方法論記事

細菌人工染色体：プラス鎖RNAウイルスの研究のための機能ゲノミクスツール

DOI：

10.3791/53164

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2015年12月29日

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1Department of Animal, Dairy, and Veterinary Sciences, Utah Science Technology and Research, College of Agriculture and Applied Sciences, Utah State University

この記事について

サマリー

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ここでは、日本脳炎ウイルスの正鎖ゲノムRNAの完全長cDNAを含む感染性細菌人工染色体を作成するためのプロトコルが提示されます。このプロトコルは、他のポジティブストランドRNAウイルスの機能的cDNAを構築するために使用できるため、ウイルス生物学を研究するための強力なゲノムツールとなります。

要約

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リバースジェネティクスは、クローン化されたcDNAから感染性ウイルスを完全に救出するアプローチであり、そのゲノムが細胞のmRNAと同じ極性を持つポジティブストランドRNAウイルスの分野に革命をもたらしました。cDNAベースのリバースジェネティクスシステムは、ウイルスのゲノムRNAを直接操作できる独創的な方法であり、それにより、ウイルスの複製と病因におけるウイルスRNA要素と遺伝子産物の両方の分子および遺伝学的研究のための組換えウイルスを生成します。また、遺伝的に定義されたワクチンや外来遺伝子の送達のためのウイルスベクターの開発を可能にする貴重なプラットフォームを提供します。しかし、日本脳炎ウイルス(JEV)など多くのポジティブストランドRNAウイルスでは、クローニングされたcDNAが不安定であり、機能的なcDNAの構築と増殖に大きな障害となっています。ここでは、本レポートでは、ウイルスRNAの単離、cDNA合成、cDNAサブクローニングと修飾、完全長cDNAの組み立て、cDNAの線形化、in vitroの一般的な実験手順を使用して、細菌人工染色体(BAC)として遺伝的に安定した完全長感染性JEV cDNAを作成および増幅する際の戦略的考慮事項について説明しますRNA合成、およびウイルスの回復。このプロトコルは、さまざまなポジティブストランドRNAウイルス、特にゲノムが>10kbのウイルスの完全長cDNAをBACベクターにクローニングするのに適用できる一般的な方法論を提供します。そこから感染性RNAをバクテリオファージRNAポリメラーゼでin vitroで転写できます。

概要

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RNAのウイルス学者は、1970年代後半における組換えDNA技術の出現は、その後、RNAウイルスの遺伝子操作のための細菌中でのプラスミドとして増殖することができたcDNAクローンの中にウイルスRNAゲノムを変換することができた。1最初のRNAウイルスであることがクローン化された分子は、バクテリオファージQβ、 大腸菌に感染するプラス鎖RNAウイルスでした。 大腸菌に導入された場合QβゲノムRNAの完全なcDNAコピーを含むプラスミドは、感染Qβファージを生じましたコリ 2その後すぐに、この技術は、ポリオウイルス、ヒトおよび動物のプラス鎖RNAウイルスに適用しました。ポリオウイルスのゲノムRNAの完全長cDNAを有するプラスミドは、感染哺乳動物細胞にトランスフェクトし、感染性ビリオンを産生することができたときに3を 、クローン化したcDNAを、ウイルスRNA複製を開始するために細胞内で転写されるべきこの「DNA発射」アプローチでは。しかし、それは、転写が開始される方法および転写産物が正しいウイルス配列にどのように処理されるかは不明です。この懸念は、代替「RNA-立ち上げ」の開発につながっているのアプローチ、ウイルスRNAゲノムの完全なcDNAコピーは 、Eによって認識されるプロモーター下にクローニングされます宿主細胞に導入された場合、完全なウイルス複製サイクルを受ける定義の5 'および3'末端を有する、インビトロでの合成RNAの産生のための大腸菌やファージRNAポリメラーゼ。このアプローチの最初の成功は、ブロムモザイクウイルスについて報告された4,5 、6,7植物のプラス鎖RNAウイルス。それ以来、RNA-打ち上げのアプローチは、カリシウイルス、アルファウイルス、フラビウイルス、アルテ、およびコロナウイルスなどのプラス鎖RNAウイルス、広範囲のために開発されました。1,4,5,8-

DNA-との両方で、FULの建設を逆遺伝学システムをRNA発射、〜10の大RNAゲノムリットル長cDNAクローンは、ポジティブ鎖RNAウイルスの感染性DNAまたはRNAを生成するための鍵であるが、ウイルスゲノムのサイズが大きくなるように、かなりの技術的な課題となる。具体的には9-17 -32キロバイトは、完全長cDNAのクローニング機能には3つの大きな障害を提示している。18 RT-PCRの忠実度は、ウイルスRNAの長さに反比例するので、最初の難しさは、忠実なのcDNAコピーの合成です。長いRNA分子がE.で不安定なプラスミド中のcDNA断片を作製することが可能な、予期しない配列を含有する可能性が高いので、第二のハードルは、潜在的に毒性の配列の存在であります大腸菌 。それは> 10 kbのウイルスのcDNAインサートを収容することができるクローニングベクターを見つけることは困難であるため、第三の、最も重要な問題は、適切なベクターが利用可能です。過去30年間にわたり、これらの障壁は、酵素学、方法論、ANにはいくつかの進歩によって克服されていますDのvectorology。これらのうち1,4,5,8は 、最も有望で革新的な開発は、大きなプラス鎖RNAウイルスなどの感染細菌人工染色体（BACの）のクローニングです。 BACベクターは 、Eに基づいて、低コピープラスミドクローニング（1-2コピー/細胞）であります〜120〜350キロバイトの平均DNAインサートサイズの大腸菌出生率、19-21 DNA断片は、一般的なクローニングベクターへのクローニングと同様にBACベクター中に挿入されます。結果としてBACクローンは 、Eの多くの世代にわたって安定しています大腸菌。現在までに22,23、BAC技術は、3つの正鎖RNAウイルスファミリーの> 10のメンバー、 すなわち 、 フラビウイルス科 、24-29 アルテ 、30とコロナのための感染性cDNAクローンを作成するために使用されています。9,16,17 、31,32

例として、日本脳炎ウイルス（JEV）を使用して、本研究は、することができ、詳細な手順を報告プラス鎖RNAウイルスの様々な遺伝的に安定、全長感染性BACを構築するために使用されます。で発生JEVは、JEV感染が深刻なしばしば致命的な神経疾患日本脳炎を引き起こす可能性がヒトでは人獣共通感染蚊ベクトルによって鳥、豚、および他の脊椎動物のホスト間の自然の中で伝送されるフラビウイルス33。34,35です（JE）、36 〜50,000-175,000臨床例推定年間発生率とアジアと西太平洋、37,38の一部。39,40 JEVのゲノムは、〜11-kbの、一本鎖、正センスRNA分子であり、で構成されてい5における2つの非コード領域（のNCR） 'および3'末端により隣接する単一のオープンリーディングフレーム（ORF）41,42 ORFは、指定された、10の個々のタンパク質を生成する宿主およびウイルスのプロテアーゼによって切断されるポリタンパク質をコードC、のprM、E、NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、およびNS5また、N末端 ​​からC末端への方向インチ34,43,44、電子NS1（NS1 '）のXtendedでは、フォームがコドンNS2Aの8-9でのことで-1リボソームフレームシフト表現されている。これら11タンパク質のうち45,46、3つの構造タンパク質（C、のprM、およびE）は、感染の形成のために不可欠ですビリオン、47,48と残りの8非構造タンパク質（NS5にNS1、およびNS1 '）はウイルスRNA複製、49-51粒子アセンブリ、52-56と自然免疫の回避のために非常に重要である。57〜59の両方の5'および3 「のNCRは、保存された一次配列を含み、ウイルスRNA複製を調節するために重要であるRNA二次/三次構造、60〜62を形成する 。63,64

