩衝液[225mMのマンニトール、75mMのスクロース、10mMの塩化カリウム、10mMのトリスHClおよび5mMのKH 2 PO 4]の500ミリリットルを準備します。
    2. 水酸化ナトリウムを用いてpHを7.2に調整します。初期のpHが酸性になります。
    3. ソリューションを殺菌し、4℃でそれを保存するために、0.22μmの細孔径を有する滅菌フィルターの保存瓶を使用してください。

ショウジョウバエ株の2飼育

  1. 、開発中の幼虫密度を制御培養瓶に両親の25組を配置し、それらが48時間の卵を産むことを可能にします。
  2. 卵の密度を調整するために48時間後の親オブジェクトを削除します。
  3. 繰り返しは、新興のF1子孫を使用して、2.1と2.2の手順ので、この濃度制御の二世代が達成されます。
  4. 大人を収集するには、二酸化炭素（CO 2）と性別によって別々に使用してハエを麻酔。
    1. 5 PSIの連続的な流れで高圧のタンクから、純粋なCO 2を配信するために単段レギュレータを使用してください。静電気を避けるために、水を用いてフラスコをフィルタリング500ml中にCO 2を触媒するためにプラスチックチューブを使用します。
    2. フラスコを密封するために一つの穴にゴム栓を使用してください。 CO 2パッドにフラスコの側方開口部を接続するためのプラスチック製のチューブを使用してください。
    3. 10〜15分を超えないためのパッドでハエを置きます。実験条件でそれらを配置する前に24時間、麻酔から回復できるようにします。
  5. ミトコンドリアの濃縮された画分のための十分な代謝物を生成するには、サンプルあたり300ハエを使用しています。ここでは、女性を使用していますが、genderは他の実験では異なる場合があります。自家製1Lの人口統計ケージに150ハエを転送します。バイアル中のフライ食品の5ミリリットルへのアクセスを許可します。
  6. 別の1リットルケージに残りの150ハエを転送します。 150以上のハエでケージを人口過剰にするしないでください。
  7. 実験条件ごとに6つの複製サンプルを使用してください。全動物の抽出物は、動物全体の1サンプルを生成するために、より多くの代謝物を得ているので隔離し、転送50女性は1ケージに飛びます。ミトコンドリアの分離株については、実験条件ごとに6つの複製サンプルを使用しています。
  8. 12時間の光と12時間の暗のサイクルで25℃でのケージを置きます。
  9. 食品の品質を維持するために、食品の5 mlのバイアル中で2〜3日ごとに新鮮な食品を提供します。
  10. 10日間の食品のハエを維持します。このステップは、ラパマイシン処理7のために必要とされます。他の治療法や条件が異なります。

ミトコンドリア画分の3の単離

  1. 1ケージ（150ハエ）からハエをダンプ冷却した単離緩衝液1mlを充填したガラス - テフロンダウンスホモジナイザー。
  2. ダウン15ストローク用乳棒アップとを移動させることにより、均質化します。無傷ミトコンドリアを維持するために氷の上にモルタルを続けます。
  3. 4℃で5分間、300×gで1.5mlチューブと遠心分離機にホモジネートを転送します。
  4. ミトコンドリアを濃縮するために4℃で10分間6000×gで上清および遠心してください。
  5. 上清を細胞質画分を含んでいるので、上清を廃棄または別の実験のためにそれを使用しています。洗浄バッファー300μlの中にペレットを再懸濁。
  6. 第2のかご用3.5 - を繰り返して、3.1を繰り返します。極低温マイクロチューブの両方でケージの再懸濁したペレットを組み合わせます。
  7. 4℃で10分間、6,000×gで遠心分離します。
  8. 上清を捨て、液体窒素中でペレットをフラッシュ凍結。
  9. -80℃以下の温度で濃縮されたミトコンドリア画分を保管してください。
    1. また、動物全体の事前のためのparation、極低温マイクロチューブに大人を配置します。 -80℃以下の温度で液体窒素や店舗成人のバイアルをフラッシュ凍結。

