酵素中の水分子の輸送のためのチャネルは、活性部位の溶媒和と触媒作用に影響を与えます。ここで我々は、 シリココンピュータモデリングと実験に基づいて、これらの追加の触媒モチーフのエンジニアリングのためのプロトコルを提示します。これは、酵素触媒の溶剤ダイナミクスの影響についての我々の理解を向上させます。
この記事について
サマリー
要約
酵素触媒作用は水性環境で進化しました。しかし、触媒作用に対する溶媒ダイナミクスの影響は、現在十分に理解されておらず、通常は無視されています。酵素の水力学とそれに伴う熱力学的な影響の研究は非常に複雑で、コンピュータシミュレーション、核磁気共鳴(NMR)実験、熱量測定などが行われています。活性部位と周囲の溶媒とをつなぐ水トンネルは、溶媒の置換とダイナミクスの鍵となります。本明細書のプロトコルは、特異性、活性および熱力学に影響を与える水輸送のためのこれらのモチーフのエンジニアリングを可能にする。理論と実験に基づく生物物理学的フレームワークを提供することにより、ここで提示された方法は、コンピューターモデリングや生物物理化学の専門知識を持たない研究者でも使用できます。この手法は、水トンネルが閉塞した酵素変異体による触媒作用に関連するエンタルピーおよびエントロピー変化を測定することにより、分子レベルでの酵素触媒作用の理解を前進させます。このプロトコールは、膜結合酵素やその他の複雑なシステムの研究に使用できます。これにより、触媒における溶媒再編成の重要性についての理解が深まるだけでなく、タンパク質の設計と工学における新しい触媒戦略が提供されます。
概要
水は生命1の化学のための礎を構成しています。水のパターンと酵素活性部位の溶媒和は、疎水性効果2,3を越えて延びる非常に複雑な方法で1,2および触媒3リガンド結合のエンタルピーとエントロピーの両方に影響を与えます。 NMR 4は 、熱量2及び溶媒和タンパク質の分子モデリングは、リガンド会合5-8、特異性および活性2,9,10の駆動力を提供する際に、明示的な水分子の役割を解明するために使用されています。ここで我々は、酵素触媒反応の溶媒置換の熱力学的影響（ 図1）の実験的評価のためのユニークな方法論を提示します。私たちの組み合わせ戦略は、酵素工学、熱力学解析（ 図1）と協調してコンピュータシミュレーションを使用することに基づいています。これはCATAの溶剤ダイナミクスの影響に追加の光を流しを可能にします現在よく理解されていない溶解、。
溶媒和酵素活性部位中の水媒介性水素結合によって提供されるエンタルピー相互作用を安定化、エントロピーペナルティー1によって相殺することができます。バルク5内の水と比較して、これらのエントロピーコストは、タンパク質の空洞内に閉じ込められた水分子によって表示される自由度の低下と関連しています。注文した水の分子の放出は、このように、リガンドアソシエーション 1および触媒3のためのエントロピー駆動力を提供することができます。溶剤ダイナミクスの重要な側面は、タンパク質の内部と外部の溶媒4との間に水分子の変位です。活性化エネルギー、エンタルピー、エントロピー11で添付の変更が完全に分子レベルで理解されていません。個々の酵素の水の輸送を担当するトンネル、溶剤ダイナミクスの重要性と活性化への貢献を妨害することにより、エネルギーは、（ 図1）を評価することができます。また、異なる温度でワンポット動態実験を行うことによって、いくつかの基板の相対的な熱力学活性化パラメータは、実験の数の減少（ 図1、右）から抽出することができます。私たちの学際的な方法は、生活のための12重要度の高い多環式テルペンを生成する複雑な膜結合型トリテルペンシクラーゼ酵素のために検証されます。プロトコルは、標準的な遠心機を用いて、膜タンパク質の多量（10~20ミリグラム/ L）の回収を可能にします。
酵素が水に進化しているが、触媒反応を促進する溶剤の役割は、通常は無視されます。形状が遷移状態15に静電相補性を有する活性部位を事前に組織タンパク質のダイナミクス13,14に加えて、水のダイナミクスは、効率的な酵素触媒のための非常に重要である可能性があります。いくつかの学際的な技術を鍛造することにより、私たちの目的は、水力学と熱力学の非常に複雑な研究を促進することです。科学界へのこれらのツールは、よりアクセスしやすくすると、変更された活動や特異用酵素工学、タンパク質設計における新たな戦略の開発につながります。
