方法論記事

の共焦点分析を用いました

10.6K 閲覧数

⸱

DOI：

10.3791/53162

⸱

2015年12月14日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Science, The Bateson Centre, University of Sheffield, 2Institute of Genetic Medicine, Newcastle University, 3Department of Cardiovascular Science, The Bateson Centre, University of Sheffield, 4School of Biochemistry, University of Bristol, 5Biology Department, University of York

この記事について

サマリー

ここで原稿がアフリカツメガエルにおける蛍光タグ付きリガンドの分泌と普及を分析するための方法の簡単なセットを提供します。これは、リガンドの分布を変更するための他のタンパク質の能力を試験し、モルフォゲン勾配を調節するメカニズムへの洞察を与えることが実験を可能にするためのコンテキストを提供します。

要約

このプロトコルは、電池の分野にわたって分散リガンドを可視化する方法を説明しています。一緒に初期胚での細胞のサイズが大きいと、外因性タンパク質を発現の容易さは、 アフリカツメガエルは 、GFPタグ付きリガンドを可視化するための有用なモデルを アフリカツメガエル 作ります。合成mRNAは効率的に早期 アフリカツメガエル胚に 注入した後に翻訳され、注射は、単一の細胞を標的とすることができます。このような膜つながRFPとして系統のトレーサーと組み合わせると、過剰発現されたタンパク質を産生している細胞注入（とその子孫）を容易に追跡することができます。このプロトコルは、注入されたmRNAからWntおよびShhのリガンドをタグ付けされた蛍光を製造するための方法を説明します。方法はマイルを伴います外胚葉外植（アニマルキャップ）と、複数のサンプル中のリガンド拡散の解析のCRO解剖。共焦点イメージングを用いて、細胞のフィールド上のリガンドの分泌および拡散についての情報を得ることができます。共焦点画像の統計分析は、リガンド勾配の形で定量的データを提供します。これらの方法は、モルフォゲン勾配の形状を調節することができる因子の効果を試験する研究に有用であり得ます。

概要

初期胚発生時には、細胞が徐々に分化の特定の系統に従うことを約束されています。これは、全能性（または多能性）の基を意味し、細胞が徐々に一つの細胞型を生じると判断前駆細胞の集団を確立するに限定となります。細胞間シグナル伝達は、胚発生時の系統仕様の規制の中心です。これらの信号の操作は、新規な治療法をサポートするために、特定の運命に向かって直接幹細胞に必要とされます。

シグナル伝達経路の比較的小さな数は、TGFスーパーファミリー（nodalsとのBMP）1-2、FGFの3、4のWnt、およびハリネズミ5への応答経路を含め、開発中に繰り返されます。これらの分泌されたタンパク質は、それによって遺伝子発現および/または細胞の挙動を変化させるシグナル伝達を活性化する細胞膜に存在する受容体に結合します。細胞標識の厳しい規制エイリングは、細胞系譜の仕様と正常な発達に不可欠です。これらの経路の間でのクロストークは、細胞の運命を決定するのに重要であるが、単一のリガンドは、それ自体、異なる濃度で異なる応答を誘発することができます。モルフォゲン勾配は細胞型はセル 6の分野から派生することができますどのように異なる説明する理論として100年以上前に説明しました。細胞の一つのグループによって生成シグナリング分子は、ソースからの長い距離と濃度の減少、一定の範囲で拡散することができます。信号に曝露された細胞は、異なる位置での細胞が信号の異なるレベルに対して異なる応答すると、電池の分野での位置で局所濃度に応答します。モルフォゲンの存在の証拠は、初期のショウジョウバエ胚7と翼のディスク 8と同様に、脊椎動物の四肢9と神経管10の研究から来ています。

方法は、中に必要とされています確立され、これらの勾配を調節する上で重要な他の分子を同定する方法をモルフォゲン勾配vestigate。異なる遺伝的背景との関連で、インビボで内因性タンパク質を可視化するために免疫組織化学を用いた上品な実験は、モルフォゲン勾配11-12を研究するために使用されています。しかし、優れた抗体および特定の変異体は、常に利用可能ではないので、我々は、代替、外因性遺伝子産物が細胞のフィールド全体でのリガンドの分布に影響を与えることができる方法を詳細に分析するための簡単​​な方法を提供することで、アフリカツメガエルにおける蛍光リガンドの過剰発現を使用して、ここでのプロトコルを記述します。 アフリカツメガエルは、彼らが最も初期の段階でアクセス可能であるので、その胚は、外部開発する実験のこれらのタイプに着手するための優れたシステムを提供します。サイズが大きい（直径1〜1.5ミリメートル）は、マイクロインジェクションおよび外科操作を簡素化し、胞胚によって、彼らはまだ約20（比較的大きいですように、細胞は、画像に簡単ですステージ81;）全体でmは。アフリカツメガエルにおける過剰発現の研究​​を行うのは簡単である：mRNAは、初期胚に注入し、特定の細胞を標的とすることができ、効率的に翻訳されています。