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結果

プロトコルを使用して上記で説明し、我々は発散mtDNAs 7にラパマイシン薬物の効果をテストするために、ミトコンドリアの濃縮された画分および全動物抽出物にメタボローム解析を行いました。私たちは、フライ食品で薬物を溶解することにより、ラパマイシンの200μMを配信しました。ハエは、10日間ラパマイシンに曝露しました。全フライ抽出物からのミトコンドリア抽出物からの代謝産物は、標準的な溶媒抽出方法を用いて、ガスクロマトグラフィー質量分析（GC / MS）および液体クロマトグラフィー - タンデム質量分析（LC / MS / MS）を用いて得ました。

図1は、ミトコンドリア画分中のミトコンドリア濃縮の指標として、膜輸送タンパク質ポリンの濃縮を示しています。ポリンタンパク質は、細胞質ゾル画分に検出されませんでした。逆に、チューブリンタンパク質は、ミトコンドリア分画、suコマンドでは検出...

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ディスカッション

このプロトコルの中で最も重要なステップは次のとおりです：1）豊かな空間に十分なハエを飼育します。これは、150以上のハエそれぞれと人口統計ケージを人口過剰にするしないことが非常に重要です。 2）食品の競争と栄養ストレスを避けるために頻繁にケージの食品を変更します。 3）ミトコンドリア画分の単離の間に整合性を確保するために4℃ですべてのサンプルを維持します。また、単離緩衝液、洗浄緩衝液、および使用前にガラステフロンダウンスホモジナイザーを冷却することをお勧めします。濃縮されたミトコンドリアの派閥のサイトゾル汚染を低減するために、ステップ3.5からのミトコンドリアペレットを、洗浄緩衝液で洗浄することができます。

濃縮されたミトコンドリア分画からの代謝物の抽出は、複製試料（6反復/実験条件）の高い番号が必要です。合計で、24のケージは 、図1及び2のために使用されます。我々は、すべての抽出を行うことをお勧めします実験的な変動性を減少させるために同じ日amples。実現可能なものの、このプ...

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開示事項

著者らは、開示することは何もありません。

謝辞

この作業は、アデルフィ大学の教員開発助成金とNIGMSからの助成金R15GM113156からEVCに授与された助成金、NIGMSからの助成金R01GM067862、およびDMRに授与されたNIAからの助成金R01AG027849によって支援されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
0.2% テゴセプトメチル 4-ヒドロキシ安息香酸VWRAAA14289
エタノールSigma-Aldrich792799
マンニトールSigma-AldrichM4125
ショ糖Sigma-AldrichS9378
3-(N-モルフォリノ) プロパンスルホン酸 (MOPS)Sigma-AldrichM1254 
エチレンジアミン四酢酸(EDTA)Sigma-Aldrich38057 
ウシ血清アルブミン(BSA)Sigma-Aldrich5470
KClSigma-AldrichP9333
Tris HClSigma-AldrichRES3098T-B7
KH2PO4Sigma-Aldrich1551139
ハエを麻酔するためのCO2パッドTritech ResearchMINJ-DROS-FP
1 L ケージWeb レストラン ストア999RD32
1 L ケージ蓋Web レストラン ストア999LRD
ガラス テフロン ドンス ホモジナイザー フィッシャーサイエンティフィNC9661231
水酸化ナトリウムシグマアルドリッチS8045
ラパマイシン LCラボラトリーズ R-5000
抗ポリンMitoSciencesMSA03
抗アルファ チューブリン開発研究 ハイブリドーマ バンク12G10
ピアス BCA タンパク質アッセイ キット サーモサイエンティフィック 23225
CO2パッドTritech Research, IncMINJ-DROS-FP
フィルターフラスコenascoSB08184M
ゴム栓enascoS08512M
ック

参考文献

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