このプロトコルは、SA 14 -14-2全長のJEVの感染性BACを生成するためのツール、方法、および戦略について説明します。28この機能BACクローンは、プロモーターに含まれるJEVゲノムRNAの完全なcDNAコピー、65が含まれています SP6 RNAポリメラーゼのための上流ウイルス5 '末端およびin vitroでのランオフ転写のためのウイルスの3'末端の下流の独特のXba I制限部位の。このBAC技術は、プラス鎖RNAウイルスの配列に完全に機能するcDNA分子クローンの構築に適用可能です。

プロトコル

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注： 図1は 、BACとして全長の感染性を有するJEV cDNAの構築のための戦略を提示し28、表1は、このプロトコルで使用されるオリゴヌクレオチドのリストを提供します28。

1.細胞培養上清中のJEV粒子からウイルスRNAを抽出

  1. JEV SA 14 -14-2、バイオセーフティレベル2の封じ込めを必要とライブ日本脳炎ワクチンウイルスを含む細胞培養培地で開始します。
    注意：ウイルス力価は、約1〜3×10 6プラーク形成単位/ mlです。
  2. 前JEV SA 14 -14-2と協力して、すべての標準的な微生物学的慣行、安全装置、および研究施設のために必要なバイオセーフティトレーニングしてください。
  3. フェノールおよびグアニジンイソチオシアネート66（ 図1A）の単相溶液を用いて、ウイルス含有細胞培養培地のアリコートからウイルスRNAを精製します。
    1. 広告D 1.7ミリリットルマイクロチューブに培養上清200μlに単相試薬600μlの。 30秒間激しくチューブを手で、振盪し、室温で5分間インキュベートすることによって混合物を均質化します。
    2. 均質化されたサンプルにクロロホルム160μlのを追加します。手揺れ15秒激しくチューブを、室温で2〜3分のためにそれを残して完全に混合します。
    3. 遠心二つの液相、 すなわち 、下層の有機相と上方の水相の分離をもたらし、4℃、で15分間13,400×gでの総溶解液。新しいマイクロチューブにRNAを含有する上側の水相（未満200μl）を転送します。
    4. 5μgの/μlのグリコーゲンの1μlの100％イソプロパノール400μlのを追加し、室温で10分間インキュベートすることにより、RNAを沈殿させます。
    5. 遠心機で4℃で10分間13,400×gでの混合物。上清を捨て、5にパルスボルテックス3により75％エタノール1mLで、RNAペレットを洗浄時間および4℃で5分間、13,400×gで遠心分離します。
    6. 10分間RNAペレットを空気乾燥させ、 の dH 2 Oの40μlのそれを溶かします使用するまで-80℃で抽出したRNAを保管してください。

2.逆転写（RT）-PCRによって全体のウイルスゲノムRNAをスパニング四重複するcDNA断片のセット（F4にF1）を合成します

  1. テンプレートとモロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素の修飾された形態として精製ウイルスRNAの10μlアリコートと20μlのRT反応を実行します。67
    1. 10精製されたRNAのμlを、1μlの10mMのdNTPミックス、1μlの4ピコモル/μlのプライマー、および1μlののdH 2 Oを含む13μlの混合物を設定しますF1用1RT、F2用2RT、F3用3RT、およびF4用4RT：各RT反応のための断片特異的プライマーを使用してください。
    2. 1分間、65℃で5分間氷上で行わ混合物をインキュベートした後、クイックスピンはコンテを収集するために、チューブの底NTS。
    3. 4μlの5×RT緩衝液を追加し、1μlの0.1 M DTT、1μlの40 U /μlのRNase阻害剤、および1μlの200 U /μlの逆転写酵素。ピペッティングにより及び3〜5倍のミックスダウン。
    4. その後、15分間、70℃で試料を熱不活性化、反応を1時間50℃で進行しよう。使用するまで-20℃で合成された第一鎖cDNAを保管してください。
  2. テンプレートと高忠実度熱安定性DNAポリメラーゼ68（ 図1B）などの熱不活性化RT反応の5μlアリコートと100μlのPCR反応を実行します。
    1. RT反応を5μl、20μlの5×PCR緩衝液、4μlの10mMのdNTPミックス、5μlの10μMのフォワードプライマー、5μl​​の10μMのリバースプライマー、1μlの2 Uを含む、氷上で100μlのPCR反応を設定します/μlのDNAポリメラーゼ、および60μlののdH 2 O各PCR reactioためフラグメント特異的プライマー対を使用してN：F1（2573 bp）のための1F + 1R、F2のための2F + 2R（4171塩基対）、F3用の3F + 3R（3922塩基対）、およびF4のための4F + 4R（1798塩基対）。
    2. 下部にその内容を収集するために、指フリッピング管を3〜5倍と遠心簡単により穏やかに混合します。
    3. 次のPCRプロフィールで25〜30サイクル、続いて98℃で30秒間の最初の変性工程で熱サイクルの開始：98℃で10秒、60℃で30秒、および1〜2分（30秒/ 72℃でキロバイト）。分析するまで4℃でPCR産物を保管してください。
  3. 0.5 / mlのエチジウムブロマイド（EtBrを）（ 図2）を含む 0.8％アガロースゲル上の各PCR反応の2-5μlのアリコートを実行します。
    注意：EtBrをが強力な変異原であり、その使用、保管、廃棄の間に観察されるように白衣、安全眼鏡、および着用する手袋、細心の注意が必要です。