プロトコル
1.インシリココンピュータモデリング
- タンパク質データバンク（PDB）から目的のタンパク質のPDB構造をダウンロードしてください。過剰のサブユニットを削除し、「セルの中和とp K予測」YASARA 16で実験を使用して、不足している水素原子と明示的な溶媒を添加することによって、構造を準備します。膜結合トリテルペン酸シクラーゼの場合、水箱の適切な寸法は91x67x77オングストロームです。手動で触媒的に活性なアミノ酸のプロトン化状態を調整します。
注意：必要に応じて、PDBファイル内の基質類似体は、「編集|スワップ|アトム」を使用して実際の基板に変更することができるコマンドを使用します。 - AMBER力場スイート17を使用して、 "エネルギー最小化」コマンドによって構造を最小化します。長距離静電相互作用を考慮するために、粒子メッシュエワルド法（PME）18を使用してください 。ファンデルワールス相互作用のカットオフを設定します。標準の設定に。
注：収束に達するまで「エネルギー最小化」コマンドは、次に短い最急降下最小化、シミュレーテッドアニーリングによって立体配座のストレスを取り除き（タイムステップ2フェムト秒、0.9ごとに10 番目のステップで縮小された原子の速度）が行われる（ すなわち、エネルギーの向上）200ステップの間に原子当たり未満0.012キロカロリー/モル。
活性部位溶媒和と水辺へのアクセスの2モデル
- シミュレーテッドアニーリングした後、20ナノ秒の分子動力学（MD）の軌道を実行して、「ファイル|名前を付けて保存|シミュレーションスナップショット」により、少なくとも10のスナップショットを生成する「シミュレーションで」に続くコマンド。カノニカルアンサンブルの下に周期境界条件で、標準的なコンピュータ上でシミュレーションを実行します。 Berendsenサーモスタットを使用して、298 Kの温度を維持します。
- 使用しているすべての水分子と最終的なリガンド/基質を削除することにより、2.1から取得したスナップショットを準備します4;編集|削除|重畳残基」オリジナルPDB構造上の個別のコマンド重ね合わ各スナップショット。 "|オブジェクト」コマンドは、すべての構造が同じ空間位置を共有していることを確認し、新しいPDBとしてこのように調製された各スナップショットを保存します。 （使用して「ファイル|名前を付けて保存| PDB」コマンド）-file。
経験豊富なモデラーの場合：注：補助コードファイル1に示したテンプレートに従って、このプロセスを自動化するスクリプトを記述します。 - ソフトウェア洞窟探検家3.0 19への入力として、3D空間に整列された2.2から調製したスナップショット（PDB）を使用します。スナップショットの限られた数の分析のために、標準的なコンピュータ上で洞窟探検家を実行します。水分子の輸送に特異的なトンネルの検出を確実にするために0.7オングストローム19のプローブ半径を使用してください。
- 分子グラフィックスソフトで洞窟探検家3.0で生成されたトンネルを可視化します。トンネルを簡単に視覚化するために、補助コードフィルに示すマクロを使用E 2。
シリコ酵素エンジニアリング3.水のパターンと水のダイナミクスを変更します
- 洞窟探検家3.0ソフトウェアから生成された出力ファイル「summary.txtに」に記載されているヘッダ「ID」によると最高ランクのトンネルを特定します。
- 最高ランクのトンネル（3.1）と、そのディスプレイ（2.4から得られたモデルを使用して）目視によるチャネル内部に向かって指している小さな側鎖を裏打ちするアミノ酸を同定します。 「スワップ残基」コマンドを使用して増加した立体障害によりトンネルをブロックします単一のアミノ酸置換を特定します。トンネルは目視検査によって妨害されていることを確認し、手順プロトコルの1.2から3.1を繰り返して。
変異遺伝子の発現4.