蛍光タグ付けWnt8a / Wnt11b-HA-EGFP構築物は、PCS2 Wnt8a-HA 13、PCS2 Wnt11b-HA 14およびEGFPを用いて作製しました。 HAペプチドは、追加の分子タグを提供するだけでなく、含まれることが重要であるが、それは両方の遺伝子産物が機能することを可能にするのWntおよびEGFPタンパク質を分離するスペーサーとして作用すると考えられるからです。 Shhの可視化のために使用される構築物は、以前のShh-EGFP融合タンパク質15を発現するトランスジェニックマウスを生成しました。これは親切にアンディ・マクマホンによって提供されました。重要なことは、すべての構築物について、GFPタグは、それが処理した後に保持されるようなシグナル配列の3 '側にクローニングされます。そのようなadditio、最終タンパク質は、修正するために必要な配列を含むことを確実にするためにも不可欠です脂質のnが合成mRNAのprodution用に最適化されPCS2 +発現ベクターにサブクローニングしたのShhおよびWnt ligands.TheのcDNAの場合です。それは、SP6プロモーターおよびポリアデニル化シグナル（http://sitemaker.umich.edu/dlturner.vectors）を含みます。

ここで説明する作業は、分泌および蛍光の拡散を比較するための単純なプロトコルがWntとのShhは、リガンドをタグ付けタグ付けています。合成mRNAの規定量を注入することにより、プロトコルが異なるプロモーターを使用して、異なるベクターからの変数式に関連するすべての問題を一周します。これらのメソッドは、最近のShh-EGFPおよびWnt8a /アフリカツメガエル16-17でWnt11b-HA-EGFP分泌および拡散にヘパラン硫酸endosulfatase Sulf1の影響を調査するために適用されています。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

プロトコル

倫理声明：動物実験は、MEPする英国ホームオフィスのライセンスの下で行われたと行った実験が到着に準拠したヨーク大学の倫理委員会によって承認されました：ガイドライン（動物実験in vivo実験の報告）。 （https://www.nc3rs.org.uk/arrive-guidelines）。

蛍光タグ付きリガンドを生成するには1.戦略

以下は、フレーム融合構築Wnta-HA-EGFPに製造するためには、PCS2にWnt8a-HAおよびEGFPをサブクローニングするための例のプロトコルであります：

  1. セットアップとWnt8a-HAおよびeGFPのためのPCR反応を実行します。表1に表示されたプライマーの情報を使用し、表2 メモ表示例PCR反応および例PCR条件：鋳型DNAが生成される構築物に応じて変化するであろう、この例では、Wnt8a-HAを鋳型DNAとして使用されます。
  2. 3最終溶出を行い、ゲル抽出キットを用いてPCR反応をクリーンアップ分子等級の水0μl。
  3. TAEで調製した1％アガロースゲル上でPCR産物2μlのを確認してください。
  4. 適切な制限酵素を使用してダイジェストWnt8a-HAおよびEGFP PCR産物とPCS2（表1を参照）、表2に記載されているように、（例PCR産物ダイジェスト）の反応を設定します。
  5. 37℃で3時間反応をインキュベートし、その後、氷上でWnt8a-HAおよびGFP PCR産物を保存します。
  6. PCS2ダイジェストに子牛アルカリ性腸ホスファターゼ（CAIP）1μlのを追加し、37℃で6分間インキュベートします。
  7. 熱は、65℃で15分間インキュベートすることによってCAIPを不活性化します。
  8. ファイル名を指定して実行PCS2 PCRをTAEにおいて調製1％超純アガロースゲル上で消化します。
  9. ゲル抽出し、分子グレードの水30μlの最終溶出を行い、ゲル抽出キットを用いてPCS2し、PCR産物をクリーンアップします。
  10. 表2に記載されるように連結を設定する（例T4ライゲーション）と16時間12℃でインキュベートします。

2. mRNAの合成：Tの生成emplate

  1. 膜セルリアン（memCerulean）、膜-RFP（memRFP）、Shhは-GFP、Wnt8a / Wnt11b-HA-EGFP：以下のプラスミドの制限酵素消化（発現ベクターPCS2内のすべて）を使用してテンプレートを生成します。
    1. 表2（実施例テンプレートダイジェスト）で説明したように設定する制限がダイジェスト。
    2. 穏やかに混合し、37℃で2時間反応をインキュベートします。
  2. 反応が完全に切断したことを確認するために1％アガロースゲル（TAE）に消化されたプラスミドの2.5μLを実行します。
  3. 分子グレードの水50μlの最終溶出を行い、ゲル抽出キットを使用してダイジェストをクリーンアップします。