pBAC / F4 BにてpBAC / F1を作成する3.サブクローンつのcDNA断片（F1〜F4は）の各BACベクターへY分子クローニング技術

  1. ベクターを消化し、次のように、適切な2つの制限酵素でDNAを挿入します。
    1. 私は〜500 ngのDNAを含む（60μlの総体積でPme I制限酵素でてpBAC / PRRSV / FL（ベクトル）の連続消化、30 pBeloBAC11プラスミドの誘導体（7507塩基対、GenBank登録番号U51113）を、実行していません 、15426-bpのベクター断片が得られる12〜15時間、37℃、で10 Uの酵素、1×消化緩衝液、および1×BSA）。
    2. 私は25で、60μlの（〜1μgのDNAを、20 U酵素、消化緩衝液×1、および1×BSAを含む）の総容量でのSmaIと4のcDNAアンプリコン（挿入）のそれぞれの逐次消化を実行していません °C（SMA I）または12〜15所望の大きさの次の挿入断片を生成する時間、37℃（Not Iで ）：F1（2559塩基対）、F2（4157塩基対）、F3（3908塩基対）、およびF4（1784塩基対）。
  2. 精製所望のベクターおよびゲル抽出によりDNA断片を挿入します。
    1. 0.5 / mlのEtBrをを含む1％低融点アガロースゲル上で二重消化物を分離します。長波紫外線下でアガロースの最小量（通常〜200μl）を用いて所望のDNA断片のバンドを切り取り。
    2. 1.7ミリリットルマイクロチューブにアガロース切除したに等しいTEMバッファの容量（10mMのトリス-Cl、1 mMのEDTA、および10mMのMgCl 2）を追加します 。アガロースが完全に溶融するまで2〜3分ごとにボルテックスしながら、10〜15分間72℃でサンプルをインキュベートします。
    3. 室温で10分間、13,400×gで同じ予め温めバッファ飽和フェノールの量、1分間激しくボルテックスし、遠心分離機を追加します。
      注：この混合物は、下の有機相と上層の水相に分離します。新しいマイクロチューブにDNAを含む上部の水相を転送します。
    4. イソアミルアルコール（24：1）等量のクロロホルム追加13で、1分間ボルテックスし、遠心分離機を、室温で10分間、400×gで。新しいマイクロチューブに上部の水相を転送します。
    5. 10μg/μlの酵母tRNA、3M酢酸ナトリウム1/10容量、および100％エタノール2.5容量の0.5μLを加えます。氷上で20分間、混合物を保管してください。
    6. 室温で10分間、13,400×gで混合物を遠心します。上清を除去し、3〜5回のパルスは、ボルテ​​ックスし、10分間13,400×gで遠心分離することにより、70％エタノール1mlでDNAペレットを洗浄。
    7. 10分間、DNAペレットを空気は、乾燥し、TE緩衝液20μl（10mMトリスClおよび1mMのEDTA [pHは7.6]）の中に溶解します。
  3. 所望のベクターをライゲーションし、T4 DNAリガーゼを用いてDNA断片を挿入します。
    1. ベクターDNAの50〜100 ngの、インサートDNAの〜3倍モル過剰、400 UのT4 DNAリガーゼ、および1×ライゲーション緩衝液を含む20μlの連結反応を設定します。 12〜15時間、16℃でライゲーション反応をインキュベートします。
      注：負のCONTRを含めますオール反応、 すなわち 、並列にのみインサートを含まないベクター。
    2. 4つの別々のライゲーション、（F1用）2559-BPとてpBAC / PRRSV / FLの15426-BP にPme I-Not Iで断片を結合する各、4157-BP（F2用）、3908-BP（F3用）を実行しますか、 4のcDNAアンプリコンの1ののSma I-Not Iで断片（F4用）1784-bpの、てpBAC / F4にサブクローンてpBAC / F1を生成します。
  4. 大腸菌中に連結したDNAをトランスフォームCaCl 2 -heatショック法により大腸菌 DH10B。
    1. CaCl 2100μlのアリコートを取り-80℃で保存有能なDH10B細胞69を処置されたと氷の上でそれらを解凍。
      注：変換あたり100μlの細胞を使用してください。
    2. 、1.7ミリリットルマイクロチューブに解凍した細胞を100μlのDNAライゲーション反応の10μlアリコートを加えるチューブをタップして穏やかに混合し、氷上で30分間続けます。
    3. 42℃ワシントン州45秒間のDNA細胞混合物を熱ショックターバス、2分間氷上での場所、その後、室温に予め温めたLBブロスの900μlを添加します。
    4. 225から250 rpmで振とうしながら、1時間、35℃で熱ショックを与えた細胞をインキュベートします。
    5. 10μg/ mlのクロラムフェニコールを含むLB寒天プレート上で培養した細胞（CML）の50〜200μlのアリコートを広げます。彼らは乾燥しているまで、右サイドアップ、室温でプレートを保管してください。
    6. 逆さまにプレートを回して、15時間、35℃でインキュベートします。
  5. カラムベースの精製方法（ 図1C）によって宿主細胞からクローン化されたBAC DNAを回収。
    1. LB-のCML寒天プレートから6〜8細菌コロニーを選び、10 / mlのCmlのを含有する2×YTブロスの3ミリリットルにそれらを接種します。激しく振盪（225から250 RPM）で10時間、35℃で培養物をインキュベートします。
    2. メーカーの指示通りに、スピンカラムを用いて、細菌培養1〜1.5 mlの組換えBAC DNAを分離します。70溶出抽出したDNA（typiTE緩衝液20μl中的100-200 NG）。
    3. 一つのクローニングに使用したのと同じ酵素を使用して、正しい挿入物のベクターの存在を同定するために、10μlの総容量中〜6時間、単離されたBAC二の分析、制限酵素消化を行って（参照プロトコル3.1）、および他のユニークな制限フラグメントパターンを生成し、適切な酵素（例えば、 のBglII、 のNcoI、またはのPst I）でクローン化されたBACの整合性をテストします。
    4. 2×YT-のCML培地500mlに（プロトコル3.5.1から）陽性細菌培養液の500μLを接種し、225から250 rpmで振とうしながら35℃で6時間、接種物を培養することにより正しくクローン化したBACを伝播します。製造業者により推奨されるように、フィルタ列を使用して、500ミリリットルの培養液からBAC DNA（通常は10〜20μgの）を精製する。71
      注意：最初の4 BACサブクローン、JEVゲノムRNAのcDNA断片を含む各、に持って証明することができますeまたはそれ以上の不要な突然変異（単数または複数）（参照配列としての役割を果たす）は、ウイルスゲノム42のコンセンサス配列と比較した場合。任意のそのような変異は、完全長のJEV cDNAのアセンブリの前にPCRベースの部位特異的突然変異誘発によって補正する必要がある。27

4. 5 'SP6プロモーターおよび3'ランオフサイトで完全長cDNAのJEVを作成

  1. ウイルスゲノムの本物の5 'および3'末端を有するゲノムの長さのRNAのin vitroでのランオフ転写を可能にするために、クローン化されたcDNAで3遺伝子改変（プロトコル4.1.1-4.1.3下記参照）を行います。
    1. オーバーラップ伸長PCR（ 図1D、てpBAC / F1 SP6）によりウイルスゲノムの5 '末端の直接上流にSP6プロモーターを導入。
      1. 製品の（2プライマー対SP6F + SP6R（製品サイズ、173塩基対）とF1F + F1RでてpBAC / F1の最初の標準的なPCRを経由して2つの重複するDNA断片を増幅IZE、676塩基対）、1μlのテンプレートDNA（〜200 PG /μl）を含む50μlの反応の各、10μlの5×PCR緩衝液、2μlの10mMのdNTPを、2.5μlのフォワード、10μMの各プライマーおよびリバースプライマー、0.5 μlの2 U /μlのDNAポリメラーゼ、68および31.5μlののdH 2 O 20秒間30秒間、98℃、10秒間、98℃の25サイクル、60℃30秒間、および72℃以下のサイクルプロフィールを用いてPCRを行います。
      2. プロトコル3.2で説明したように、1.5％の低融点アガロースゲル上で2つのPCR産物のそれぞれを実行後に2つのPCR増幅DNA断片をゲル精製します。
      3. 、2つの精製DNA断片1μlの各（〜100 PG /μl）を含む100μlの反応にSP6F + F1R（製品サイズ、821 bp）の最も外側のプライマーを用いて第二の融合PCRにより2ゲル精製DNA断片を融合20μlの5×PCR緩衝液、4μlの10 mMのdNTPを、5μlの前方に、10μMの各プライマーおよびリバースプライマー、1μlの2 U /μLのDNAポリメラーゼ、68と63μlののdH 2 O 30秒間30秒間、98℃、10秒間、98℃の25サイクル、60℃30秒間、および72℃以下の熱サイクリングプロファイルを使用します。
      4. プロトコル3.2で説明したように、1％低融点アガロースゲルから融合PCRアンプリコンをゲル精製します。
      5. 生成するてpBAC / F1の9532-bpのパック I-BSI WI断片とゲル精製融合PCRアンプリコンの760-bpのパック I-BSI WI断片を連結するためにプロトコル3.1から3.5に記載の5つのステップのクローニング手順を実行しますpBAC / F1 SP6。
    2. オーバーラップ伸長PCR（ 図1D、てpBAC / F3 KO）を介してサイレント点突然変異（T→9134）を導入することによって 、ヌクレオチド9131で、既存の、内部XbaI部位を除去します。
      1. 2プライマー対X1F + X1RでてpBAC / F3の最初の標準的なPCRによって2つの重複するDNA断片を増幅（製品サイズ、746塩基対）とX2F + X2Rプロトコル4.1.1.1で説明した実験条件下で50μlの反応中（商品のサイズ、316塩基対）。
      2. プロトコル3.2で詳述したように、1.5％低融点アガロースゲル上で電気泳動分離後の2つのPCR増幅DNA断片をゲル精製します。
      3. プロトコル4.1.1.3に記載された実験条件の下で、100μlの反応における最も外側のプライマーX1F + X2R（製品サイズ、1033 bp）を使用して第2の融合PCRを介して2ゲル精製DNA断片を融合。
      4. プロトコル3.2で説明するように、1％低融点アガロースゲルから融合PCRアンプリコンをゲル精製さ。
      5. 16245-BP はありません I-BSI WIおよび2141-bpのBSI W Iでゲル精製融合PCRアンプリコンの949-bpののAvr II- ていない I断片を連結するためにプロトコル3.1から3.5に記載の5つのステップのクローニング手順を実行します-てpBAC / F3ののAvr II断片をてpBAC / F3 KOを生成します。
    3. PCRベースの部位特異的変異誘発（ 図1D、てpBAC / F4 RO）によるウイルスゲノムの3 '末端のすぐ下流新しい人工のXbaIランオフサイトエンジニア。
      1. 1μlのテンプレートDNA（〜200 PG /μl）を含む100μlの反応においてプライマーROF + ROR（製品サイズ、324塩基対）を持つてpBAC / F4のPCRによるつのDNA断片を、20μlの5×PCR緩衝液、4μlの10を生成しますmMのdNTPを、5μlの前方に、10μMの各プライマーおよびリバースプライマー、1μlの2 U /μlのDNAポリメラーゼ、68と64μlののdH 2 O 15秒間30秒間、98℃、10秒間、98℃の25サイクル、60℃30秒間、および72℃以下のサイクルプロフィールを用いてPCRを行います。
      2. プロトコル3.2で詳述したように、1％低融点アガロースゲルからPCR増幅DNA断片をゲル精製します。
      3. 283-BP のSfi I-Nを連結するプロトコル3.1から3.5に記載の5つのステップのクローニング手順を実行しますpBAC / F4 ROを作成するために、てpBAC / F4の16933-BP のSfi I-Not Iで断片とゲル精製PCRアンプリコンのOT I断片。
  2. 3自然の制限部位（BSR GI、 バム HI、およびエヴァ私に結合することによって、単一のフルレングスのSA 14 -14-2 BAC（てpBAC / SA 14 -14-2）にcDNAを重複し、変更された4のセットを組み立てます）プロトコルに詳述される手順をクローニングの5つのステップを使用して順次で3.1から3.5（ 図1E）：てpBACのそれとてpBAC / F1 SP6のBSR G I-Not Iで断片を置き換えることにより、F1 SP6→F1 SP6 F2（/のエヴァ I-Not Iで断片を置換することによって、（F1 SP6 F2F3 KO F4 RO→てpBAC / F3 KO）のそれとてpBAC / F1 SP6 F2のバム H I-Not Iで断片を置き換えることにより、F1 SP6 F2F3 KO→F2）（ pBAC / F1 SP6 F2pBAC / F4 ROのものとF3 KO）。