- 非重複プライマー20を使用して、突然変異誘発PCRによって、野生型遺伝子に変異を導入します。
- チューブに目的の遺伝子を含むプラスミドDNAを追加適切なクローニング株のコンピテント細胞との、30分間氷上でインキュベートします。 42℃に設定した温度で水浴中で45秒間熱ショック変換を実行します。新鮮な富栄養培地（2YT、16グラム/ Lのトリプトン、10グラム/ Lの酵母エキス、5グラム/ LのNaCl）の500μlを添加し、37℃、45分間200rpmでインキュベートします。適切な抗生物質を補充した寒天プレート上で形質転換細胞をプレーティングすることによって選択を行います。
- 変異遺伝子のDNA配列を確認した後、上記のように熱ショックを使用して、発現株にプラスミドDNAを形質転換します。膜結合トリテルペン酸シクラーゼの発現のために、BL21（DE3）を使用します。
- 適切な抗生物質を補充した2YTメディアにおける発現株の37℃で5ミリリットルO / N培養を開始します。
- 0.05から0.09の最終ODに、適切な抗生物質を補充した300ミリリットルの2YTメディアを含む、2 Lバッフル付き振盪フラスコに接種する（600 nmで測定）。 0.6から0のODで誘導した後。8およびタンパク質発現、-80℃で細胞ペレットを凍結保存します。
- pD861ベクターにおける膜結合型トリテルペンシクラーゼの場合、0.5 mMの2にして誘導タンパク質21の高収量を達成するために、37℃でラムノースと表現の4時間。
通常の遠心分離およびタンパク質の精製を使用して5膜抽出
- 以下の緩衝液を調製する： 再懸濁緩衝液 （100mMのリン酸カリウムを、プロテアーゼ阻害剤錠剤を補充してpH 7.5）、 界面活性剤緩衝液 （1％（v / v）のトリトンX-100、50 mMリン酸カリウム、pH7.5）を、反応緩衝液 （0.2 ％トリトンX-100、50 mMリン酸カリウム、pHは7.5）。
- スクアレン-hopeneシクラーゼまたはより低い最適pHと他の膜結合酵素は、クエン酸との再懸濁緩衝液中のリン酸カリウムを交換してください。 洗剤緩衝液 （1％トリトンX-100：このような酵素は、以下の緩衝液を使用するため、60 mMのクエン酸、pH6.0）で、反応緩衝液 （0.2％トリトンX-100、60 mMのクエン酸、pH6.0）で。
注：Hisタグは、精製のために使用される場合、20 mMイミダゾール（最終濃度）で再懸濁バッファーを補います。
- スクアレン-hopeneシクラーゼまたはより低い最適pHと他の膜結合酵素は、クエン酸との再懸濁緩衝液中のリン酸カリウムを交換してください。 洗剤緩衝液 （1％トリトンX-100：このような酵素は、以下の緩衝液を使用するため、60 mMのクエン酸、pH6.0）で、反応緩衝液 （0.2％トリトンX-100、60 mMのクエン酸、pH6.0）で。
- ガラスビーカー中の凍結した細胞ペレットを計量。 0.3グラムの細胞/ mlの最終濃度になるようにホモジナイザーを用いて再懸濁緩衝液中で細胞を再懸濁。 80％の振幅との1秒、1秒オフのパルスで超音波により溶解が再懸濁された細胞。 50秒ずつの3繰り返しサイクルを使用してください。
- 0.2％（v / v）の界面活性剤の最終濃度になるように界面活性剤緩衝液を加えます。転倒は、1時間4℃で混合することによって平衡化。 4℃で50分間、39,000×gで、単一の遠心分離工程の後に上清を保存することにより、膜タンパク質画分を回復します。
注：Hisタグ精製が使用される場合、約1.5ミリリットルのNi-NTAアガロース/ gのセルを追加し、1時間インキュベートします。 - 最初の精製を行いイオン交換またはHisタグ精製21のいずれか一歩。 0.2％トリトンX-100で平衡化し、溶出バッファーを補足。 10キロダルトンのカットオフを有する遠心式フィルターユニットを使用して精製したタンパク質を5回濃縮します。
注：界面活性剤の濃度のトリトンX-100ミセルの結果の大きさを約1％の最終濃度まで。 - 濃縮タンパク質と10 6×2×10 4 -8の球状タンパク質のための分別範囲と互換性マトリクスを用いた研磨工程ゲル濾過により精製をファイナライズ。バッファを実行しているように、反応バッファーを使用してください。製造業者のプロトコルに従ってウルトラブラッドキットを用いて精製されたタンパク質の量を測定します。