3. mRNAの合成： インビトロ転写

  1. SP6 mRNA転写キットを用いて機能するmRNAを合成します。 1.5ミリリットルのDNAse / RNAseを含まない微量遠心チューブ中で反応を組み立てます。
  2. 表2（例、mRNA合成）に記載のようにmRNA転写反応をセットアップします。
  3. ミックスその後、ピペットで静かに反応し、4時間37℃でインキュベートします。
  4. 2％アガロースゲル（TAE）上での反応の1μLを確認してください。
  5. 、反応にDNA分解酵素の1μl加えP20で穏やかに混合し、37℃でさらに15分間反応をインキュベートします。
  6. 反応に分子等級の水340μlを、酢酸アンモニウム40μlのフェノール - クロロホルム400μlのを追加します。 30秒間反応が渦。
  7. 5分、14,000×gで、4℃のmRNAをスピン。
  8. 新しい1.5mlに移動し、各反応からトップ（水）層をピペットをキャップマイクロ遠心チューブをねじ込みます。
  9. デカンテーション反応のそれぞれに等量のクロロホルムを追加します。 30秒間のサンプルをボルテックス。
  10. 5分、14,000×gで、4℃のmRNAをスピン
  11. 新しい1.5mlスクリューキャップマイクロ遠心チューブに移動し、各反応からの上部の水層をピペット。
  12. 反応のそれぞれに等量のイソプロパノールを加え氏を沈殿NA 30分間-80℃で。
  13. mRNAをペレット化し、4℃、14,000×gで15分間の反応のそれぞれをスピン
  14. ペレット化したmRNAを乱さないように注意しながら上清を除去
  15. 、反応のそれぞれに70％エタノール200μlを加え反応を混合し、次いで14,000×gで10分間スピンし、4°C。
  16. 、mRNAのを邪魔しないように注意してエタノールを除去し、真空デシケーターやスピードバックを用いて室温でペレットを乾燥させます。
  17. 再懸濁分子グレードの水の10〜20μlの中のmRNAを。簡単にスピンし、氷上でサンプルを維持します。注意：1分間80℃に試料を加熱すると、それが溶解することができます。
  18. 2％アガロースゲル（TAE）上でのmRNAの1μlのを実行し、濃度の正確な読み取りを得るために、分光光度計で1.2μLを分析します。
    重要なステップ：合成mRNAの400 ngの/μlの濃度は、以下の実験を行うために必要とされます。
    重要なステップ：260/280比である場合2.00から2.20の範囲外、またはmRNAの総量は、12μgのを超えて、塩化リチウムの沈殿を行います。
  19. -80℃で1μlの分量を保存するmRNA。アリコートを使用して、捨てます。 mRNAの凍結を再ません。

4.生成胚アフリカツメガエル

  1. 実験前の週、首相アフリカツメガエルは、ヒト絨毛性ゴナドトロピンホルモン（HCG Chorulon）の50単位を皮下注射することにより、女性をアフリカツメガエル 。
  2. アフリカツメガエルは、HCGの250単位を注入し、19℃で暗く、O / Nでそれらをインキュベートすることにより、実験前の夜、女性をアフリカツメガエル誘導します。
  3. 4℃で1xNAMで安楽死させた雄のカエルとストアから精巣を解剖。注：男性カエルは動物のスケジュール1による終末麻酔により安楽死さ（科学的手続）法1986（https://www.nc3rs.org.uk/euthanasia）。
  4. マッサージ女性アフリカツメガエルはラを収集、排卵を誘発するためにアフリカツメガエルペトリ皿ラウンド55ミリメートルの直径のid卵。
  5. 脱イオン水1mlにアフリカツメガエルの精巣の1/4を粉砕して精子懸濁液を生成します。
  6. ブラシアフリカツメガエルは、パスツールピペットとピペットの電球を使用して粉砕した精子懸濁液と卵母細胞の重要なステップは：実験の日に、約4:30 pmに受精反応を行います。
  7. 55ミリメートル水で希釈した1％アガロース（水）でコーティングされたペトリ皿で​​NAM / 10で21℃で培養胚（ソリューションについては表3を参照）。
  8. システイン/ HCL（表3）を使用して45分後の脱ゼリー胚。注：21℃では、胚は、90分後に2細胞期に到達し、その後20分毎に切断します。

5.マイクロインジェクションアフリカツメガエル胚

  1. 1のX 90ミリメートルのガラスキャピラリーとナリシゲPC-10 2段ガラスマイクロピペットプラーを使用して、注射用マイクロピペットを引き出します。先端の細い（1ミクロン未満のディアメを達成するために経験的に設定を調整しますTER）。
  2. 繰り返し時間のデジタル設定された期間のために調整された圧力を適用することによって、液体の正確なボリュームを提供するために（例えば、ハーバードAppartaus PLI-100ピコインジェクター）ガスマイクロインジェクターにマイクロピペット（針）を取り付けます。レチクルまたは較正スライドを使用して決定されるような1.25〜10ナノリットルの容量を提供するために空気圧を調整します。
  3. コー​​ト1％アガロース（水）の5 mlの55 mmのシャーレ。皿の外にアガロースの35〜35ミリメートルの正方形をカットし、この胚を顕微注入するための安定した表面を提供します。
  4. 移植胚NAM / 3 +フィコール（表3）に、注射皿に移動します。
  5. 彼らは実験に必要な段階に達すると動物半球に胚を注入します。
    1. 、細胞表面上のGFPタグ付けされたリガンドの分布を分析セル当たり2細胞期、10nlで双方向横方向に胚を注入します。 Wnt8a-HA-EGFPのために、以下に示す例のmRNAの希釈。重要なステップ：すべてのmRNAがSTの濃度ことを確認してください400 ngの/μLでアート。
      注：注入されるmRNAの量は、濃度を試験し、蛍光リガンドを可視化するのに必要な最小量を求めることによって経験的に決定される必要があります。抗HA抗体を用いたウエスタンブロッティングのmRNAが2つの異なる蛍光タグ付けされたリガンドの比較を可能にするために同様のレベルに変換されることを決定するために不可欠なステップです。我々はFellgett ら 、2015年にWnt8a-HA-EGFPおよびWnt11b-HA-EGFPのためにこれを行っています。
      注：（候補調節因子のためのものなど、コード）を注入するmRNAの効果を評価する場合、典型的な制御は、追加の任意の効果を制御するために、兄弟胚に、例えば、LacZのような非アクティブRNAを注入することです胚における転写産物。
      1. 100 ngの/μlに濃度を低減するために、分子グレードの水で4（1μlの+3μlのをdH 2 O）でmemRFP mRNAの1を希釈します。
      2. 4（1μlの+3μlのをdHにWnt8a-HA-EGFP mRNAの1に希釈100ng /μlに濃度を低減するために、分子グレードの水で2 O）。
      3. Wnt8a-HA-EGFP mRNAと1：1の比率でmemRFPのmRNAを混ぜます。
      4. コントロールのmRNAのLacZまたは、Sulf1などの変調器のいずれかと1：1の比率で5.5.1.3からmRNAを混ぜます。
      5. 細胞当たりのmRNAの10nlと2細胞期（20nlの合計）で、左右の胚を注入します。注：これは、m個のEMの RFPの250頁になり、Wnt8a-HA-E GFPの250頁、Wnt11b-HA-Eの GFPおよびLacZまたはSulf1 mRNAの2 ngの500 pgの各セルに注入されます。
    2. GFPの拡散を解析するために、細胞当たり1.25 NL、一緒に16-32細胞段階におけるこのようなmemRFPなどの系統マーカーとリガンド-GFPのmRNAのコーディングを注入し、リガンドをタグ付け。
    3. リガンド拡散の任意の潜在的なモジュレーターの効果を分析するために、共同注入mRNAは、リガンドと系統トレーサーと一緒に変調器をコードします。また、近隣の細胞を注入：GFPタグ浮標付き投げ荷をコードするmRNAのものをDおよび系統トレーサー（memRFP）と変調器と異なる系統のトレーサー（memCerulean）をコードするmRNAと他の。
  6. 12.5℃のインキュベーターや文化翌日まで、Nieuwkoopとフェーバー（NF）ステージ8に胚を移します。