5.フルレングスの高純度マキシプレップSA 14 -14-2 BACを準備

  1. 大腸菌の単一コロニーを育て大腸菌 DH10Bは225から250 rpmで振盪しながら35℃で10時間、10 / mlのCmlのを含有する2×YTブロス3mlにてpBAC / SA 14 -14-2を運ぶし、その後10時間の500μLを接種することによりスケールアップ細菌の2×YT-のCML培地500mlに文化、激しく振とうしながら35℃で6時間の接種物を栽培。
  2. 遠心4℃で15分間3107×gで2 250ミリリットル瓶で細菌培養。 GTE溶液（50 mMグルコース、25mMのトリス-Cl、および10mMのEDTA [pH8.0の]）の30ミリリットルの各ペレットを再懸濁し、次に/ mlのリゾチーム60mgの500μlのを追加します。 10分間氷上で2細胞懸濁液をインキュベートします。
  3. 、各細胞懸濁液に新たに調製した溶解液（0.2 N NaOHおよび1％SDS）の60ミリリットルを加え、透明になるまでよく混ぜて、溶解物を保ちます室温で10分間。
  4. 各ボトルに（60ミリリットルの5M酢酸カリウム、11.5ミリリットルの氷酢酸、及び28.5ミリリットルのdH 2 Oからなる、100ミリリットル）中和液の45ミリリットルを追加し、ボトルを反転することにより十分に混合し、氷上で中和された溶解物をインキュベート10分間。
  5. 遠心4℃で20分間18566×gで中和溶解物。二つの新しい250mlの瓶に、両方の瓶の上澄みを移し、それぞれ100％イソプロパノールの0.6ボリュームを追加し、20分間氷上で保管してください。
  6. 4℃で20分間18566×gで沈殿物をスピンダウン。 50mlのチューブ（10 mlの合計）でそれらを組み合わせる、TE緩衝液5ml中に各ペレットを溶解し、そして5 M塩化リチウムの等量を添加することにより、RNAを沈殿。氷上で10分間混合物をインキュベートします。
  7. 遠心を4℃で20分間14636×gでのRNA沈殿物。新しい250 mlチューブに上清を移し、100％イソプロパノールの2倍量を加えることによってDNAを沈殿させます。氷上で20分間混合物をインキュベートします。
  8. 4℃で20分間18566×gでのDNA沈殿物をスピンダウン。吸引し上清を、TE緩衝液（pH 7.6）9.5 ml中にDNAペレットを再懸濁し、塩化セシウム（CsCl密度）および10 mg / mlのEtBrを390μlと10グラムを追加します。
  9. 18 G針を装備した注射器を用いて16×76ミリメートルシール性ポリプロピレンチューブにDNA-のCsCl-EtBrをソリューションをロードします。 20°C（ 図3）で16時間401700×gで超遠心機に封入されたCsCl勾配スピン。
  10. 勾配の側からのBAC DNAを取得するために、勾配の上部の通気孔と20 G針を装備した注射器を作成するために18 G針を使用してCsCl勾配からBACプラスミドのDNAバンドを収集します。
  11. EtBrを染色したBAC DNAサンプルへのdH 2 O飽和ブタノールの2.5倍量を加え、ボルテックスで混和します。遠心分離は、1分間13,400×gで混合し、新しい1.7ミリリットルのマイクに下層の水相を転送rotube。この手順を6回繰り返します。
  12. ブタノール抽出BAC DNAに3 M酢酸ナトリウムと100％エタノール2.5容量の1/10体積を添加し、氷上で10分間インキュベートすることによって、EtBrを無BAC DNAを沈殿させます。遠心分離機10分間13,400×gで沈殿物を、1 mlの70％エタノールを用いてDNAペレットを洗浄し、遠心分離し、再度ペレット。
  13. 10分間、DNAペレットを空気は、乾燥し、TE緩衝液（pH 7.6）200μlにそれを溶かします。
    注： 図4は 、JEV SA 14 -14-2ための逆遺伝学システムの概要を示しています。

6.線形全長JEV BAC DNA からインビトロで合成RNAを転写

  1. 37℃で（3μgのDNAを、60 U酵素、消化緩衝液×1、および1×BSAを含む）を100μlの総容量をXba IでてpBAC / SA 14 -14-2の大規模な制限酵素消化を行って12〜15時間のためのC。 Dの3μlのアリコートを調べ0.5 / mlのEtBrをを含む0.8％アガロースゲル上でigestion反応。
  2. 2時間（ 図4A）、30℃でマングビーンヌクレアーゼ（MBN）の25 Uとのさらなる消化反応をインキュベートします。
  3. dH 2 Oで300μlにのXbaI消化、MBNで処理したサンプルの量を立ち上げ等量のフェノールを加える：クロロホルム：イソアミルアルコール（25：24：1）、次に希釈した試料に、1分間激しくボルテックス、10分間、13,400×gでスピンし、新しい1.7 mlに、上部の水相を転送マイクロチューブ。等量のクロロホルムを加え、抽出手順を繰り返します。
  4. エタノール沈殿によって、フェノール/クロロホルム抽出、線状化BACを回復：3 M酢酸ナトリウム1/10容量の100％エタノール2.5容量を追加し、20分間氷上でインキュベートします。遠心10分間13,400×gで沈殿物を、70％エタノール1mlでDNAペレットを洗浄した後、再度遠心分離によりスピンダウン。
  5. DNA PELLEを空気乾燥dH 2 O30μlの中でそれを10分間トンと溶解0.5 / mlのEtBrを（ 図5A）と、0.8％アガロースゲル上で回収されたBACの1μlのアリコートを調べます。
  6. 〜200ngの鋳型DNA、0.8 mMのキャップアナログ[M 7 G（5 '）pppの（5'）A]、1 mMののrNTPを含む25μlの（総体積で線形化BAC DNAのランオフ転写を行い、 40 U RNase阻害剤、1時間37℃（ 図4B）では、20 U SP6 RNAポリメラーゼ、72、1×転写緩衝液）。 DE-81ろ紙に吸着することによりモニターし、0.5μM[3 H] [3 H] UTPの取り込みに基づいてRNA定量のためのUTPを含めます。69
  7. 0.5 / mlのEtBrを（ 図5B）を含む 0.6％アガロースゲル上でランオフ転写反応の1-2μlのアリコートを実行します。

