マイクロトロイドの光共振器を用いたラベルフリー単一分子検出

Summary

私たちは、溶液中の単一分子を検出できるFrequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator(FLOWER)として知られる光共振器技術に基づくラベルフリーのバイオセンシングシステムを開発しました。ここでは、この作業の背後にある手順を説明し、提示します。

Abstract

ダウン単一分子の限界に分子の低濃度を検出することは、そのような疾患の早期発見、および分子の挙動に関する基礎的研究などの分野に影響を与えています。単一分子検出技術は、一般に、蛍光タグまたは量子ドットなどのラベルを使用し、しかし、ラベルは常に利用可能ではない、コストと複雑さが増大し、研究されているイベントを乱すことができます。光共振器は、ラベルを使用せずに単一分子を検出するための有望な手段として浮上しています。現在、溶液中の非plasmonically増強裸光共振器システムによって検出された最小粒子が25nmのポリスチレン球¹です。私たちは、この制限を超えると水溶液^2のラベルフリーの単一分子検出を達成することができ、周波数ロック光ウィスパリングエバネッセント共振器（フラワー）と呼ばれる技術を開発しました。信号強度は粒子体積に比例するように、私たちの仕事は、> 100倍improvemeを表しNT現在の技術水準を超える信号対雑音比（SNR）です。ここFLOWERの背後にある手順は、フィールドでの使用を高めるために提示されています。

Introduction

単一分子検出実験は、疾患の早期発見のために、及び^分子 3の基本特性を調べるために、バイオセンサーに使用される分析物の量を減少させるために有用です。このような実験は通常、ラベルを使用して実行されますが、ラベルは、特定のタンパク質を得ることが常に可能ではない、コストを増加させ、オンサイト実験やポイント・オブ・イベントが検討されて乱すことができ、かつ不便であることができ、特にリアルタイムのためのケア診断。

無標識バイオセンシングのための現在のゴールドスタンダードは、表面プラズモン共鳴⁴であり、ただし、商業表面プラズモン共鳴システムは、典型的には、nMの程度の検出の典型的な下限を有します。最近では、光共振器は、ラベルフリー単一分子の生物学的検出のための⁵有望な技術として浮上しています。光共振器は、光^6,7の長期（NS）閉じ込めに基づいて動作します。光がエバネッセントです一般的に光ファイバを介してこれらのデバイスに結合されました。光ファイバを通過する光の波長が共振器の共振波長と一致すると、共振器に効率的にカップルを点灯。この結合された光は、全内部共振器の周付近にエバネッセント場を発生させる共振器の空洞内に反映されます。粒子は、共振器、 ^粒子 8の体積に比例して共振器の変化の共振波長にエバネセント場とバインドを入力します。

検出能力の点で、微小球共振器は、以前の（100 nm）の^9,10ウイルス粒子の単一のインフルエンザを検出するために使用されてきました。最近、plasmonically増強微小球光共振器は、 ^分子 11と8マーのオリゴヌクレオチド^12を 、単一のウシ血清アルブミンを検出するために使用されている、しかし、このアプローチは、デ0.3ミクロン²に粒子捕捉領域を制限します副。大きなキャプチャエリアのバイオセンサーは、粒子検出の可能性を最大化するための理想的です。 （> 100μmの^2）大と現在のソリューションベースのラベルフリーバイオセンシング技術領域をキャプチャポリスチレン粒子≥25 nmの検出に限られていました。

我々は、溶液中の単一分子の時間分解検出が可能な周波数ロック光ウィスパリングエバネッセント共振器（フラワー^）13（ 図1）として知られている光共振器技術に基づくラベルフリーバイオセンシングシステムを開発しました。花がダウンして、単一のタンパク質分子に小さな粒子を検出するために、周波数ロックフィードバック制御、バランス検出、計算フィルタリングと組み合わせたマイクロトロイドの光共振器の長い光子寿命を使用しています。周波数ロックの使用は、掃引またはレーザ波長を走査する必要なしに、粒子を結合するように、システムは、常に、マイクロトロイドのシフト共鳴を追跡することができ大規模な範囲です。 FLOWERの原理は、プラズモン増強を含む​​他の技術の検出能力を向上させるために使用することができます。以下では、FLOWERを実行するための手順が記載されています。

