このプロトコルは、解剖実験的に操作し、ニワトリ胚の培養全体の網膜外植する方法について説明します。高い成功率、有効性と再現性をエレクトロポレーションおよび/ または試薬物質、 すなわち、酵素阻害剤のためのプラスミドの効果をテストするために必要な場合、外植片培養は便利です。
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この記事について
サマリー
要約
網膜は、発展途上の中枢神経系のための優れたモデルです。 OVO / in vivoでの実験操作のための目のサイズが大きいと、最も重要なアクセシビリティ鶏胚網膜汎用性と非常に効率的な実験モデルを作成します。鶏の網膜は眼内注射またはエレクトロポレーションによって卵内標的にするのは簡単ですが、網膜内の試薬 の効果的かつ正確な濃度は、完全に制御することが困難な場合があります。これは、眼または物質の不均一な拡散の正確な注射部位、漏れの変動に起因し得ます。さらに、このようなエレクトロポレーションなどの侵襲的な操作後の奇形や死亡の頻度はかなり高いです。
このプロトコルは、ニワトリ胚から全網膜の外植片を培養する技術OVO EXを記述し、試薬に網膜の制御された露光のための方法を提供します。プロトcolが実験的に、解剖操作、ニワトリ胚の培養全体の網膜の外植する方法について説明します。外植片は、約24時間培養することができ、例えば、エレクトロポレーションのような別の操作に付すこと。主な利点は、実験は、胚の生存に導入試薬の濃度を変化させると効果的な濃度を決定し、最適化するために制御することができる依存しないことです。さらに、この技術は、その高い実験成功率とともに、迅速、安価であり、それは再現性を保証します 結果。それは卵内行われた実験に優れた補完するものとして機能していることを強調すべきです。
概要
網膜は中枢神経系の一部であり、その相対的な簡単さと十分に特徴付け細胞構造、中枢神経系の発達を研究するための人気のあるモデルです。ニワトリ胚の眼は、胚の残りの部分に比べて相対的に大きいです。従って、このような注射またはエレクトロポレーションなどの実験操作のための卵内に容易にアクセスでき、網膜細胞や生体内で発生生物学に関する知識を得るための優れたツールとして機能します。実験は、エレクトロポレーション、反復注射、または組み合わせた実験操作と同様に侵襲的であるとき、これらの主要な利点にもかかわらず、胚の生存率は低くすることができます。
卵内ニワトリ胚へのDNAプラスミドのエレクトロポレーションは重要であり、十分に確立された技術1です。これは、神経細胞の標識化を可能にする細胞の運命の追跡だけでなく、中央NERVにおける神経管OUのシステムは、それがインビボでタンパク質機能を解析するための異所性の遺伝子発現を可能にします。技術は、3後脳、および4網膜、神経管2の研究のために使用されてきました。 卵内胚網膜のエレクトロポレーションは、in vivoでの状況に関連したいくつかの実験の困難を持っています。胚の頭蓋折りたたみに起因する目の位置は、心臓に比較的近いです。この接近は、エレクトロポレーション....
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プロトコル
このプロトコルは、「ビジョンと眼科での研究のための協会の実験動物の管理と使用に関する指針」の推奨事項に従って行われます。
1.卵取り扱いとアイコレクション
- 1週間以上、もはや用に12〜14℃の白色レグホン卵を保管してください。可能な場合は、受精卵を保存する冷蔵ワインクーラーを使用しています。
注意：より低い温度では死亡率を増加させながら、高い店の温度は、胚の異常な開発につながります。拡張ストレージ時間が死亡し、異常な開発の両方を向上させます。 - 穏やかに24時間あたり5回の頻度でロッキングと37.5°Cで卵と60％の加湿卵インキュベーターをインキュベートします。
- 希望胚年齢で卵のインキュベーターから培養した卵を削除します。
注：ニワトリ胚の年齢は、インキュベーションの時間として決定され、胚日（E）として、または段階として示される（ST）、ハンバーガーとハミルトン12で説明した発達段階の一連に従って。 - 層流フード内で選択された卵を置きます。胚の汚染を避けるために70％エタノールで卵殻を拭きます。
注：滅菌溶液を無菌条件下ですべての手順を実施 https://www.jove.com/science-education/5030/making-solutions-in-the-laboratory"lutions そして、楽器。....