7. RNA感染とウイルス収量を決定

  1. 150ミリメートルのcultuでBHK-21細胞を培養5％のCO 2で37℃で24時間、3×10 6細胞/皿の密度で料理再。
    注：10％ウシ胎児血清、2mMグルタミン、ビタミン、およびペニシリン/ストレプトマイシンを補充したアルファ最小必須培地中でBHK-21細胞を維持します。
  2. 冷溶液A（137mMの塩化ナトリウム、2.7のKCl、8.1 mMのの Na 2 HPO 4、1.5mMのKH 2 PO 4）の10mlで細胞単層を洗浄します。トリプシンEDTA（0.25％）4mlで処理することにより皿から細胞を剥離し、2分間、卓上遠心機で270×gで遠心分離することによってそれらを収集します。
  3. 2分間50mlコニカルチューブと遠心分離機で270×gで細胞懸濁液を冷溶液Aを、50 mlの細胞ペレットを再懸濁します。この洗浄手順を3回繰り返します。最後の洗浄の後、ゾルAの2×10 7細胞/ mlの密度で細胞ペレットを再懸濁
  4. 2μと細胞懸濁液の400μlのアリコートを混ぜます2mmのギャップキュベット中の合成RNAのG、速やかに最適なエレクトロポレーション条件でエレクトロとの混合物をエレクトロポレーション：980 V、99マイクロ秒のパルス長、及び5パルス（ 図4C）。
    注：これをさらに精製することなく直接エレクトロポレーション用プロトコル6.5で合成した3 H標識RNAを使用してください。
  5. 室温で10分間エレクトロポレーションした細胞のままにして、完全培地600μlのを含む1.7ミリリットルマイクロチューブに移します。
  6. 完全培地1ml中にエレクトロポレーションした細胞の10倍連続希釈を調製し、6ウェルプレートでunelectroporated BHK-21細胞（5×10 5）の単層上で各希釈の100μlのアリコートをプレート。
  7. インキュベーションの4-6時間後に、10％ウシ胎児血清を含む最小必須培地中で0.5％アガロースを用いて細胞をオーバーレイ。 5％CO 2で37℃で4日間培養します。
  8. 感染中心を視覚化5％エタノール27（ 図6A）における1％クリスタルバイオレットで7％ホルムアルデヒドで固定し、染色することにより複数の（プラーク）。
    1. オプション：免疫蛍光アッセイ27,73（ 図6B）による、JEVタンパク質の発現のために18〜20時間後、トランスフェクションで、RNAエレクトロポレーションした細胞を調べ、ウイルスのための22および40時間後、トランスフェクションで、RNAエレクトロポレーションした細胞からの上清を収穫プラークアッセイ27,63（ 図6C）によって滴定。

結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

すべてのプラス鎖RNAウイルスの場合は、逆遺伝学システムの信頼性と効率がシーケンスウイルスゲノムRNAのコンセンサス配列と等価であるクローン化された完全長cDNAの遺伝的安定性に依存しています。27 図1は、五員環を示し、 JEV SAのBACとして、全長感染性cDNAを構築するためのステップ戦略14 -14-2 28：ステップ1、JEV感染BHK-21細胞（ 図1A）の細胞培養上清からのウイルスRNAの精製;ステップ2、全ウイルスゲノム（ 図1B）に及ぶ4重複するcDNAアンプリコン（F4にF1）の合成;ステップ3、BACベクターに4つの連続cDNA断片のそれぞれのサブクローニング、てpBAC / F4（ 図1C）にてpBAC / F1を作成します。 すなわちステップ4、SP6 ​​RNAポリメラーゼを用いたインビトロランオフ転写のためのクローン化cDNAの変更、SP6を置きますサイレント点突然変異、9134→T（てpBAC / F3 KO）を導入し、挿入することによって、ヌクレオチド9131で、既存の内部のXba I部位を排除し、すぐにウイルス5 '末端（てpBAC / F1 SP6）の上流のプロモーター配列、ウイルス3 '末端（てpBAC / F4 RO）（ 図1D）のすぐ下流に新たな人工のXbaIランオフサイト。ステップ5、フルレングスのSA 14 -14-2のcDNA BAC、てpBAC / SA 14 -14-2（ 図1E）。 表1に、このクローニング手順で使用されるオリゴヌクレオチドのアセンブリ。28

機能性JEV cDNAの構築のために、最初の重要なステップは、RT-PCRのための鋳型として精製されたウイルスRNAを使用して、4つの重複するcDNAフラグメントの合成である。 図2は 4であったRT-PCR産物のための代表的な結果を提供します0.8％で電気泳動アガロースゲル。このゲルは、全長のJEV cDNAは4オーバーラップするcDNA断片に増幅されていることを明確に示しています。時折、RT-PCR反応が原因cDNA合成/増幅中のプライマーの非特異的アニーリングを、予想される生成物より大部分が小さい1つ以上の追加のウイルス特異的または非特異的な生成物を生じる可能性があります。一方、ほとんど又は全く予期されるRT-PCR産物は、ウイルスRNAの単離または不適切なRT-PCRのパフォーマンス中に偶発ためのRNaseの混入の増幅されたことになります。

次の重要なステップは、partial-または全長標準的な組換えDNA技術を使用して、比較的簡単な手順であるBACにおけるJEVのcDNAのクローニングおよび変形例である。69 図3は含むBACクローンを精製するための代表的な結果を提示します塩化セシウム-EtBrを勾配にバンディングによってJEV SA 14 -14-2の完全長cDNA。この実験では、401700×gで16時間遠心分離した後、二つの異なるバンド、 すなわち 、E。上記の大腸菌の染色体DNAおよび以下のスーパーコイルBACプラスミドDNAは、長波長紫外線の下でチューブの中央に表示されます。下のBAC DNAバンドの最小量（〜400μl）を慎重にチューブの側のシリンジで穴を突っついによって回収しました。その後、EtBrをブタノール抽出によりBAC DNAから抽出し、EtBrを無BAC DNAをエタノール沈殿により濃縮しました。

最後のステップは、許容細胞へのRNAトランスフェクション（ 図4）の後に、全長SA 14 -14-2 BAC（てpBAC / SA 14 -14-2）からインビトロで転写合成RNAの特異的感染の決意です。ステップ1、3 '末端に、全長SA 14 -14-2 cDNAの線形化：このステップは、3つの連続ステップが含まウイルスゲノム（ 図4A）の末端;ステップ2、ランオフ転写（ 図4B）により線形化cDNAからの合成RNAの産生;ステップ3、合成RNA（ 図4C）でトランスフェクトしたBHK-21細胞における組換えウイルスの救出。実験的に、てpBAC / SA 14 -14-2の2つの独立したクローンをのXba I消化で線状化および Xba I消化によって生成された4塩基の5 'オーバーハングを除去するために、MBNで処理しました。線形化のBACは、エタノール沈殿を行い、フェノール - クロロホルム抽出によってクリーンアップされました。 2つの精製の​​BACの線形化を、0.8％アガロースゲル（ 図5A）で実証されました。フェノール - クロロホルム抽出は、線形化のBACは、RNaseフリーであることを確認するために慎重に行う必要があります。 2線形化のBACのそれぞれがm 7 G（5 '）pppの（5の存在下で、SP6 RNAポリメラーゼを使用してランオフ転写のためのcDNAテンプレートを務め'）キャップアナログ。合成RNAの完全性は、基準1kbのDNAラダー（ 図5B）と一緒に、0.6％アガロースゲル上で2つの転写反応混合物のアリコートを実行することによって示された。この単純なアッセイでは、主要な顕著なRNAバンドが常にちょうど移行しました3キロバイトの下にDNAバンドを参照し、シャープであるように思われました。しかし、分解したRNAは、同じゲルに塗抹外観を持っているでしょう。

