ハイスループットスクリーニングを使用したキナーゼ基質ペアの同定

Summary

タンパク質のリン酸化は、細胞が細胞外の環境における情報を解釈し、それに対してどのように反応するかの中心的な特徴です。ここでは、哺乳類細胞から精製したキナーゼを使用して、目的の基質をリン酸化するキナーゼを迅速に同定するためのハイスループットスクリーニングプロトコルを紹介します。

Abstract

我々は、新規のシグナル伝達経路を解明するために使用することができ、リン酸化基質のための専用のヒトプロテインキナーゼを同定するためのスクリーニングプラットフォームを開発しました。我々のアプローチは、精製GSTタグ付きヒトプロテインキナーゼのライブラリーを使用すると、目的の組換えタンパク質基質を備えています。私たちは、CREB-規制転写コアクチベーター2（CRTC2）のグルコース調節サイトのキナーゼとしてのMAP /微小管親和性調節キナーゼ2（MARK2）を識別するために、β細胞の増殖に必要なタンパク質、ならびにこの技術を使用していますアダプタータンパク質ELMOのリン酸化による細胞の転移の調節因子としてのチロシンキナーゼのAXLファミリー。私たちはこの技術を記述し、それは、細胞が環境刺激に応答する方法の包括的なマップを確立するのを助けることができる方法について説明します。

Introduction

タンパク質の翻訳後修飾（PTMを）は、細胞内の通信のために不可欠です。おそらく全てのPTMの検討最高の細胞内局在性、コンフォメーション、安定性、それらの生化学的活性を含むタンパク質の機能の無数を調節するタンパク質キナーゼによって触媒されるリン酸化は、です。標的タンパク質上のリン酸化部位の同定は、トリプシンリンペプチドマッピングにより、またはリン酸化ペプチド^1,2-について富化サンプルを使用して、今、標準プロテオミクス技術によって達成することができます。表現プロテオームの四分の三が³リン酸化されることが予想され、100万⁶までの推計で20万リン酸化部位^{5を特定し}ているが、これらの多くは、経路、またはプロテインキナーゼシグナル伝達、全く割り当てられた生物学を持っていません。

リン酸化部位の同定は比較的簡単ですが、比較的大きな挑戦はにあります基板のペア：これらのサイトを対象と同族キナーゼ（複数可）、我々はマッピングキナーゼと呼ぶプロセスが識別されます。いくつかのキナーゼを同定するための方法：基板対は、目的のキナーゼで開始し、その基質を探しまたは対象の基板から始まると修飾キナーゼ実験^7-11または計算^12を検索しようとするいずれかの記載されています。既知のリン酸化基質のためのキナーゼを同定するために、バイオインフォマティクスは、基板と沈殿複....

Protocol

試薬、プレート、および細胞の作製

1. 25mMトリスpH7.5で、150mMのNaCl、50mMのNaFを、0.5mMのEDTA pH8.0の、0.5％トリトンX-100、5mMのβグリセロリン酸、5％グリセロール：500 mlの溶解バッファー行います。 4℃で保存します。使用1mMジチオスレイトール（DTT）、1mMのフェニルメチルスルホニルフルオリド（PMSF）及び1mMのバナジン酸ナトリウムを添加する直前。このステップの後、PMSFは、任意のすすぎバッファに必要とされません。
2. 200 mMトリスpH7.5の、50mMのベータ - グリセロホスフェート（FW 216）、2mMのバナジン酸ナトリウム：10倍キナーゼ緩衝液20mlのを行います。 -20℃で1 mlチューブで分注し、店舗。使用直前に、5mMのDTTを追加します。
3. 300μMのアデノシン三リン酸（ATP）、66mMの_MgCl 2を、-20℃で33 mMでのMnCl _2.1 mlチューブで小分けして保存：10倍、M-ATPバッファの20ミリリットルを行います。
4. 1.5グラムのトリス塩基、20 mlのグリセロール、30mLのH _{2 O：2X}ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）の溶解緩衝液100mlを作ります溶解し、HClでpHを6.8に調整します。 40を追加mlの10％SDS、100ミリリットルにボリュームを調整します。 25 mgの....

