方法論記事

ラピッド

DOI：

10.3791/53165

⸱

2015年9月23日

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1Ross University School of Veterinary Medicine, 2Charles E. Schmidt College of Medicine, Florida Atlantic University

この記事について

サマリー

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このプロトコルは、パラホルムアルデヒド接頭辞を持つ脳に理想的な迅速かつ簡素化されたin situハイブリダイゼーション法を説明しています。したがって、新鮮な凍結組織を使用しながら、長時間の複雑なステップの必要性を減らすことができます。 この方法は、ラットのセロトニン5-HT2A受容体遺伝子htr2aの同定を使用して検証されます。

要約

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3,4-メチレンジオキシメタンフェタミン(MDMA;エクスタシー)の毒性は、急性セロトニン(5-ヒドロキシトリプタミン;5-HT)症候群によるセロトニン作動性mRNA発現の領域特異的な変化を引き起こす可能性があります。この仮説は、セロトニン5-HT2A受容体遺伝子htr2aを検出するためにin situハイブリダイゼーションを使用して検証できます。従来、放射性リボプローブを用いたこのような手技は、数日かかる複雑なワークフローや、RNaseフリーの環境に保存された新鮮な凍結組織を使用する必要があるという難しさから困難でした。最近、短いオリゴヌクレオチドプローブの開発により、in situハイブリダイゼーション手順が簡素化され、パラホルムアルデヒド接頭辞を持つ脳切片の使用が可能になりました。ここでは、接頭辞を付けた脳組織に非放射性オリゴヌクレオチドプローブを用いた詳細なプロトコールについて説明します。この研究に使用したハイブリダイゼーションプローブには、dapB(ジヒドロジピコリン酸レダクターゼをコードする細菌遺伝子)、ppiB(ペプチジルプロリルイソメラーゼBをコードするハウスキーピング遺伝子)、およびhtr2a(5-HT2A受容体をコードするセロトニン遺伝子)が含まれます。この方法は、比較的簡単で、安価で、再現性があり、完了するのに2日未満しかかかりません。

概要

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セロトニン(5-ヒドロキシトリプタミン;5-HT)症候群は、抗うつ薬1などの5-HT促進薬によって引き起こされる急性神経障害であり、同時に娯楽目的でのMDMA使用の状況でも発生します2。急性症候群に関連して発生する気分のむら、学習、記憶障害の原因となる分子メカニズムはよく理解されていません3,4。 In situハイブリダイゼーションは、シングルセルレベルで発現する可能性のある特定のmRNAの検出と定量を可能にする強力な研究ツールです。in situハイブリダイゼーションを行う従来の方法は、目的の遺伝子を特異的にハイブリダイズする放射性標識リボプローブを利用することです。しかし、主な欠点は、この方法では複雑で時間のかかるプローブ調製とハイブリダイゼーションのステップ、およびRNaseフリーの環境で維持された新鮮な凍結組織へのアクセスが必要になることです5,6。

>jove_content<オリゴヌクレオチドプローブは、リボプローブ7に必要なものよりも短いRNA断片をハイブリダイズするために最近開発されました。さらに、プローブは特異性を犠牲にすることなく、低いバックグラウンドシグナルを生成する8。 この新たに開発されたプローブ技術は、免疫細胞化学研究室で一般的に入手可能なパラホルムアルデヒド接頭辞を有する脳組織上でin situハイブリダイゼーションを使用することができます。

ここでは、パラホルムアルデヒド接頭辞付きラット脳上のオリゴヌクレオチドプローブを用いたin situハイブリダイゼーションのプロトコルを説明し、新鮮な凍結脳5,6で観察された知見と比較します。このプロトコルは、MDMA物質の乱用が脳内の5-HT2A受容体遺伝子htr2a mRNAの変化を引き起こすという仮説を検証するために使用されます。まず、MDMA処理を行い、その後、パラホルムアルデヒド組織灌流、thr2aプローブのin situハイブリダイゼーション、データ解析を行いました。dapB(ジヒドロジピコリン酸レダクターゼをコードする細菌の遺伝子)はネガティブコントロールとして、ppiB(ペプチジルプロリルイソメラーゼBをコードするハウスキーピング遺伝子)はポジティブコントロールとして使用されることに注意してください。