感染中心アッセイは、合成RNAの特異的感染を決定するためのゴールドスタンダードです。このアッセイは、（3×10 5細胞/ウェル）、ナイーブBHK-21細胞を含む6ウェルプレート中で10倍段階希釈したエレクトロポレーションした細胞の同等のアリコートを播種し、RNA試料とBHK-21細胞を電気穿孔し、アガロースオーバーレイすることによって行いました細胞単層の上に。 4日間のインキュベーションの後、生存細胞をホルムアルデヒドで固定し、クリスタルバイオレットで染色したの細胞（ 図6A）に送達感染性RNA分子の数に対応する感染性センター（プラーク）の数を、定量化するolution。 インビトロ転写のために用いたcDNAテンプレートは非感染性であることが証明されているため、転写反応混合物の27アリコートを直接エレクトロポレーションに使用しました。エレクトロポレーションは、RNAトランスフェクションのために好ましい方法です。あるいは、RNAは、DEAEデキストラン、およびカチオン性リポソームを用いて、他の方法によってトランスフェクトすることができます。 RNAのエレクトロポレーションは、非常に有効であるが、塩がエレクトロポレーション反応やエレクトロポレーションキュベットが再利用されているか存在している場合は、電気パルスの「アーク放電」は、まれにしか発生しません。 RNAトランスフェクト細胞におけるウイルスタンパク質の発現を、抗NS1ウサギ抗血清（ 図6B）を用いて、免疫蛍光アッセイによって試験しました。 RNAトランスフェクト細胞の上清中に蓄積されたウイルス粒子の産生でしたプラークアッセイ（ 図6C）によってalyzed。これらの実験の結果は、cDNA由来の合成RNA、組換えウイルスの高力価を生成し、許容BHK-21細胞に感染性であることを明確に示します。

オリゴヌクレオチド 配列（5 'から3'） 位置 b 極性
1RT TAGGGATCTGGGCGTTTCTG
GCAAAT 		2578-2603 アンチセンスの
1F aatcccgggAGAAGTTTATC
TGTGTGAACTT 		1-22 センス
1R attgcggccgcCCACGTCGT
TGTGCACGAAGAT 		2532-2553 アンチセンスの
2RT TTCTGCCTACTCTGCCCCTC
CGTTGA 		5975-6000 蟻ISENSE
2F aatcccgggTCAAGCTCAGT
GATGTTAACAT 		1800-1821 センス
2R attgcggccgcGATGGGTTT
CCGAGGATGACTC 		5929-5950 アンチセンスの
3RT ACGGTCTTTCCTTCTGCTGC
AGGTCT 		9426-9451 アンチセンスの
3F aatcccgggGAGGATACATT
GCTACCAAGGT 		5500-5521 センス
3R attgcggccgcGTAAGTCAG
TTCAATTATGGCT 		9380-9401 アンチセンスの
4RT AGATCCTGTGTTCTTCCTCA
CCACCA 		10952から10977 アンチセンスの
4F aatcccgggAGTGGAAGGCT
CAGGCGTCCAA 		9200-9221 センス
4R attgcggccgcAGATCCTGT
GTTCTTCCTCACC 		10956から10977 アンチセンスの
SP6F cataccccgcgtattcccac
TA 		センス
SP6R ACAGATAAACTTCTctatag
tgtcccctaaa 		1-14 アンチセンスの
F1F aggggacactatagAGAAGT
TTATCTGTGTG 		1-17 センス
F1R TGGATCATTGCCCATGGTAA
GCTTA 		638から662 アンチセンスの
X1F CGAATGGATCGCACAGTGTG
GAGAG 		8403-8427 センス
X1R AAAGCTTCAAACTCAAGATA
CCGTGCTCC 		9120-9148 アンチセンスの
X2F GGAGCACGGTATCTTGAGTT
TGAAGCTTT 		9120-9148 センス
X2R cacgtggacgagggcatgcc
tgcag 		アンチセンスの
ROF CCAGGAGGACTGGGTTACCA
AAGCC 		10670から10694 センス
ROR agggcggccgctctagAGAT
CCTGTGTTCTTCCTCACCAC 		10954から10977 アンチセンスの
JEV配列は大文字で示されており、BAC配列は小文字で示されています。
Bのヌクレオチド位置は、JEV SA 14 -14-2（Genbank受託番号JN604986）の完全なゲノム配列を意味します。

表1：cDNA 合成、PCR増幅、およびBAC突然変異誘発に使用したオリゴヌクレオチド。

cDNA合成および修飾図。ウイルスRNAの単離、サブクローニング、アセンブリプロセスを示しています。
図1。0; BACとして JEV SA 14 -14-2の完全長cDNAの構築のための戦略JEV粒子からのウイルスRNAの（A）の単離。 JEV SA 14 -14-2のゲノムRNAの概略図が示されています。全ウイルスゲノムをカバー（B）は、4つの重複するcDNAフラグメントの合成（F4のF1）。 （C）BACベクターに4重複するcDNA断片のサブクローニング、てpBAC / F4にてpBAC / F1を作成します。 （D）in vitroでのランオフ転写のためのクローン化cDNAの変更。 pBAC / F1 SP6は、ウイルス 5 '末端の上流にSP6プロモーター配列を含むてpBAC / F1の誘導体です。 pBAC / F3 KOはサイレント点突然変異（T→9134、アスタリスク）が含まれてpBAC / F3の誘導体です。 pBAC / F4 ROはウイルス3 '末端の下流の人工のXbaIランオフサイトが含まれていてpBAC / F4の誘導体です。 （E 強い>）、全長SA 14 -14-2 BACのアセンブリ（てpBAC / SA 14 -14-2）。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

DNA電気泳動の結果;キロベース単位のサイズによるDNA断片の分離を示すゲル。分子マーカー。
JEV SA 14 -14-2 の完全長ゲノムRNAをまたがる4重複cDNA断片（F1〜F4は）図2.合成 。 4 RT-PCR産物は0.8％アガロースゲルでの電気泳動により評価されます。 M、1kbのDNAラダー。 4 cDNA断片の予想サイズは、ゲル画像の下部に表示されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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JEV SA 14 -14-2 の完全長cDNAを含むBAC図3. 精製 BACプラスミドを大腸菌から単離されますSDS-アルカリ溶解法によって大腸菌 DH10Bをさらに塩化セシウム、EtBrを勾配にバンディングによって精製しました。発表16×76ミリメートルシール性ポリプロピレンチューブを使用してのCsCl-EtBrを勾配の一例である。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

cDNA線形化とRNA合成図。BHK-21細胞におけるRNAトランスフェクションによるウイルス回収
BACで組み立て た全長のJEV SA 14 -14-2 cDNAからの 感染性ウイルスの回収の図4.概要 。cDNAテンプレートの（A）線形化。 JEV BACがで切断されたフルレングスMBNで処理をXba Iと。 （B）RNA転写物の合成。線形化されたcDNAをM 7 G（5 '）pppの（5'）のキャップ類似体の存在下でSP6 RNAポリメラーゼによって転写されます。 （C）の合成JEVsの回収。 in vitroで転写されたRNAは、合成ウイルスの高力価を生成し、エレクトロポレーションにより、BHK-21細胞にトランスフェクトされている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

cDNAおよびRNA転写物のアガロースゲル電気泳動;DNAバンドサイズ;分子マーカー。
cDNAをテンプレートとして、全長のJEV BACを用いたin vitro 転写により RNAの図5の合成 。線形化、全長のJEV BACの（A）の生成、てpBAC / SA 14 -14-2。 pBACの二つの独立したクローン/ SA 14 -14-2（Cl.1とCl.2）はMBNとXbaIで消化し ​​、その後の処理により直線化されています。線形化されたBACは、0.8％アガロースゲルでの電気泳動によって検査されます。ランオフ転写によって合成RNAの（B）の製造。 2線形化のBACのそれぞれは、SP6 RNAポリメラーゼランオフ転写のための鋳型として使用します。 2つの転写反応物のアリコートを、0.6％アガロースゲル上で実行されています。 Mは、1キロバイトのDNAラダー。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