Protocol

1。実験のセットアップとサンプルの調製

1. 以前に⁶説明したように、リソグラフィ、エッチング、および融解手順を使用して、マイクロトロイドを製作。一般的に80〜100ミクロンの主要な直径を有するシリコンウェハ（チップ）の上にマイクロトロイドを製作し、2μmの短径。
2. その繊維スプールからおよそシングルモード光ファイバ（125μmのクラッド、4.3ミクロンのモードフィールド径）のメーターをおくつろぎください。
3. 光ファイバの巻き出し部分の途中に、ワイヤーストリッパーを使用して光ファイバの周りにポリマーコーティングの小部分（2.5センチ）ストリップ。注：これは、マイクロトロイドにエバネッセント光を結合するために使用される光ファイバの一部です。
4. イソプロパノールアルコールとフリーワイプリントでストリップ繊維をきれいにしてください。
5. 磁気クランプ製のファイバホルダを使用して所定の位置に光ファイバのこの部分を持ってください。
6. MELTINによって〜500 nmの薄い取り除か繊維グラム水素トーチ60ミクロン/分の速度で反対方向に動く2ステッピングモータを使用して引っ張ります。 〜10ミリメートル背が高くあるべきである炎の上部、内部に光ファイバを配置します。ファイバを通して送信は（オフに繊維点滅から横方向に散乱した光を見て）、またはオシロスコープに接続されているフォトダイオードに光ファイバを接続することにより、視覚的に監視することのできる、変動停止したときに、繊維を引っ張って停止。
7. 光ファイバの一端を切断し、裸ファイバアダプタに挿入します。受光の入力に繊維のこの端を置きます。
8. 光ファイバカプラを使用してレーザーのファイバーカップル繊維スプールのもう一方の端を。
9. エポキシ又は両面テープのいずれかを使用して試料ホルダーの上にマイクロトロイドチップ（ステンレス鋼37.8ミリメートル×6.4ミリメートルX 3.2ミリメートル）を配置します。
10. 3軸ナノポジショニング（Nで構成位置決めステージの上に試料ホルダーをマウント3軸マイクロメータの上anocube）ステージ（機器リストを参照してください）​​。振動を最小限に抑えるために、空気圧で分離された光学テーブル上のすべての実験を行います。
11. 粗位置3軸マイクロメータを使用して、サンプルチップ。
12. ナノポジショナーを使用して光ファイバにマイクロトロイド含有チップ並列の位置を合わせます。注：入力光（〜633 nm）での1波長の距離内にマイクロトロイドの位置を合わせます。このプロセスの可視化のための2つの撮像列使用上、チップの側に位置する（対物レンズとカメラとチューブを、機器リストを参照してください）​​。
13. 偏光を調整するつまみで（機器のリストを参照）、インライン偏光制御器を用いた光ファイバを介して照射されるレーザ光の偏光を最適化します。注意：光ファイバの伝送で測定されたディップが狭く表示されたときに最適な偏光が達成されます。 （詳細については、ステップ2.2を参照）、オシロスコープ上でこのディップを守ってください。
14. 構成しますスペーサーとしてガラス顕微鏡スライドを用いて、試料ステージの上にカバーガラスをepoxyingにより試料室。注：全体のセットアップを覆うプレキシグラスエンクロージャは、空気の流れを最小化するために有用であり得ます。小さな開口部は、チューブを使用してポンピングするためのソリューションを可能にするようにしておく必要があります。
15. 熱RT水浴（〜500 mL）中≥1時間粒子懸濁液または単一分子の水性溶液を平衡化。注：サンプルは、メーカー、 例えば 、PBSまたはHEPESから指定された関連したバッファを使用してマイクロ遠心チューブに所望の濃度に希釈します。いかなる結合事象が検出されない場合、緩衝液の塩濃度を増加させます。
16. 〜2秒のためのソリューション（1ミリリットル）を簡単に含む渦粒子。
17. 1mlシリンジポンプを用いて1ml /分で試料チャンバに溶液を含む粒子を注入します。
18. 試料室を充填した後、シリンジポンプをオフにします。
19. 最小限に抑えるために、データを記録する前に30秒待ってください測定に影響を与えることができ、流体の流れに起因する機械的振動の影響。