6.速度論
- 反応緩衝液中の基質の新鮮な5 mMのストック溶液を作ります。 2-5分間30％の振幅で超音波で均質なエマルジョンを得ます。
- サーモミキサーを平衡化所望の反応温度で行われます。外部温度計で水を含有するガラスバイアル内の温度を確認してください。
- 単一基板動態については、同一の最終基質濃度と少なくとも5ガラスバイアル中に乳化基質を希釈します。
- 複数の基板とのワンポット相対速度については、各バイアル内のすべての基板を混合することにより、少なくとも5つの同一のガラスバイアルを準備します。疎水性トリテルペンは、10〜200μMの範囲の最終基質濃度を使用しています。
- 10分間のサーモミキサーでガラスバイアルをプレインキュベート。酵素を加えて反応を開始します。 1 mlの総反応容量は適切です。少なくとも1200 rpmでの揺れの速度を使用してください。
- 500μlの酢酸エチルを加えることによって、異なる時点で反応を停止し、統合標準として、100μMのデカノールでスパイク。
7.抽出と熱力学解析
- によって反応混合物を抽出ボルテックスし、手動で1分間激しくガラスバイアルを振っ。室温で10分間、卓上遠心機で9,600×gでガラスバイアルを遠心します。空のチューブに上層（有機相）を転送します。反応チューブに抽出溶媒の追加の500μlを添加して、抽出手順を繰り返します。
- Na 2 SO 4で抽出された反応混合物を乾燥させます。 5秒間ボルテックスし、チューブを10分間休ませて。テーブルトップ遠心機を用いて室温で1分間9600×gで最後の遠心分離工程を実行します。ガスクロマトグラフィー（GC）バイアルに抽出したサンプルを転送します。
- （単一の基板動態のための）基板の少なくとも4つの異なる初期濃度と（単一の基板と競争力の動力学の両方のための）四つの異なる温度を用いて、対象となる各酵素変異体のために6.1から7.2の下で手順を繰り返します。
- 以前に3に記載されているように 、GC分析を行います。 hydrophobの分析のための非極性カラムを使用してくださいIC五品。 120℃に初期オーブン温度を設定し、5℃/分の温度勾配を使用して、製品および列に応じ。
- 生成物のピーク面積を積分し、（100μMに相当）の統合標準の面積を利用して、対応する生成物濃度に生成物のピーク面積を変換します。反応時間 （t）に対する各製品（[P]）の濃度をプロットします。 10％未満の変換に対応するデータポイントの線形回帰を実行します。初期反応速度（V 0）に応じた近似直線の傾きによって与えられます。
注意：複数の基板とのワンポット相対速度については、V 0は、他の基板の影響を受けて特定の基板の初期速度です。 - 単一の基板動態、プロットV 0の場合 / [E]。見かけの k cat / K M値は、に応じて、グラフの直線部分の勾配によって与えられます。
[S]は基質の濃度と[E]変換に使用される酵素の濃度である。 の k cat / K M は、ミカエリス定数を超える触媒定数に相当します。各温度および各酵素変異体のための分析を繰り返します。 - 単一基板動態については、遷移状態の理論22によれば、熱力学的解析を行います
K bはボルツマン定数、Hプランク定数、Tはケルビン温度であり、気体定数をR。 K（（LNのプロットの線形回帰分析を実行しますT対UB>猫/ K M）/（（k 個の B * T）/ H）））。活性化エンタルピー（ΔH‡）は、R *および活性化エントロピー（ΔS‡）は （インターセプト）* Rで与えられる（-slope）で与えられます。
注：同様に、飽和基質濃度で分析し、式3の一定の割合としての k cat を用いて行うことができます。 - 複数の基板とのワンポット相対速度は、相対的な見かけを得ます
23からの k cat / K M値 ：
（ の k cat / K M）A /（ の k cat / K M）B = V 0、A / V 0、B * [B] / [A]（4）
これは、V 0、Aは基板Bとの競争の中で基板Aの初期速度を指します - ワンポット相対KIについて複数の基板とneticsは、非線形回帰により、としての基準に比べて、Bの活性化の相対的な熱力学的パラメータを取得します。