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結果
このプロトコルは、ニワトリ胚からの全体の網膜の外植片の準備（ 図1A-F）および培養について説明します。このプロトコルが正常にST31にST20（E3）の胚からの全体の網膜外植（E7）のために使用されています。
全網膜外植片へのDNAプラスミドのエレクトロポレーションは、網膜前駆細胞の標識および追跡のためにまたは過剰発現の異なる遺伝子産物のことができます。エレクトロポレーション実験のために、色素上皮を慎重ST25（E4 1/2）胚の除核眼から削除されました。全網膜外植片を、次いでDNAプラスミド溶液を含むキュベットに入れ、電極（ 図2A）に沈めた後、電流を印加しました。培養の24時間後、GFP陽性細胞は、無傷の網膜（ 図2B）の大部分が見えました。切片後、単一のGFP +細胞を簡単に網膜（FIのapico-基底軸に沿って検出されましたグレ2C）。エレクトロポレーションは、プラスミドを占有し、レポーター遺伝子を発現する大網膜の領域をもたらしました。エ.......
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ディスカッション
この作品では、切開、エレクトロポレーションまたは化学的処理、およびニワトリ胚からの全体の網膜の外植片を培養するための詳細なプロトコルが提示されています。このプロトコルは、迅速、簡単であり、高い成功率と再現性の両方を可能にします 結果。
全網膜外植片のエレクトロポレーションは、対象の遺伝子構築物を発現する細胞の大部分を生成します。これは、正確に電極を配置することと定義されるDNAプラスミド濃度に網膜の特定の部分を露出することが容易です。このアプローチは、 卵内電気穿孔と比べて一般的に高い成功率と網膜における遺伝子機能を研究するための信頼性の高い方法を可能にする。全体の網膜外植も与える化学試薬の規定された濃度を含む培地に網膜を露出させることが可能となります神経網膜中の試薬 の均一な分布。プロトコルを組み合わせを可能にします網膜が最初にエレクトロポレーションした後の物質で処理するトリートメント。処置群および対照眼の双方が同一の胚から収集することができ、独立して扱われるので、個々の胚間の変動の影響を.......
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開示事項
著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。
謝辞
この作業は、Barncancerfonden (PR2013-0104)、Swedish Research Council (12187-18-3)、ögonfonden、Kronprinsessan Margaretas arbetsnämnd för synskadade、Synfrämjandets forskningsfond、St Eriks ögonsjukhus forskningsstipendierの支援を受けました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 1xPBS(タブレット) | ライフ | テクノロジー18912-014 | |
| 10x DPBS | ライフ | テクノロジー14080-048 | |
| 100 mmシャーレ | VWR | 734-0006 | |
| 100 μl ピペットチップ | VWR | 613-0798 | |
| 1.5 ml 使い捨てプラスチックキュベット | Thomas Scientific | 8495V01 | |
| 24 ウェルプレート | Sigma Aldrich | D7039 | |
| 35 mm シャーレ | VWR | 391-1998 | |
| 70% エタノール | Solveco | 1054 | |
| Cdk1/2 阻害剤 III | 217714 | Calbiochem | 300 nM 0.01%DMSO |
| 細胞培養インキュベーター | サーモフォーマ | ||
| 解剖顕微鏡 | ライカ | ||
| DMEM | ライフテクノロジー | 41966-029 | |
| 電極 | プラチナ、カスタムメイド | ||
| エレクトロスクエアポレーター ECM 830 | ハーバード装置 | ||
| 31331-028 | |||
| FBS | Life Technologies | 16140-071 | |
| 鉗子 | AgnThos | 0108-5-PS | |
| 凍結培地 NEG50 | Cellab, Sweden | 6502 | |
| GFP 発現 DNA プラスミド (pZGs) | |||
| 湿インキュベーター | Grumbach Brutgeraete GmbH, Asslar, Germany | 8204 | |
| インスリン | シグマ アルドリッチ | I9278-5ML | |
| L-グルタミン | ライフ テクノロジー | ズ 25030024 | |
| 封付媒体 プロロング ゴールド DAPI | ライフ テクノロジー | ズ P36935 | |
| パラフィン フィルム | VWR | 291-1214P | |
| パラホルムアルデヒド | シグマ アルドリッチ | 16005-1KG-R | |
| ピール ア ウェイ 埋め込み金型 | シグマアルドリッチ | E6032 | |
| ペニシリンストレプトマイシン | ライフサイエンステクノロジー | ズ15140-122 | |
| ホスホヒストン3(PH3) | ミリポア | 06-570 | 1/4,000 |
| プラチナ電極(「ロンデル」からカスタムメイド) | Sargenta | 390-R(ロンデラー) | 直径:4mm、厚さ0.1mm |
| プラティマン電極 | Sonidel | CUY700P4L | 直径:4 mm |
| ポリエチレンパスツールピペット | VWR | 612-2853 | |
| テーターシェー | カーVWR | 444-2900 | |
| スモールスプーン | VWR | 231-2151 | |
| 糖 | VWR | 443815S | |
| ホワイトレグホーン卵 | サプライヤー | ||
| ワインクーラーWineMaster | 24、Caso, ベルリン, ドイツ |
参考文献
- Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo. Biochem Biophys Res Commu. 230, 376-380 (1997).
- Nakamura, H., Funahashi, J.
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再版と許可