6.切除動物キャップ外植

  1. 1％アガロース（水）5mlで被覆された55 mmのペトリ皿に移植胚。 NAM / 2（表3）と料理を記入してください。
  2. 。 重要なステップをタングステン針を使用して、円形のアニマルキャップをしてください。 これらは、より良い癒し、画像に容易になりますように、この段階で大規模なキャップを取り、ない収斂伸長が発生しないことを確認するために、制御キャップを保ちます。
  3. 4時間21℃で1％アガロース（水）でコーティングされた55ミリメートルペトリ皿、培養胚に、動物の外植片を移し重要なステップ：4時間のインキュベーションは、蛍光タンパク質は成熟することを可能にするために必要とされます。
  4. PVC insulatioの二つの層を下に貼り付けることにより、レリーフスライドを生成します顕微鏡スライド上に、n個のテープ。アニマルキャップを装着するためのチャンバを残すために、テープのうち、10ミリメートルの長方形で14ミリメートルをカット重要なステップ：矩形を切断する前に、徹底的にスライド上にテープの両方の層を平らに。
  5. ピペットリリーフスライドにNAMの2つの別個の滴/ 2（表3）、ドロップあたり約30μlの。
  6. カットオフP20チップを用いてリリーフスライドに動物の外植片を移し、頂端側を上に向くように配向します。注：各スライドは10〜15アニマルキャップを保持することができる重要なステップ：この段階では、動物のキャップは、部分的に治癒している必要があり、これは彼らがあまり繊細で、ピンセットを用いて方向付けできることを意味します。
  7. ゆっくりリリーフスライド上にカバーガラスを下げ、カバースリップを20分間乾燥させる重要なステップを：アニマルキャップのサイズは非常に重要です;。キャップはカバーガラスがリリーフスライド上に降下したとき、それはPRに十分なアニマルキャップ細胞の頂端膜を圧縮することは十分な大きさで確保画像に平坦な表面をoduce。アニマルキャップが小さすぎると、まだ、その後1層のPVCテープを減らします。
  8. マニキュア液を使用してスライドをシール重要なステップ：PVCテープもそれが上げるとスライドを台無しにする減衰になるためならば救済スライドを密封するためにあまりにも多くのマニキュア液を使用しないでください。
  9. 暗所で20分間乾燥リリーフスライドと、彼らは、画像への準備ができている、一般的に動物のキャップは、一度スライドに封入された4〜6時間、健康を維持します。

7.イメージング

注：画像は、倒立型共焦点顕微鏡を用いて行きました。ラムダモードは、この重複の署名を持つ複数のフルオロフォアを使用することが許可されたように、撮像のために選択され、そしてスキャンの間の潜在的な試料移動の問題を除去しました。

  1. 低倍率の対物レンズを使用して外植片がより高い解像度イメージング用の63X / 1.4油浸対物レンズに切り替えて下さい。
  2. 必要なレーザーのスイッチを入れ、この例の405レーザーはmemCeruleanを励起するために使用された、レーザ488は、GFPを励起するために使用され、レーザー561は、405と561分の488、ダイクロイックミラーを用いmemRFPを励起します。
  3. （ - 32ビン禅2011、選択ラムダモードで）ラムダモードを使用します。
  4. （0.6xに）画像をズームアウト、より広い視野を可能とlasers.To 405nmの、488nmのと561nmを選択します。
  5. 所望の画像サイズ（220nmのピクセルサイズ1024×1024このデータセットに使用された）にフレームサイズを設定します。
  6. 信号対雑音比を増加させるために典型的には4〜8、平均設定。
  7. （このデータセットに使用された561nmのレーザーに応じて1エアリーユニット）ピンホールを最適化します。
  8. 。 重要なステップをレーザパワーを最適化するすべてのフルオロフォアは、必要な電圧とゲインの量を最小限に抑えながら、32検出器アレイを用いて検出することができるように波長405nm、488nmのレーザー及び561nmのバランスをとります。
  9. memCerulean、GFPとmemRFPから放射される光を収集します。この作品の光のために〜すべてのを集めました415-720nmから10nmの、より大きな収集間隔も可能である（ 例えば 、毎〜20 nm）の。