2.周波数のロック

1. カップリングが原因で流体の注入に邪魔されるため、ナノポジショナーと試料ホルダーを移動させることにより、光ファイバに再結合しトロイド。
2. 様々な波長を介してコンピュータ制御入力レーザを走査することにより、マイクロトロイドの共振波長の位置を確認します。レーザの波長を調整するレーザコントローラ内の圧電素子に三角波電圧信号を送信することによって、この手順を実行します。この波長での水の光の低い吸収があるため、可視光（2.5 nmの±635 nm）を用いた実験を行います。
3. オートバランス受光に光ファイバの出力を接続することにより、光ファイバを介して光透過率を測定します。 BNCケーブルを使用して、オシロスコープに受光の出力を接続します。 O観察nはマイクロトロイドの共振波長において、光ファイバを介して伝送が低下オシロスコープ。
4. ケーブルを介して（機器のリストを参照）、周波数ロックフィードバック制御装置の主入力に受光の出力を接続します。
5. 2 kHzから19 FMの波長振動の振幅のディザリング周波数を持つトップのピークロックを使用して、オートロックモードでフィードバック制御をロックする周波数を実行します。経験的に、チーグラー・ニコルスのチューニング規則^{14を使用して、}ソフトウェアのウィンドウで、比例・積分・微分設定値を設定します。注：これらの値は、すべての実験の開始時に一度設定するだけで済みます。
6. マイクロトロイドの共振波長に対するレーザの波長を自動ロック。試料室を充填した後、この手順を実行します。注：波長シフトが大きすぎる場合には、フィードバック制御がロックを失うことになると自動的に共振波長の位置を見つけるために走査モードに切り替えます。このOC波長に対するCURSは約1線幅（ここでは調査したすべてのシステムのために少なくとも600 FM）よりも大きくシフトします。
7. 24ビットのデータ・アクイジション・カードを使用して、20 kHzでフィードバック制御器の出力を記録します。データ収集ソフトを経由してテキストフ​​ァイルとしてデータをエクスポートします。

3.データ処理と解析

1. フーリエ変換は、MATLABのデータを変換します。
2. ローは、2 kHzで課されるディザ周波数を除去するために、1 kHzでカットオフを持つ「ブリックウォール」フィルターを使用してデータを渡す（補足コードスクリーンショット1ファイルを参照してください）​​。
3. 計算ノッチ16ヘルツのウィンドウサイズを使用してデータをフィルタリングします。注意：これは、この場合には、ノイズの既知のソースを除去するために行われ、60 Hzの電子線ノイズとその高調波、（レーザドライバからの）だけでなく、100ヘルツとその高調波（補足コードスクリーンショット1ファイルを参照してください）​​。
4. 逆フーリエ変換は、時間領域に戻ってデータを変換します。
5. メディアンフィルタウィンドウを使用してデータ1,001サンプルの大きさ（補足コードはスクリーンショット2ファイルを参照してください）​​。
6. Kerssemakers ら ¹⁵のステップ発見アルゴリズムを用いて、共振波長のステップ変化を探します。
7. 各結合工程の振幅のヒストグラムを生成します。
8. 式を使用して粒子サイズを計算します。 （1）（説明を参照）。

Results

粒子結合事象は明らかに時間をかけてマイクロトロイドの共振波長の階段状の変化（ 図2A）と見られています。これらのステップの高さは。 図2Bのグラフとして示さ2-4はそれぞれ、代表エキソソームの結合からのトレース（nanovesicles）、5 nmのシリカビーズ、および単一のヒトインターロイキン2分子を示しています。階段状のイベントは、粒子サイズにスケーリングするということは、技術が正しく行われたことを示しています。以下に説明するように、これは、ステップの高さ（ 図2B）のヒストグラムを生成し、理論的な予測に観察された最大ステップ高さを比較することによって分析することができます。

トロイドセンシングシ...

Discussion

粒子が結合するように、トロイドは増加の共鳴波長（λ）。粒子がアンバインドした場合、共振波長は、それに応じて（ステップダウンイベント）を減少させます。粒子径（d）は、各波長ステップの振幅のヒストグラムを介して決定することができます。各波長ステップの高さは、結合した粒子の大きさの変化に起因し、粒子が結合マイクロトロイドの位置により変化。粒子が電界（E _{0、MAX）は最大}でマイクロトロイドの赤道に結合すると共鳴波長（ステップ高さ）の最大変化が起こります。この最大ステップ高さ（Δλ）は 、式を通じて粒子径に関連しています。 ^（1）8、粒子半径であり、Dは、結合した粒子の屈折率と周囲の媒体に基づいて、誘電率、V _mはガーゼのモード体積でありますマイクロトロイドの中tは、有限要素シミュレーション²を通じて決定し_、E 0（R

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
波長可変半導体レーザー	ニューポート	TLB-6300
レーザーコントローラー	ニューポート	TLB-6300-LN
周波数ロックフィードバックコントローラー	トプティカ フォトニクス	Digilock 110
オートバランスフォトレシーバー	ニューポート	モデル 2007
インライン偏光コントローラー	ジェネラルフォトニクス	PLC-003-S-90
24ビットデータ集録カード	National Instruments	NI-PCI-4461
Recombinant human interleukin-2	Pierce Biotechnology	R201520
20 nm ポリスチレンビーズ	Thermo Scientific	3020A
NanoCube XYZ Piezo Stage	Physik Instrumente	P-611.3
光学テーブル	Newport	VH3660W-OPT
イメージングコラム用対物レンズ	Navitar Machine Vision	1-60228
イメージングコラム(アダプターチューブ)	Navitar Machine Vision	1-60228
イメージングコラム用高解像度CCDカメラ	エドモンド・インダストリアル・オプティクス	NT39244