- 参照化合物Aの活性化エンタルピーおよびエントロピーの基板Bの絶対活性化パラメータを計算します。
結果
酵素polycyclization触媒の水のダイナミクスの重要性は、 インシリコ分析し、検出したトンネル（2ファイル補助コードでスクリプトを使用して）のその後の可視化により関与しています。プロトコルのセクション3以下、S168は、 アリのアシドカルダリウスからトリテルペン酸シクラーゼ酵素におけるトンネルの内側を覆う「ホットスポット」のアミノ酸残基（ 図1、左中央）であることが見出されました。目視検査（ 図1、左下）に見られるようにin silicoでの変異S168Fを導入することにより、トンネルが阻害されます。
トリテルペン酸シクラーゼ酵素によって表示される多環式生成物の形成のための反応速度は、温度（ 図2A）に非常に敏感です。プロトコル（セクション4-7）に続いて、それは見かけ上の k cat / Kことが判明しました図2A）で発生するとB>五生成物の形成のために、野生型酵素によって表示されたMが50倍増加します。単一点突然変異を導入することによって、個々のトンネルをブロックする実験絶対見かけの k cat / K M値を決定した上で、並びにそれらの温度依存性（ 図2A）に大きな影響を与えます。
実験的に決定された運動パラメータから、熱力学的線形プロットは、式3によって、および単一の基板動態（ 図2B）のためのプロトコルのセクション6-7に従うことによって生成されます。ブロックされたトンネルを保有する変異体について観察された活性化エントロピーとエンタルピーに非常に大きな変化はpolycyclizationカスケード（ 図2C、 図2Bに基づいて計算）を促進する上での水の動態のための重要な役割を示唆しています。また、変更された水のトンネルは活性化の変更ギブスの自由エネルギーを表示すると、バリアント（ΔG‡=ΔH‡ - T *ΔS‡、 図2B-C）。例えば、303 KでS168Fトンネル変異体は、野生型酵素の16キロカロリー/モルに比べて14キロカロリー/モルの活性化のギブスの自由エネルギーが表示されます。
セクション7のプロトコルに続いて、式（4）は、ワンポット運動の実験（ 図3A）からの追加の基材の見かけの k cat / K M 値の計算を可能にします。また、線状の熱力学的プロット（ 図3B）は 、異なる温度（式5）で競争エッセイを実行することにより構築することができます。単一の基板動態と同様に、参照化合物と比較して、追加の基質に対する相対活性化エンタルピーとエントロピーはreadilです線形の切片と傾きからアクセスyは実験データにフィットします。活性化の熱力学的パラメータの絶対値は、参照化合物（式6）に関連付けられた熱力学データを用いて算術加算して評価することができます。本明細書のプロトコルを使用して、生成された結果は明らかにブロックされた水のトンネルを有する膜酵素変異体は、異なるサイズ（ 図3C）の基質に対する活性化の根本的に異なる熱力学的パラメータを表示することを示しています。
図1.プロトコルの概要： シリココンピュータモデリングにおける実験タンパク質の設計と熱力学解析と協力して、酵素触媒反応の溶媒ダイナミクスの影響を強化理解することができます。 クリックしてくださいここで、この図の拡大版を表示します。
単一基板動態からの野生型及びトンネル変異体の活性化の図2熱力学パラメータ（A）実験データから、および遷移状態の理論を用いて、式1および2（B）熱力学的分析を用いて得られた見かけの k cat / K M値 （B）中のプロットから計算された活性化の3（C）熱力学的パラメータを方程式に実験データとの線形フィット。予め折り畳んだスクアレン基板が。形成/点線のように壊れ結合で示されている。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
異なる基板用の野生型およびトンネルの変異体の活性化の図3.熱力学的パラメータを設定します。（A）式に別における動データの4（B）熱力学的プロットを使用して、ワンポット反応速度から得られた相対の k cat / K M値式5（C）は、式6によって、基準として図2の基板のスクアレンを用いて算出活性化の絶対熱力学的パラメータを用いて温度。債券形成/基質で壊れては点線で示されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