Results

画面の代表的な結果を図2に示す 。180は、CRTC2キナーゼならびに古典的なキナーゼアッセイ基質ミエリン塩基性タンパク質（MBP）のアミノ酸268から283に対応するGSTタグ化ペプチド基質を用いてスクリーニングしました。唯一の2つのキナーゼ、MARK2および高度に関連するキナーゼMARK3は、CRTC2ペプチドをリン酸化しました。それは多くのリン酸化残基を含有し、ゲルの底に向かっ、18 kDaので動作するようMBPは、全てのアッセイで内部コントロールとして含まれています。これは特異性の解釈を可能にする：いくつかのキナーゼは、堅牢基板およびMBPをリン酸化します。ここで注目すべきは、このように常にアッセイにおけるバックグラウンドのリン酸化があり、（無キナーゼコントロールすなわち ）GSTのみを含むウェルは、常にいくつかの内因性キナーゼ活性を浄化することです。これは基質のリン酸化が本物であることを排除していませんが、それは 、インビトロでのキナーゼの設定は以下の選択であることを示唆しているん。これは、キナーゼ基質特異性に関する結論を引.......

Discussion

アプローチ^{14,15を記述する}元の出版以来、180 GST-キナーゼの元のライブラリは、ヒトタンパク質キノームの420のメンバー、または〜80％ ​​にまで拡大されました。拡大ライブラリを使用すると、説明したようにプロトコルは、ホスホおよびデジタル信号増強を使用することによって短縮することができた、（必要と認めた場合）フィルムを開発するために4〜5日、その後1-4日かかります。注意しなければならないいくつかの重要なステップは、（プロトコルの概要について、図1を参照してください ）があります。まず、トランスフェクションの時点でバッチ拡張段階、96ウェルプレート中で（マイコプラズマフリー、拡張中にコンフルエントに到達させず、各継代でのトリプシン処理決して）細胞のストックの健康です。トランスフェクションが行われ（ステップ1.5）を取るとき、細胞を均一に播種すると、80％のコンフルエントにする必要があります。

第二に、ボリュームTRANSFを最小にするために、自動化液体ディスペンサを使用するトランスフェクション時に理想的ですERエラー.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
で製造された		溶解緩衝液	プロトコルステップ1.1
10xキナーゼ緩衝液	社内で製造		プロトコルステップ1.2
10x M-ATP	社内		されました プロトコルステップ1.3
ヒトキナーゼプラスミド	Orfeome、Invitrogen、Origene		GSTタグ付き社内
96ウェルプレート	フィッシャーサイエンティフィ	CS003595ック
293T細胞	ATCC	CRL-11268
DMEM	Fisher Scientific	SH3002201	supplement with 100 U/mlペニシリン、100 μg / mlストレプトマイシン、10%ウシ胎児血清。
CO2 インキュベーター	Sanyo	MCO-17AIC
15 cm cell culture dishes	Fisher Scientific	877224
還元血清培地	Invitrogen	22600-050
脂質ベースのトランスフェクション試薬	Invitrogen	11668-019
自動液体ディスペンサー	Thermo Scientific	5840300
小型カセットアタッチメント	Thermo Scientific	24073295
標準カセットアタッチメント	Thermo Scientific	14072670
4 mM パーバナジント	Made in house		ステップ3.1
0.25 M CaCl2	Made in house
マルチチャンネルピペット (20-200 μl)	Labnet	p4812-200
マルチチャンネルピペット (1-10 μl)	Thermo Scientific	4661040
V底6ウェルプレート	Evergreen Scientific	290-8116-01V
グルタチオンコーティング96ウェルプレート	Fisher Scientific	PI-15240
ハイブリダイゼーションオーブン	Biostad	350355
GSTタグ付き基板	自家製
ミエリン塩基性タンパク質(MBP)	Sigma	M1891
リピータピペット (1 ml)	Eppendorf	22266209
32P gamma-ATP	Perkin Elmer	BLU502Z500UC
2x SDS lysis buffer (100 ml)	家		プロトコルのステップ1.4を見なさい
26井戸のprecast TGXのゲル	BioRad	567-1045	ゲルの必要なパーセントは興味の基質の分子量によって依存する
Coomassieの汚れ	家		0.1% Coomassie R250、10%の酢酸、40%のメタノール
Coomassieのdestain	家		10%の酢酸、20%のメタノール
ラベル付きゲル容器	自社		空のチップボックスからプラスチック製の蓋を使用し、ゲル1個が入る程度
Whatmanフィルターペーパー	フィッシャーサイエンティフィック	57144
セロハンシート (2)	BioRad	165-0963
ゲルドライヤー	Labconco	4330150
ダブルエマルジョンオートラジオグラフィーフィルム	VWR	IB1651454
フィルムカセット	フィッシャー・サイエンティフィック	FBAC-1417
インテンシファイイング・スクリーン	フィッシャー・サイエンティフィック	FBIS-1417
プレートシール ゴムローラー	シグマ	R1275