8.画像解析

  1. GFPタグ付きリガンドの細胞表面発現に対する調節因子の影響を調査
    注：以下の手順では、分析は、我々の研究室で行われたかの詳細なガイドです。エンドユーザーが手動手順の一部を除去するために、ImageJのかFIJIスクリプトを記述することによって、プロセスを合理化することができます。
    重要なステップ：これは、最後の実験は、最終的な実験に使用される複数のフルオロフォアのORM実効スペクトルアンミキシングをPERFするために実行されるのと同じ条件で使用される任意のフルオロフォアのスペクトルエンドユーザーサンプルが重要です 。
    分析の2つの主要なタイプは、このセクションで実行されます。
    1. 細胞膜との共局在のWnt-HA-EGFPの画素の総数を算出します。
      1. Unmix緑、ZENソフトウェアで、これらの蛍光体の単回注射から採取したスペクトルを用いて、赤と紺碧のチャンネル。以下の手順のすべてで使用するために別のLSMドキュメントとしてこれらの画像を保存します。
      2. オープンLSMは、画像編集ソフトウェアでファイルを直接。注：以下の手順は、フィジーのイメージJ.のためのものです
      3. これは自動的に別々のチャンネルに画像を分割し、画像シーケンスドキュメントとしてLSM画像を保存します。
      4. データを分析するために使用されるスクリプト解析ソフトウェアのスクリプトと同じフォルダに画像シーケンスを保存します（実際のスクリプトのための補助的なコードファイルを参照してください）。注意：以下の手順は、Matlabのためのものです。
      5. スクリプト解析ソフトウェアを開き、スクリプトが書かれているディレクトリを開きます。
      6. 場所分析の下にファイル名を入力して、ソフトウェアがファイル名を取得し、分析を実行します。
        注：ファイル名は、それぞれのIMAのためImageA0000とImageA0001を読み込みますGE。スクリプト解析ソフトウェアは、画像がマスクとして0001をマークし使用し、このマスクを用いて共局在画像0000内のピクセルの割合を分析します。
      7. （人口細胞膜として注釈）割合共局在番号を取り、スプレッドシートにこれをコピーします。注意：次の手順は、Excelのためのものです。
      8. 絶対または相対値のいずれかとして、棒グラフのパーセンテージ共局在番号をプロットします。
    2. Wnt-HA-EGFPの涙点の数、大きさや形状を分析します。
      1. 画像編集ソフトで直接混合されていないLSMファイルを開きます。注：以下の手順は、フィジーのイメージJ.のためのものです
      2. その別々のチャンネル（画像>カラー>スプリットチャンネル）に各画像を分割します。
      3. しきい値のWnt-HA-EGFPおよび膜マーカーチャンネル（画像>>自動しきい値を調整します）両方の重要なステップ：overexposingことなく、代表画像を生成する1参照するしきい値の数を試してみてくださいチャンネル。
      4. （マスクを作る>プロセス>バイナリ）マスクに膜マーカーチャネルを変換します。
      5. このマスクを反転（[編集]> [反転）。
      6. 上記のようにマスクにのWnt-HA-EGFPの涙点に変換します。
      7. （セットトップボックス、下のボックス内膜マスクの処理>画像の計算>のWntマスク）リガンド-GFPマスクからの膜マーカーマスクを引きます。
      8. 分析粒子関数を使用します。ここから、必要なパラメータを選択し、（を分析>を分析粒子）のデータを分析。
      9. スプレッドシートに粒子、平均粒径と円形度データ数をコピーし、これらのデータからグラフをプロットします。注：この分析では、唯一の0.1-10μm2サイズとの間で粒子を分析した、制限は粒子円形に配置されませんでした。この命令は、Excel用です。
  2. リガンド拡散の範囲を分析します
    1. 共焦点イム内のすべての非混合の画像を開きますソフトウェアを老化して、生データとして、またRGB画像として、TIF形式のファイルをエクスポート注：この命令は、禅liteの2011年のある重要なステップは：その距離ができるように画像の少なくとも一方にスケールバーを含めます分析中に計算。
    2. 開いた画像を、画像解析ソフトで解析することができます。注意：以下の手順では、 右の画像の背景をクリックして、新しいレイヤーを作成するには、「背景からレイヤー」を選択します）Photoshopの8.2.3のためのものです。
    3. リガンドのみ-GFPチャネルが見える（レイヤー>新規調整レイヤー>チャンネルミキサー）であるように、0に膜マーカーチャネルを設定します重要なステップ：分析されている画像に新しい調整レイヤーをクリップ、新しいレイヤーをクリップするためのオプションこの画像にチャンネルミキサーオプションをクリックした後にチェックボックスとして利用可能です。
    4. 新しいワークスペースを開きます。 RGBカラーにインチあたり300ピクセルの解像度とカラーモ​​ード（ファイルの設定>[新規]> [クリップボード）。