ディスカッション
野生型膜酵素とトンネルの変形のための高品質な実験熱力学データを達成する上で最も重要な手順は次のとおりです。コンピュータモデルの1）の生成; 2）均一に精製されたタンパク質; 3）基板の株式を乳化。 4）反応速度の際の温度を制御します。 5）内部標準を用いて反応混合物を抽出します。
コンピュータモデルの生成が大幅にさまざまなプラットフォームをサポートし、ユーザーフレンドリーなインターフェイスを持つソフトウェアを使用することによって促進されます。したがって、このプロトコルはあっても、非専門家をモデル化する当社の戦略にアクセスできるようにするYASARAモデリングスイート16を前提としています。水トンネル識別するためのコンピュータ・モデルは、理想的には、関心24の酵素の結晶構造に基づくべきです。この目的のために、タンパク質データバンクで利用可能な結晶構造の豊富で非常に有益です。我々の経験、TEMの調製に成功した中で重要な側面でトンネル識別用のプレートは、結晶水を維持することです。これは、通常のコンピュータ上で実行することができ、分子動力学シミュレーションを実行する際に溶媒和酵素ボックスを使用することが等しく重要です。 アリアシドカルダリウスからトリテルペン酸シクラーゼは、MDシミュレーション3の間に水に安定しています。しかし、結晶の界面活性剤を保持および/または細胞膜模倣物を使用して、おそらく、拡張MDシミュレーションを可能にするために潜在的に不安定な酵素のために必要とされるであろう。これは、トンネル組織の動的な側面を捕捉しないであろうが、非常に困難な目標の最小化結晶構造は、プロトコルを使用して、重要な機構的洞察を提供し得ることが想定されます。
単一または入力として、スナップショットの限られた数の基本モードの洞窟探検家19は 、標準のラップトップ上の非専門家が使用することができます。我々の経験3に基づいて、ボトルネックの半径トンネル（ すなわち、半径最も狭い点で）よりも小さい1オングストロームは、結晶水の分子が予測トンネル中央の左側（ 図1）内に存在する場合は特に、水のために非常に関連することができます。一方、大きなボトルネック半径が活性部位10の内と外基質の輸送のためのトンネルを意味可能性があります。補足コードファイル2のスクリプトは、予測トンネルの視覚化のために非専門家が使用することができます。今後の実験では、相同性モデルは、水のネットワークとダイナミクスの原子論的研究を可能にするために十分な高解像度になりますかどうかを明らかにします。活性部位に存在するリガンドととせずに、分子動力学シミュレーションを実行する方法に光を流し、トンネル識別のプロセスも重要であろう影響を与えます。
膜タンパク質の動力学は、手ごわい挑戦25を構成することができます 。プロトコルは、本明細書において、単純な膜抽出プロトコルに基づいていますこのような超遠心分離機のような高価な装置を使用せずに膜酵素を得ました。最終研磨工程としてのゲルろ過を使用することは、潜在的な残留膜の粒子を除去し、適切な界面活性剤の環境25を定義することができます。
プロトコルから再現性の運動の結果を達成するための重要な側面は、超音波による基質ストック溶液を乳化することです。反応緩衝液で希釈し、疎水性基板の簡単なボルテックスは、不均一な基板界面活性剤の混合物を与えます。非乳化基質溶液のピペッティングは、初速度の正確な決意を妨げる（定量GCにより確認）再現不可能な濃度をもたらします。これとは対照的に、適切に乳化ストック溶液のピペッティングは、0.98から0.99の範囲のR 2と初期速度の線形回帰分析をもたらすべきです。疎水性基材のもう一つの重要な側面は、見かけの基質の溶解度であります基板界面活性剤の混合物で利用可能。実際には、基準基板のスクアレンを有するトリテルペン酸シクラーゼを飽和させることはできませんでした。この理由のために見かけの k cat / K M値を結合し、化学の両方からの寄与を含んでいる可能性があり、本明細書に提示されています。しかし、化学物質は、トリテルペンシクラーゼ3によって行わpolycyclizationカスケードのための k cat / K Mのための律速であることが示されています。