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プロトコル

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以下で説明する動物の使用手順は、獣医、フロリダアトランティック大学のロス大学での施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって承認されました。無菌テクニックと手袋が必要ですが、このプロトコルを使用している間、RNaseフリーの環境は必要ありません。

1.準備

  1. 組織の調製と切片
    1. 三つのグループに無作為にラットを割り当てます;、SAL /接頭辞および/ ​​3,4-メチレンジ接頭辞新鮮/生理食塩水（0.9％のNaCl SAL）（MDMAを、 表1で詳細を参照してください）。
    2. 2時間間隔でSALとMDMAのグループに、腹腔内に、それぞれ1ミリリットル/ kgのSALおよび10mg / kgのMDMAの3用量を投与。動物は6日間の治療を生き残るためにできるようにします。
    3. 7日目に、深い麻酔（ すなわち 、角膜の点滅の損失とTAのためにラットに腹腔内に5mg / kgのキシラジンの組み合わせでは100mg / kgのケタミンの投与IL）は反射神経をつまみます。
    4. 新鮮/ SALグループの場合、速やかに（参考文献5で詳細を参照）、ラットを刎ねる、新鮮な脳のテストのための脳を削除します。
    5. SAL /接頭辞と接頭辞/ MDMAのグループの場合、胸骨約10 -12 cmのに沿ってカットを行い、その後、胸骨の終わりを公開します。
    6. 止血剤と胸骨の端を持ち、鋭いハサミで両側に横方向に振動板をカットして、肋骨と肺に平行全体に上方カット。
    7. 片手で、小さなピンセットで心臓の腹側先端を保持します。もう一方の手で、18 Gの注射針を用いて左心室を穿刺（針のアダプタ側を氷冷SAL及びパラホルムアルデヒドコンテナおよび蠕動ポンプにY字型のシリコンホースが接続されている注意してください。参照9を参照してください ）。
    8. 流量（約5 ml /分）の中レベルのSALポンプの電源をオンにし、リターンCIRCの脱出を可能にするために鉗子で右心房を穿刺ピュレーション。 30分間SAL灌流を維持します。
    9. 中レベルのパラホルムアルデヒドポンプの電源をオンにし、氷冷4％パラホルムアルデヒドを30分間動物を灌流することができます。
    10. 灌流装置を取り外して、動物を首を切ります。頭蓋骨の正中線を切断posteroanteriorを行い、その後、頭蓋骨の空洞10を露出するために頭蓋骨フラップ。
    11. 頭蓋骨の空洞からへらで脳を取り出し、4％パラホルムアルデヒドの25ミリリットルを含む50 ml遠心チューブに脳を置きます。 24時間4ºCの冷蔵庫でパラホルムアルデヒド含有チューブ内の脳をしてください。
    12. 3日間4ºCで30％ショ糖溶液25mlを含む50 mlの遠心管に脳に移動します。最後に、使用するまで-80℃でのビニール袋の中に脳を格納します。
    13. 埋め込むメディアとチャックの脳をマウントし、-26ºCの温度でクライオスタットで脳を含む埋め込むメディアを凍結します。新鮮なフリーズをカットnは20μmのセクションに脳とパラホルムアルデヒド接頭辞脳10μmのセクションに。セクションにスライドに触れることにより、RTの顕微鏡スライドにセクションを転送します。
    14. 空気乾燥、室温で4時間。使用するまで-80℃でタイトな密封された袋に切片スライドを保管してください。
  2. 脱水
    1. -80℃の冷凍庫からスライドを取り、3つのテストにセクションを割り当てる：HT2A、PPIB（ポジティブコントロール）またはのdapB（陰性対照）。ボールペンでマークとラベルのセクション（鉛筆は使用しないでください）​​。室温で5分間、100％アルコールでスライドを沈めます。ヒュームフード中で5分間スライドを乾燥させます。
  3. 前処理
    1. スライド上のセクションへの前処理-1試薬（アルカリホスファターゼの不活性化）のピペットを20μl。 （トレイが反応solutioからの蒸発を防止するための高湿度を維持するために、蓋で覆われていることに注意して水分トレイのラックレールにスライドを置きますN）。
    2. ゆっくり10分間低速で水平シェーカー上で水分トレイを振ります。 2分間の二重蒸留水 （ddH 2 O）で二回スライドを洗浄します。前処理-2試薬（パラホルムアルデヒド固定によって誘発される架橋結合の破壊）の150ミリリットルを含む200ミリリットルビーカーでスライドを沈めます。 100ºC（RNA構造11の熱による復元）で5分間の合計スライドをゆでます。
    3. 2分間のddH 2 Oで二回スライドを洗浄します。 5分間、100％アルコールでスライドを置きます。ヒュームフード中で5分間スライドを乾燥させます。組織セクションで選択した領域の周りに円を描くように疎水性のペンを使用して（例えば、 図2で説明したように視床と視床下部を含む非皮質構造）。
    4. ピペット10の各選択領域に前処理-3試薬（プローブの浸透の増加）のμL、および蓋を水分トレイをカバーしています。ハイブリダイゼーションオーブンでトレイを置きます水平シェーカーを搭載し、40ºCでオーブンの温度を設定します。 30分間穏やかトレイを振ります。 2分間のddH 2 Oで二回スライドを洗浄します。