    5. コピー1つのワークスペースに分析されているすべての画像（画像をクリックすると、それが制御し、Altキーを押しながら、ワークスペースに画像をドラッグして、制御を保持することにより、チャンネルミキサーをクリップしています）。
    6. 各画像の拡散の最大長さは、細胞が左側に向いたWnt-HA-EGFPを発現する、水平軸に沿って測定することができるように、すべての画像を向けます。
    7. TIFなどの作業スペースを保存し、画像解析ソフトウェアでこれを開きます。注：以下の手順は、フィジーのイメージJ.のためのものです
    8. ROIマネージャウィンドウを開きます（[解析]> [ツール]> [ROIマネージャー）。
    9. 最初の画像に四角形を描画し、四角形の正確なサイズを指定することができます（長方形ツールを選択し、任意の四角形を描画> [編集]> [選択]>指定）。注：650×100ピクセルの長さ×幅の大きさは、この研究で使用しました。
    10. Wnはを表現するドメインの非常に端に長方形を配置しますT-HA-EGFP。 Wnt-HA-EGFP拡散の最大距離と領域の上に四角形を配置します。重要なステップ：でも膜マーカーなしのWnt-HA-EのGFPを発現する領域が原因で、バックグラウンドの蛍光に表示されるはずです。その後、原画像を相談していない場合。
    11. 右側のボックスに10μMのシフト。画像の1つに含まスケールバーの長さを測定することにより、マイクロメートルの数を決定する（スケールバー>を分析>設定スケールをトレース線を引きます）。注：これはピクセル単位で10μMのための値を提供します。
    12. ROIマネージャ]ウィンドウの[追加]ボタンを押すことで、ROIマネージャーにボックスを追加します。
    13. 四角形を移動するために長方形ツールに戻ってクリックすることにより測定されるべき次の画像に矩形を移動します。繰り返し8.2.10-11を繰り返します。
    14. 一旦、全てのパネルは、ROIマネージャーメニュー（ROIマネージャ>その他>多重描画（multiplot）>リスト）から、選択multiplotのが測定されています。
      注：データは、WntピクセルINTEを表し（ピクセル単位で測定したX、）水平軸に沿った距離の増加とともにnsity（Y）。 Yの値は、点Xにおけるリガンド-GFPの平均信号強度であり、平均値は、各X値のY軸方向の全画素から計算されます。従ってボックス高く、より多くのピクセルがこの平均値を生成するために分析されます。 （Y軸）に小さなボックスが騒々しいとなります。背の高いボックスは非常に低い平均ピクセル強度を持つことになります。
    15. スプレッドシートとそれに応じて再ラベルにmultiplotのボックスからデータをコピーします。注意：次の手順は、Excelのためのものです。
    16. これは、リガンド-GFPを発現する細胞からのバックグラウンド蛍光を示し、グラフを歪めるとして各分析からのデータの最初の10-20μmを捨てます。
    17. 科学的な分析やグラフ作成ソフトウェアを開き、新しいノートブックを作成します。注意：以下の手順は、SigmaPlotの13のためのものです。
    18. O水平番号をダブルクリックすることで、データの列の必要な数のラベルを付けワークシートをNと、それらをμm単位の距離を標識、Wnt8a-HA-EGFPおよびWnt11b-HA-EGFP。
    19. 科学的な分析やグラフ作成ソフトウェア内の関連する列にスプレッドシートからデータをコピーします。
    20. 散布図を作成します（グラフの作成>スキャッタ>複数の散布>を選択し、X多くY> Y値のX>を選択Wnt8a-HA-EGFPおよびWnt11b-HA-EGFP>完了する距離列を選択します）。
    21. 散布図にWnt8a-HA-EGFP点を左クリックしてWnt8a-HA-EGFP曲線に回帰分析を実行します。点のすべてが強調表示する必要があります。分析>回帰ウィザードをクリックします。
    22. その後、次のキーを押し曲線方程式カテゴリ（指数関数的減衰）と式名（シングル、3パラメータ）を選択します。
    23. 曲線が装着されるべきであるために、XとYの値を選択します（データは以前に強調された場合、これは自動的に行われる必要があります）、[次へ]を押します。
    24. 数値出力オプションまでウィザードを続行ページ、[レポート作成]を確認してくださいは、次のキーを押しチェックされています。注意：近似曲線のパラメータは、レポートの1に表示されます*。
    25. グラフのオプション]ページで「タイトルをグラフに数式を追加する」を確認してくださいは、仕上げを押してチェックされています。注：ウィザードは、報告書1 *とグラフ1 *ノートブックの上部のタブを作成しています。また曲線は（8.2.20）で生成したグラフに追加されています。
    26. 繰り返しWnt11b-HA-EGFPの曲線に合わせて8.2.21-8.2.25ステップの重要なステップ：データに複数の式カテゴリと式の名前を当てはめてみてください。注：ベストフィットの曲線は、正方形の最低残留合計で最高のR 2値を生成する必要があります。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