細胞培養におけるRNA感染性とウイルス収量。棒グラフ、プラークアッセイ、顕微鏡検査結果。
全長のJEVのBACおよび合成ウイルスの回収から転写された合成RNAの図6.特定の感染。BHK-21細胞はモックエレクトロポレーション（モック）であるか、又はFRに由来するRNA転写産物を電気穿孔全長のJEV BAC（Cl.1とCl.2）の二つの独立したクローンのそれぞれをOM。 （A）RNAの感染力。細胞は、アガロースを重層し、トランスフェクション後4日目にクリスタルバイオレットで染色します。 RNAの感染性細胞（左パネル）にエレクトロポレーション、感染性RNAの量を推定するために、感染中心アッセイにより決定されます。また、感染性センターの代表画像（​​右パネル）が示されています。 （B）タンパク質発現。細胞を4ウェルチャンバースライド中で培養します。 20時間後、トランスフェクション（HPT）において、RNAエレクトロポレーションした細胞におけるウイルスタンパク質の発現は一次抗NS1ウサギ抗血清および二次Cy3結合ヤギ抗ウサギIgG（赤色）を用​​いて免疫蛍光アッセイにより分析されます。核を4 '、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（青）で対比されています。免疫蛍光画像は、対応する微分干渉コントラスト画像にオーバーレイされます。 （C）ウイルス収量。細胞は1で培養します50 mmの培養皿。 22と40 HPTで、RNAエレクトロポレーションした細胞の培養上清中に蓄積された感染性ビリオンの生産をプラークアッセイにより検討されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

現在のプロトコルが正常JEV、その機能的なcDNAを構築することが本質的に困難であることが証明されたとフラビウイルスの二つの異なる株（CNU / LP2 27、SA 14 -14-2 28）の全長の感染性cDNAクローンを生成するために使用されていますなぜなら、宿主細胞毒性およびクローニングされたcDNAの遺伝的不安定性の伝播8,74-76このプロトコルは、三つの主要なコンポーネントが含ま：。最初、高忠実度の逆転写酵素を用いてウイルスRNAの忠実なcDNAコピーの合成/増幅を最大化します/ DNAポリメラーゼ。第二に、最終的な完全長cDNAの組立工程にサブクローニング最初のcDNAからの非常に低コピー数ベクターのBACにおける毒性系列（未発表データ）74,77,78を含むウイルスPRM-Eコード領域をクローニングします。第三、明らかにより大きいDNA inseを許容120〜350キロバイトの平均サイズ、19-21で外来DNAを収容することができ、クローニングベクター、BACを利用他のクローニングベクターが行うよりも、RTS。このクローニングアプローチは、他の多くのプラス鎖RNAウイルス、〜10から32キロバイトの大RNAゲノムと特にに一般的に適用されます。そのゲノムが宿主細​​胞リボソームによるタンパク質に翻訳されるようなウイルスのmRNAを作用するための感染性cDNAクローンの発生は、特に、ポジティブ鎖RNAウイルスは、RNAウイルスの逆遺伝学系の開発における重要なステップです。従って、ウイルス複製は、感受性の宿主細胞へのcDNA由来のゲノム長RNA分子を導入することによって開始することができます。感染性JEV cDNAクローンの利用可能性は、組換えDNA技術と組み合わせると、このような遺伝子発現73,79およびゲノム複製として、分子レベルでウイルスのライフサイクルの様々な態様の理解を増加している。63,64にも、完全長のJEV cDNAクローンは、抗ウイルスワクチン28および遺伝子送達ベクターの開発のための貴重なツールであることが証明されました。 80,81

すべてのプラス鎖RNAウイルスと同様に、高度に感染性RNAをin vitroで合成することが可能なJEV cDNAのための信頼できる機能を構築する際に、複数の重要なステップがあります。理想的には、全長cDNAのクローンから転写された合成RNAの配列は、ウイルスゲノムRNA、ウイルスRNA複製の開始のために必要とされ、特に5 'および3'末端配列と同一であるべきです。60-62現在のプロトコルでは、本物の5 '末端および3'末端は、最後の下流のウイルスゲノムの最初のアデニンヌクレオチドの上流にSP6プロモーター配列を配置し、ユニークな人工のXba I制限部位を配置することによって確保されましたそれぞれウイルスゲノムのチミンヌクレオチド、。 Xba I-直線化し、MBN処理されたcDNAをTEのランオフ転写によって生成された本物の5 '末端および3'末端を有する合成RNAを頂きましたmplateメートル7 G（5 '）で下塗りし、SP6 RNAポリメラーゼのppp（5'）キャップアナログを使用。このプロトコルは、いくつかの方法で変更することができます。 インビトロ転写のために、別のバクテリオファージRNAポリメラーゼ（例えば、T3またはT7）は、明確に定義されたプロモーター配列と組み合わせて使用することができる。27、それが中に存在しない場合、ランオフサイト、別の制限部位を利用することができるように直線化cDNAからのウイルスゲノムとするならば、合成RNAは、本物の3 '末端で終わります。合成RNAは、その3 '末端に3つまたは4つのウイルス関連のないヌクレオチドが含まれている場合、3'末端のヌクレオチド配列の重要性は、RNAの感染力で約10倍の減少によって実証されている。in vitro転写反応において27、両方M 7 G（5 '）pppの（5'）Aおよびm 7 G（5 '）pppの（5'）Gキャップ類似体は、後者の場所ウイルス5の上流に無関係な余分なGヌクレオチドが、等しく良好に使用することができ'末端が、そのさらには、合成RNAの感染性または複製を変更しません。27 cDNAテンプレート自体は感染性ではないのでまた、DNアーゼI消化によるRNA転写物からcDNA鋳型の除去は、RNAの感染性試験の必要はありません。27