2.ハイブリダイゼーションおよび増幅

  1. 選択された領域にそれぞれHTR2A、PPIBとのdapBプローブ試薬のピペット10μL、。試薬の蒸発を防止するための蓋付き水分トレイを覆います。静かに低速で水平シェーカーセットに振ります。 2時間オーブンで40ºCでスライドをインキュベートします。
  2. 2分間の洗浄用緩衝液で2回スライドを洗浄します。選択した各領域に増幅-1試薬のピペット10μL、30分間40ºCでスライドを振るとインキュベートします。
  3. 2分間の洗浄用緩衝液で2回スライドを洗浄します。選択した各領域に増幅-2試薬ピペット10μL、15分間40ºCでスライドを振るとインキュベートします。
  4. スライドを2回洗浄ワット2分間の洗浄バッファー番目。選択した各領域に増幅-3試薬のピペット10μL、30分間40ºCでスライドを振るとインキュベートします。
  5. 2分間の洗浄用緩衝液で2回スライドを洗浄します。選択した各領域に増幅-4試薬のピペット10μL、15分間40ºCでスライドを振るとインキュベートします。
  6. 2分間の洗浄用緩衝液で2回スライドを洗浄します。選択した各領域に増幅-5試薬ピペット10μL、室温で30分間スライドを振るとインキュベートします。
  7. 2分間の洗浄用緩衝液で2回スライドを洗浄します。選択した各領域に増幅-6試薬ピペット10μL、15分間室温でスライドを振るとインキュベートします。 2分間の洗浄用緩衝液で2回スライドを洗浄します。

3.信号検出

  1. 選択した各エリアにレッド試薬のピペット10μL（試薬は1:60の比率で赤-BとRed-Aの混合物であると私使用されるべきであることに注意してくださいmmediately）。 RTで水平シェーカー上水分トレイにスライドを置き、10分間低速で軽く振ります。
  2. 10分間（のddH 2 O）で2回スライドを洗浄します。 15分間オーブンで60ºCでスライドを乾燥させます。 5分間ヒュームフードの下でキシレンにスライドを置きます。ピペット選択した各領域にキシレン系取り付けメディアの20μLとカバーガラスでカバーします。