結果

蛍光タグ付きタンパク質を発現アニマルキャップの外植片の共焦点分析は、異なる実験条件の下でのリガンド分布を可視化するための効果的なシステムを提供します。一例では、GFPの分布のShhは、（ 図1）が示されているタグを付けました。 2細胞期では、 アフリカツメガエル胚は対照mRNAとまたはmRNAはSulf1、細胞表面ヘパラン硫酸を変更し、Shhのモルフォゲン勾配16に影響を与える酵素をコードするとのいずれかで、両方の細胞内に注入されます。これらの胚は32細胞期まで培養し、単一のセルが（系統のトレーサーとして）のShh-GFPとmemRFPをコードするmRNAとの同時注入です。これは、細胞膜つながRFPでマークされているのShh-GFPを発現する細胞のクローンを作成します。胞胚段階で、アニマルキャップの外植片を、共焦点顕微鏡による分析のために採取される。 図1は、制御条件下でのShh-GFPが分泌されることを示し、再外の拡散します祇園は、注入されたmRNAを発現しています。しかし、Sulf1の存在下では、Shhは、GFPは、このサンプ...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

ディスカッション

このプロトコールの重要な部分は、通常、加工分泌され、結合した蛍光部分を有するにもかかわらず、受容細胞における応答を誘発することができる生物学的に活性なリガンドを生成しています。これは、蛍光タグを付けた遺伝子産物は、適切なアッセイを用いて生物学的に活性であることを確立することが重要です。 Shh-GFPについては、PTC1の発現を活性化する能力は、16を確認しました。 Wnt8a単一腹側割球20-21に発現された場合、二次軸を誘導する非常に強力な能力を有しており、Wnt8a-HA-EGFPは、この生物学的活性を保持することが示されました。 Wnt11bは収斂伸長21-22を受けてから、アクチビン処理した外胚葉外植片を阻害し、Wnt11b-HA-EGFPはまた、その生物学的活性を保持している17。タグなしのタンパク質と同等の応答を誘導するためにタグ付けされたリガンドの能力は、蛍光性リガンドを用いた実験に基づいて結論をbになりますことを示唆しています通常のタンパク質に関連する電子。リガンドと蛍光タンパク質との間のHAエピトープの追加は、W...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

開示事項

著者には競合する金銭的利益はありません。

謝辞

この作品は、MEP（BB / H010297 / 1）、SARにBBSRCクォータの学生の身分、およびSWFへのMRC学生の身分にBBSRCの助成金によって賄われていました。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
アガローメルフォードMB 1200
酢酸アンモニウムアンビオンMegascript SP6 キット AM 1330
重炭酸塩VWR インターナショナルRC-091
硝酸カルシウムシグマC13961
キャップ アナログ (m7G(5'))アプライド バイオシステムズAM 8050
クロロホルムシグマC 2432
L-システイン塩酸塩一水和物SigmaC7880
dNTPsInvitrogen18427-013
エチレンジアミン四酢酸 (EDTA)SigmaO3690
エタノールVWR International20821.33
Ficoll 400SigmaF 4375
Fiji image J software無料ダウンロード
http://fiji.sc/Fiji ゲンタマイシンメルフォードG 0124
氷酢酸フィッシャーサイエンティフィックA/0400/PB17
ガラスカバースリップ No.1.5 科学実験室用品22X22-SGJ3015. 22X50-SGJ3030 
ガラス針引き機ナリシゲ成茂 PC -10
ガラス引き針ドラモンドサイエンティフィック3-000-203-G/X
ヒト慢性ゴナドトロピン (HCG)インターベット
イソプロパノールフィッシャーサイエンティフィックP/7500/PB17
塩化リチウム (LiCl)シグマL-7026
LSM710 およびZenソフトウェア(2008-2010)Carl Zeiss
MatlabソフトウェアMathworks
http://uk.mathworks.com/ 分子グレードの水 フィッシャーサイエンティフィックBP2819-10
ネイルワニス ブーツバーコード3600530 373048
分光光度計Lab.tech 国際ND-1000 / ND8000
シャーレ(55 mm)VWR国際391-0865
フェノール-クロロホルムシグマP3803
フォトショップソフトウェアAdobehttp://www.photoshop.com/products
高忠実度のDNAポリメラーゼとバッファ BiolabsM0530S バッファー - M0531S
塩化カリウム (KCl)Fisher ScientificP/4280/53
PVC 絶縁テープOnecallSH5006MPK
ゲル抽出キット QiagenS28704
制限酵素バッファーRocheSuRE/CUT バッファーセット 11082 035 001
RNAse-free DNAsePromegaME10A
スチールバックシングルエッジブレードPersonna66-0403-0000
塩化ナトリウム(NaCl)Fisher Scientific27810.364
SP6 転写キットAmbionAM1330
スライド サーモフィッシャーSHE 2505
トリスベースInvitrogen15504-020
タングステン針自家製
Zen lite ソフトウェアカールツァイス無料ダウンロード  http://www.zeiss.co.uk/microscopy/en_gb/downloads/zen.html
ス