BAC技術は現在、プラス鎖RNAウイルス、すなわち二つJEVs、CNU / LP2 27、SA 14 -14-2 28（ゲノムサイズ、〜11 KB）の一握りのための感染性cDNAクローンの構築に適用されています。 2デング熱ウイルス、BR / 90 26とNGC 29（〜11キロバイト）牛ウイルス性下痢ウイルス、SD1（〜12キロバイト）; 25 2古典的ブタ熱ウイルス、Cとパーダーボルン（〜12キロバイト）; 24ボーダー病ウイルス、ギフホルン（〜12キロバイト）; 24豚繁殖・呼吸障害症候群ウイルス、PL97-1 / LP1（〜15キロバイト）; 30伝染性胃腸炎ウイルス、PUR46-MAD（〜29キロバイト）; 16ネコ伝染性腹膜炎ウイルス、DF-2（〜29キロバイト）; 32重症急性呼吸器症候群コロナウイルス、ウルバーニ（〜30キロバイト）; 9中東呼吸器症候群コロナウイルス、EMC / 2012（〜30キロバイト）; 17およびヒトコロナ、OC43（〜 31 KB）31のcDNAの構築のためのBACを使用することの主な利点は、大規模な、1または2コピーのBACプラスミドの高い遺伝的安定性です。しかし、その非常に低コピー数の固有の性質があるため、BAC DNAと染色体DNAを、ホストとのBAC DNAの純度の結果としての削減の非常に低い収率で、また大きな欠点です。現在のプロトコルでは、BAC DNAの収量は 、E を成長させることによって最大化されます大腸菌 DH10B栄養豊富な培地の2×YTで感染性BACてpBAC / SA 14 -14-2で形質転換しました。この努力にもかかわらず、平均利回りはわずか〜15μgのの2×YTブロスの500ミリリットルからBAC DNAのです。また、BAC DNAの純度が最高の精製のためのCsCl-EtBrを密度勾配遠心分離を使用することによって達成されますむしろ、一般的に使用される列ベースのプラスミド分離より。しかし、それは心に留めておくことは重要であるBAC- 形質転換したE.それがクローニングされたcDNAの遺伝的安定性を危うくする可能性があるため、 大腸菌が過剰成長べきではない、と高い成長が必ずしも大きい利回り以上純度BAC DNAにはつながりません。

ここで説明するプロトコルは、JEVのためのBACとして遺伝的に安定、全長感染性cDNAクローンの構築および増殖のための最適化、効率的、かつ合理化法である、手順をもう一度事実上不可能と思いました。この同じクローニング戦略は、多くの他のプラス鎖RNAウイルスに適用することができます。一般的に、感染性cDNAクローンは、ウイルスの複製および病因にその生物学的機能を研究するために、ウイルスRNAゲノムに変異（例えば、欠失、挿入、および点変異）の様々なを紹介することが可能となります。このcDNAベースの逆遺伝学系を開発することを可能にし、TESTワクチンと目的の特定のプラス鎖RNAウイルスの病原性因子を標的とする治療候補。また、この感染性cDNA技術は、生物医学研究の多くの用途のために、目的の外来遺伝子を発現することができるウイルスベクターとして利用することができます。

開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者は、YMLの支援に対するユタ科学技術研究基金と、SIYの支援に対する韓国国立研究財団の助成金（2009-0069679および2010-0010154)に感謝したいと思います。この研究は、ユタ州立大学のユタ農業試験場の支援を受け、ジャーナル論文番号UAES#8753として承認されました。また、著者は編集支援をしてくれたデボラ・マクレラン博士に感謝します。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
<ストロング>1.Molecular Cloning
2xYT BrothSigma-AldrichY2377[
3H]UTPPerkinElmerNET380250UCRadioactive
50 ml TubeThermo Scientific (Nalgene)3114-0050
250 ml BottleBeckman Coulter356011
AgaroseLonza50004
アガロース (低融点)Life Technologies (Invitrogen)16520-100
AvaINew England BioLabsR0152S
AvrIINew England BioLabsR0174S
BamHINew England BioLabsR0136S
BsiWINew England BioLabsR0553S
BsrGINewイングランドBioLabsR0575S
ブタノールフィッシャーサイエンティフィックA399-1 
塩化セシウムフィッシャーサイエンティフィックBP1595-1
クロラムフェニコールSigma-AldrichC0378
クロロホルムSigma-AldrichC2432発がん性
DE-81 濾紙GE Healthcare Life Sciences3658-023
dNTP mixLife Technologies (Invitrogen)18427-088
大腸菌 DH10B Life Technologies (Invitrogen)18297-010
EDTASigma-AldrichE5134
エタノール Sigma-AldrichE7023
臭化エチジウムSigma-AldrichE7637毒性および高変異原性
フィルターカラム (Plasmid Maxiprep Kit)Life Technologies (Invitrogen)K2100-26
氷酢酸Sigma-AldrichA6283刺激性
グルコースSigma-AldrichG5400
グリコーゲン ロシュ10901393001
ハイフィデリティDNAポリメラーゼニューイングランドバイオラボM0491S
イソアミルアルコールシグマアルドリッチI9392可燃性
イソプロパノール Amresco0918Flammable
LB BrothLife Technologies (Invitrogen)12795-027
塩化リチウムSigma-AldrichL9650
リゾチームAmresco0663
塩化マグネシウムSigma-AldrichM8266
M-MLV Reverse TranscriptaseLife Technologies (Invitrogen)18080-044
緑豆ヌクレアーゼニューイングランド バイオラボM0250S
針 (18G, 20G)BD305196, 305175バイオハザード (鋭利物廃棄物)
NotIニューイングランド バイオラボR0189S
オリゴヌクレオチド統合 DNA 技術カスタム オリゴヌクレオチド合成
PacIニューイングランド バイオラボR0547S
pBeloBAC11New England BioLabsER2420S (E4154S)
Phenol (Buffer-Saturated)Life Technologies (Invitrogen)15513-039毒性および高腐食性
フェノール:クロロホルム:イソアミルアルコールLife Technologies (Invitrogen)15593-031毒性および高腐食性
フェノール:グアニジン イソチオシアネートLife Technologies (Ambion)10296-010有毒、腐食性、および刺激性
Pme Iニューイングランド バイオラボR0560S
酢酸カリウムAmresco0698
RNase 阻害剤Life Technologies (Invitrogen)10777-019
rNTP SetGE Healthcare Life Sciences27-2025-01
シーラブルポリプロピレンチューブ (16 × 76 mm) ベックマン・コールター342413
SfiIニューイングランド バイオラボR0123S
Sma Iニューイングランド バイオラボR0141S
酢酸ナトリウムSigma-AldrichS2889
ドデシル硫酸ナトリウムAmresco0227
水酸化ナトリウムSigma-AldrichS5881
SP6 RNA ポリメラーゼNew England BioLabsM0207S
スピンカラム (プラスミド Miniprep キット)Life Technologies (Invitrogen)K2100-11
SyringeHSW NORM-JECT4200.000V0
T4 DNA LigaseNew England BioLabsM0202S
TrisAmresco0826
tRNA (酵母)Life Technologies (Invitrogen)15401-011
XbaI ニューイングランドバイオラボR0145S
名前会社カタログ番号コメント
2。細胞培養
アルファ ミニマル エッセンシャル メディウムライフ テクノロジーズ (Gibco)12561-049
コニカル チューブ (50 mL)VWR21008-242
クリスタル バイオレット シグマ・アルドリッチC0775
培養皿 (150 mm) TPP93150 
キュベット(2mmギャップ)ハーバード装置450125 
ウシ胎児血清 Life Technologies (Gibco)16000-044
ホルムアルデヒドSigma-AldrichF1635毒性および発がん性
グルタミンLife Technologies (Gibco)25030-081
Minimal Essential MediumLife Technologies (Gibco)61100-061
ペニシリン/ストレプトマイシンLife Technologies (Gibco)15070-063
塩化カリウムSigma-AldrichP3911
リン酸カリウム モノ塩基性Sigma-AldrichP9791
6ウェルプレートTPP92006
塩化ナトリウムSigma-AldrichS3014
リン酸ナトリウム二塩基性Sigma-AldrichS3264
トリプシン-EDTA(0.25%)Life Technologies (Gibco)25200-056
ビタミンSigma-AldrichM6895
名前strong>会社カタログ番号strongコメント
3。装置
アガロースゲル電気泳動システムMupidMPDEXU-01
CO2 インキュベーターThermo ScientificHeracell 150i
卓上遠心分離機 Thermo ScientificST16R
エレクトロポレーターハーバード ApparatusECM 830
長波紫外線ランプ (ハンドヘルド)UVPUVGL-58
卓上遠心分離機Beckman Coulter368826
ThermocyclerLife Technologies (Applied Biosystems)GeneAmp PCR System 9700
Vortexer科学産業G-560
ウォーターバスJeioテックWB-10E

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