これは、外部の温度計との反応のガラスバイアル内部の実際の温度を確認するために非常に重要です。それでも、線形フィットは、異なる温度で本質的な一定の見かけの k cat / K M値を有する変異体のために貧しいことができます。これは、ゼロに近い活性化エンタルピー（ 図2Bおよび2C）と、本明細書S168F変異型（ 図2A）のために強調されています。非常にSmaI見かけの k cat / K MにおけるLの温度依存性変化は、観察された活性化エントロピーΔS‡（ すなわち、 図2Bの線形プロットでインターセプト）の不確実性を誘発する可能性があります。原理的には、観察された活性化エントロピーは、タンパク質濃度を測定することによって検出されない種々のバリアントの活性酵素の異なる存在量によって影響を受ける可能性があります。これは、ワンポットでいくつかの基材を混合したときに実験誤差が低減されることが予想されます。すべての異なる基板は、これらの状況下での酵素の同じ量（式4）と相互に作用するためです。抽出溶媒の使用は、内部標準を抽出および/またはGC注入の間の差異を考慮することが重要であるとスパイク。
遷移状態理論に成功酵素学26で使用されています。この重要な理論的枠組みは、もともとドでした気相中での単分子反応のためのveloped。しかし、酵素は、主に古典的な活性化エネルギー障壁26を下げることによって働くことが示されています。透過係数は1本明細書中では、測定活性化エンタルピーおよび/またはエントロピーに影響を与える可能性があると仮定します。トンネリングの寄与、及びそのような遷移状態のrecrossingなどの他の非古典的効果は、おおよそエネルギーの約4キロカロリー/モルに相当する触媒26に千倍に貢献することができます。これは、野生型酵素（328 K、 図2Cで16キロカロリー/モル）で表示された活性化エントロピーは、不均一な透過率に起因する、非古典的な効果よりもはるかに大きいことが分かります。プロトコルを使用して、野生型およびトンネルバリアントの活性化の熱力学的パラメータを比較した場合の透過係数の影響は減少するはずです。
活性化のギブスの自由エネルギー（ΔG‡）がコンポです（ - T *ΔS‡）用語エンタルピー（ΔH‡）とエントロピーの両方のsed。触媒中の酵素では、溶媒再編成は、両方のパラメータに影響を与えることができます。現在のプロトコルが必要な生物物理学的実験フレームワークと関連し、in silicoでユーザーフレンドリーな計算ツールのツールボックスを組み立てることにより、これらの現象の研究を促進することが期待されます。この方法は、膜結合酵素による触媒反応を含む酵素プロセスの多数の研究に有用であることが想定されます。
開示事項
著者らは開示するものは何もない。
謝辞
スウェーデン研究評議会(VR)は、若手研究者助成金#621-2013-5138により、この研究に対する財政的支援に対して大いに認められています。KTH王立工科大学のPDC Center for High Performance Computingは、計算サポートを提供することで認められています。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| ヤサラ | ヤサラ・バイオサイエンス | http://www.yasara.org/ | 分子モデリング・シミュレーションプログラム |
| 洞窟 | CaverSoft | http://caver.cz/ | タンパク質中のトンネル分析用ツール、アカデミック用無料ライセンス |
| Bradford Ultra | Expedeon | BFU1L、BFU05L | 最大1%の界面活性剤を含む溶液中のタンパク質定量 |
| Potter-Elvehjemホモジナイザー | VWR | 432-0205, 432-0217 | 凍結細胞ペレットの均質化 |
| プロテアーゼ阻害剤カクテル錠 | Roche | 4693159001 | プロテアーゼ阻害剤 |
| フィルターユニット | ミリポア | UFC901008 | タンパク質濃縮用遠心フィルターユニット、MWCO 10 kDa |
| サーモミキサー | Eppendorf | 5382000015 | Thermomixer サンプルインキュベーション用 |
参考文献
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