参考文献

  1. Shen, M. M. Nodal signaling: developmental roles and regulation. Development. 134 (6), 1023-1034 (2007).
  2. Shimmi, O., Newfeld, S. J. New insights into extracellular and post-translational regulation of TGF-beta family signalling pathways. J Biochem. 154 (1), 11-19 (2013).
  3. Pownall, M. E., Isaacs, H. V. FGF Signalling in Vertebrate Development. 1, Colloquium Series on Developmental Biology. 1-75 (2010).
  4. Clevers, H. Wnt/beta-catenin signaling in development and disease. Cell. 127 (3), 469-480 (2006).
  5. Ingham, P. W., McMahon, A. P. Hedgehog signaling in animal development: paradigms and principles. Genes and Development. 15 (23), 3059-3087 (2001).
  6. Wolpert, L. One hundred years of positional information. Trends in Genetics. 12 (9), 359-3564 (1996).
  7. Rushlow, C. A., Shvartsman, S. Y. Temporal dynamics, spatial range, and transcriptional interpretation of the Dorsal morphogen gradient. Current Opinion in Genetics and Development. 22 (6), 542-546 (2012).
  8. Erickson, J. L. Formation and maintenance of morphogen gradients: an essential role for the endomembrane system in Drosophila melanogaster wing development. Fly (Austin). 5 (3), 266-271 (2011).
  9. Towers, M., Wolpert, L., Tickle, C. Gradients of signalling in the developing limb. Current Opinions in Cell Biology. 24 (2), 181-187 (2012).
  10. Dessaud, E., McMahon, A. P., Briscoe, J. Pattern formation in the vertebrate neural tube: a sonic hedgehog morphogen-regulated transcriptional network. Development. 135 (15), 2489-2503 (2008).
  11. Briscoe, J., et al. Homeobox gene Nkx2.2 and specification of neuronal identity by graded Sonic hedgehog signalling. Nature. 398 (6728), 622-627 (1999).
  12. Ribes, V., et al. Distinct Sonic Hedgehog signaling dynamics specify floor plate and ventral neuronal progenitors in the vertebrate neural tube. Genes and Development. 24 (11), 1186-1200 (2010).
  13. Freeman, S. D., Moore, W. M., Guiral, E. C., Holme, A., Turnbull, J. E., Pownall, M. E. Extracellular regulation of developmental cell signaling by XtSulf1. Developmental Biology. 320 (2), 436-445 (2008).
  14. Tao, Q., et al. Maternal wnt11 activates the canonical wnt signaling pathway required for axis formation in Xenopus embryos. Cell. 120 (6), 857-871 (2005).
  15. Chamberlain, C. E., Jeong, J., Guo, C., Allen, B. L., McMahon, A. P. Notochord-derived Shh concentrates in close association with the apically positioned basal body in neural target cells and forms a dynamic gradient during neural patterning. Development. 135 (6), 1097-1106 (2008).
  16. Ramsbottom, S. A., Maguire, R. J., Fellgett, S. W., Pownall, M. E. Sulf1 influences the Shh morphogen gradient during the dorsal ventral patterning of the neural tube in Xenopus tropicalis. Developmental Biology. 391 (2), 207-218 (2014).
  17. Fellgett, S. W., Maguire, R. J., Pownall, M. E. Sulf1 has ligand dependent effects on canonical and non-canonical WNT signalling. Journal of Cell Science. 128 (7), 1408-1421 (2015).
  18. Dytham, C. Choosing and using statistics : A biologist's guide. , Blackwell publishing. Oxford. (2005).
  19. Fay, M. P., Proschan, M. A. Wilcoxon-Mann-Whitney or t-test? On assumptions for hypothesis tests and multiple interpretations of decision rules. Statistical Surveys. 4, 1-39 (2010).
  20. Christian, J. L., McMahon, J. A., McMahon, A. P., Moon, R. T. Xwnt-8, a Xenopus Wnt-1 /int-1-related gene responsive to mesoderm-inducing growth factors, may play a role in ventral mesodermal patterning during embryogenesis. Development. 111 (4), 1045-1055 (1991).
  21. Du, S. J., Purcell, S. M., Christian, J. L., McGrew, L. L., Moon, R. T. Identification of distinct classes and functional domains of Wnts through expression of wild-type and chimeric proteins in Xenopus embryos. Molecular and Cellular Biology. 15 (5), 2625-2634 (1995).
  22. Tada, M., Smith, J. C. Xwnt11 is a target of Xenopus Brachyury: regulation of gastrulation movements via Dishevelled, but not through the canonical Wnt pathway. Development. 127 (10), 2227-2238 (2000).
  23. Williams, P. H., Hagemann, A., Gonzalez-Gaitan, M., Smith, J. C. Visualizing long-range movement of the morphogen Xnr2 in the Xenopus embryo. Current Biology. 14 (21), 1916-1923 (2004).
  24. McDowell, N., Zorn, A. M., Crease, D. J., Gurdon, J. B. Activin has direct long-range signalling activity and can form a concentration gradient by diffusion. Current Biology. 7 (9), 671-681 (1997).
  25. Chen, Y., Schier, A. F. The zebrafish Nodal signal Squint functions as a morphogen. Nature. 411 (6837), 607-610 (2001).
  26. Miller, J. R., Rowning, B. A., Larabell, C. A., Yang-Snyder, J. A., Bates, R. L., Moon, R. T. Establishment of the dorsal-ventral axis in Xenopus embryos coincides with the dorsal enrichment of dishevelled that is dependent on cortical rotation. Journal of Cell Biology. 146 (2), 427-437 (1999).
  27. Schohl, A., Fagotto, F. B. eta-catenin MAPK and Smad signaling during early Xenopus development. Development. 129 (1), 37-52 (2002).
  28. Muller, P., et al. Differential diffusivity of Nodal and Lefty underlies a reaction-diffusion patterning system. Science. 336, 721-724 (2012).
  29. Yu, S. R., Burkhardt, M., Nowak, M., Ries, J., Petrasek, Z., Scholpp, S., Schwille, P., Brand, M. Fgf8 morphogen gradient forms by a source-sink mechanism with freely diffusing molecules. Nature. 461, 533-536 (2009).
  30. Janda, C. Y., Waghray , D., Levin, A. M., Thomas, C., Garcia, K. C. Structural basis of Wnt recognition by Frizzled. Science. 337, 59-64 (2012).
  31. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early development of Xenopus laevis: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2010).

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

再版と許可

このJoVE記事のテキストまたは図の再利用許可をリクエスト

許可をリクエスト

タグ

Wnt Shh

関連記事