4.イメージキャプチャ

  1. 4×20×対物レンズの倍率で選択された領域（ 例えば、視床下部は、1と3図 ）のデジタル顕微鏡写真を取ります。画像ファイルを保存します。

5.画像の粒子解析

  1. ドラッグして、メインImageJのウィンドウに画像ファイルをドロップします。メニューバーに移動し、「イメージ」を選択し、隣のドロップダウン・メニューから「タイプ」を選択し、「8ビット」を選択します。
  2. 選択し、 'のThrを選択し、「調整」esholdは 'ダイアログボックスを開きます。不要なバックグラウンドが除去されるように、ダイアログボックス内の下のバーの値を調整します。その後、2番目のダイアログボックスを開くには、「粒子の分析」を選択し、メニューバーに移動し、「分析」を選択します。
  3. 10で粒子のサイズを設定し、次の「表示のアウトライン」を選択し、「結果の表示」と「集計」ボックスをオンにします。最後に、ダイアログボックスでパーティクルデータを表示するには「OK」をクリックします。

6.スプレッドシート計算

  1. Excelシートにデータを入力し、ベースラインとして、SALグループ内の粒子の数を平均します。各セクションのパーセンテージレベルを計算し、それに応じてグラフ（ 図4）を作ります。

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結果

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（NT <25）オリゴヌクレオチドのRNAプローブを用いて、ハイブリダイゼーションはパラホルムアルデヒド、接頭辞及び新鮮凍結脳から調製した視床下部細胞における赤い点として検出することができます。 HTR2Aの mRNA分子は、（実線の矢印で示される）いくつかの細胞中に存在するが、他のものではない（白抜き矢印）。我々は、パラホルムアルデヒド、接頭辞及び新鮮凍結組織（ 図1）との間に差がないことを観察しました。成功したハイブリダイゼーションは、肉眼（ 図2）により最初に評価することができます。我々はのdapBプローブとハイブリダイズ （丸印）選択した領域は、肉眼（ 図2A-B）に可視シグナルを示さなかったことがわかりました。対照的に、PPIBプローブとハイブリダイズ領域は均一領域全体に分配された信号を示した（ 図2C-D）を調べました。 HTR2A試験でながら、信号は、矢印で示す（一定の核内に存在します。

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ディスカッション

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in situハイブリダイゼーションテストの主な懸念事項の1つは、RNase酵素のためにRNA保存に使用される適切な技術を選択することです。これらの酵素が細胞や環境に広く存在し、結果に影響を与える可能性があることはよく知られています。しかしながら、酵素活性は、組織をドライアイス/アルコール溶液5,12に入れることによって迅速に区別することができる。リボプローブ13を使用したハイブリダイゼーションには迅速な保存が重要ですが、オリゴヌクレオチドプローブの実験条件についてはほとんど知られていません。オリゴヌクレオチドプローブを用いたこの研究では、パラホルムアルデヒドが接頭辞が付けられた脳と、氷/アルコール溶液中で素早く保存された新鮮な脳との間に差はないことがわかりました。これは、パラホルムアルデヒドをプレフィックスした脳RNAが、オリゴヌクレオチドプローブを使用したハイブリダイゼーションの品質に有意な影響を及ぼさなかったことを示唆しています。接頭辞付きの脳は新鮮な脳と比較して簡単に切片化できるため、このプロトコルはハイブリダイゼーションテストのための代替組織準備を提供します。

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開示事項

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著者は、彼らが競合する金融利害関係を有していないことを宣言します。

謝辞

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この研究は、NIHの助成金（R15DA029863）、フロリダアトランティック大学の学部研究助成金（M30014）と獣医学の研究助成金のロス大学によってサポートされていました。我々は、この作業のために（±）3,4-メチレンジ（±MDMA）を提供するための国立薬物乱用研究所（メリーランド州ロックビル）を感謝したいと思います。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
RNAscope ネガティブコントロールプローブ-DapB高度な細胞診断、INC310098
RNAscope Pretreat 4高度な細胞診断、INC320046
RNAscope 2.0 HD 試薬キット - Red高度な細胞診断、INC310036
RNAscope プローブ - Rn-Ppib高度な細胞診断、INC313921
Rat Htr2a高度な細胞診断、INC300031
クライオスタットライカCM 1850
水平シェーカーVWR88032-088
ハイブリダイゼーション オーブンサーモフィッシャーサイエンティフィック222000
スーパーフロスト プラス 顕微鏡スライドフィッシャー サイエンティフィック12-550-15
疎水性ペンベクトルH-4000
顕微鏡OlympusProvis AX70

参考文献

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