このプロトコルは、リンパ腫の組み換え免疫グロブリン重鎖VDJ領域をディープシーケンシングによって調査し、VDJの再配列と体細胞の超突然変異の状態を取得して、個々の腫瘍のクローン構造を描写するアプローチを説明しています。ペアの診断サンプルと再発サンプル間でクローン構造を比較すると、リンパ腫の再発クローン進化モードが明らかになります。
方法論記事
このプロトコルは、リンパ腫の組み換え免疫グロブリン重鎖VDJ領域をディープシーケンシングによって調査し、VDJの再配列と体細胞の超突然変異の状態を取得して、個々の腫瘍のクローン構造を描写するアプローチを説明しています。ペアの診断サンプルと再発サンプル間でクローン構造を比較すると、リンパ腫の再発クローン進化モードが明らかになります。
腫瘍クローン性を理解することは、腫瘍形成および疾患の進行に関与するメカニズムを理解するために重要です。また、特定の微小環境または治療に反応して腫瘍内で発生するクローン組成変化を理解することは、腫瘍細胞を根絶するために、より洗練され、効果的なアプローチの設計につながる可能性があります。しかし、腫瘍クローンのサブ集団を追跡することは、識別可能なマーカーの欠如に挑戦しています。この問題に対処するために、VDJ-seqのプロトコルは、VDJ組換えおよび体細胞超変異（SHM）、B細胞リンパ腫の2つのユニークな機能を利用することにより、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫（DLBCL）再発のクローン進化パターンを追跡するために作成されました。
このプロトコルでは、索引付けの可能性を秘めた次世代シーケンシング（NGS）ライブラリは、一次診断と再発DLBCL SAMPの組からの増幅された再配列免疫グロブリン重鎖（IgH遺伝子）VDJ地域から構築しましたレ。サンプルあたりの平均万人以上のVDJ配列は、VDJ再配列とSHM情報の両方が含まれているシーケンシング、後に得た上で。また、カスタマイズされたバイオインフォマティクスパイプラインは完全にこれらのサンプル内のIgH-VDJレパートリーの特徴付けのための配列情報を利用するために開発されました。また、パイプラインは、復興と診断腫瘍と診断し、再発腫瘍対間のクローン進化パターンの控除内クローン不均一性の検査を可能に個々の腫瘍のクローンアーキテクチャの比較を可能にします。いくつかの診断・再発のペアにこの分析を適用するとき、我々は、複数の特徴的な腫瘍の進化のパターンはDLBCLの再発につながることを重要な証拠を発見しました。さらに、このアプローチは、微小残存病変の同定、再発の進行および治療応答をモニターし、免疫repertoirの調査のような他の臨床面、に展開することができ非リンパ腫文脈におけるES。
がんはクローン病です。ピーターC. Nowellが癌クローン進化モデル1を提案したときに30年前から、多くの研究は、腫瘍サンプル内のクローン集団を分析し、腫瘍形成プロセス2の根底にあるクローン拡大と進化パターンを再構築しようとしています。最近では、全ゲノム配列決定は、クローン異質と進化3,4で深く見てみるために研究者を可能にしました。しかし、多くの細胞型で扱いやすいマーカーの欠如に起因し、それは正確なクローンのアーキテクチャおよび進化の経路を推測することは困難です。幸いDLBCLを含む多くのリンパ系悪性腫瘍は、発信元の成熟B細胞における天然クローン性マーカーがあります。抗原刺激に応答して、これらのセグメントの大きなプールから一緒にセグメントを、各B細胞は、V H（可変）、D（多様性）を結合することによって、単一の生産のIgH VDJ配列を形成することができ、およびJ Hの （参加します）。このPRの間にocessは、元の配列の小さな部分を削除することができ、追加の非鋳型ヌクレオチドはユニークなVDJ再構成を作成するために添加されてもよいです。この特定のVDJ再配列は、したがって、個々の成熟B細胞およびその子孫5をタグ付け、このB細胞のすべての子孫に継承することができます。また、SHMは、抗体プールの拡大や抗体アフィニティー6の強化のための追加の突然変異を導入するために、その後の胚....
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
1. VDJ増幅
腫瘍試料から1.1）のDNA抽出
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
DNAの抽出を含むVDJ配列決定（VDJ-SEQ）の全体的な手順は、ライブラリー構築の配列決定、VDJ領域の増幅および精製を再結合し、処理、および系統学的解析を読み出し、 図1に示されている。日常5-200μgのDNAをから検索することができます凍結固体組織切片またはホルマリン固定パラフィン包埋組織切片を0.5から20μgのDNAを。品質、再配置パターン、および個々のサンプルのSHMの程度に応じて、異なるサンプルからのVDJ PCR産物の多様を得ることができた（ 図2）、IGVHFR1（310から380塩基対）、FR2（250から295塩基対）を含みますFR3（70-120 bp）の。唯一FR3断片はVDJ PCRから入手することが可能なサンプルが起因下流のデータ分析の目的のために配列情報を十分に提供しない短い製品に残っている試験から除外しました。主要FR1またはFR2 PCR産物が目に可視化することができる唯一のサンプル電子アガロースゲルは、シークエンシングライブラリーを生成するために処理されます。ゲル精製後の主要なPCR産物の収率を合計で10〜50 ngの範囲.......
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
そのため、ヒトB細胞のIGH遺伝子座にVDJ再配列とSHMによってコード化された配列情報の反復のほぼ無制限の数の、ハイスループットディープシークエンシングにより全体IGHレパートリーの検査は、クローン描写するための効率的かつ包括的な方法であることが判明しましたサブクローン性B細胞集団。さらに、この方法は、疾患の種々の段階に沿って収集された患者サンプルのクローンおよびサブクローンのアーキテクチャを比較することにより、B細胞腫瘍の発生、寛解および再発のクローン進化経路を研究するために使用することができます。一次サンプルからのDNA再配列VDJ配列の増幅を容易に商業的に入手可能なプライマーを用いて、実験室の設定で行われるが、増幅の効率は、試料DNAの品質に大きく依存します。具体的には、FFPEサンプルから抽出したDNAは、低い増幅効率を示し、しばしばわずかFR3断片が正常これらから増幅することができますサンプル、その後の分析のためにそれらは不適当。本明細書中に記載の我々の研究は、1つまたは腫瘍全体を支配するいくつかの主要なクローンとクローン性疾患であるB細胞リンパ腫のクローン性を理解するために設計されたので、私たちは、収集され、主要なVDJ-.......
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
著者には開示すべき利益相反はありません。
著者は、Rita Shaknovich博士とElemento研究室、Melnick研究室、Tam研究室のメンバーに感謝したいと思います。また、VDJシーケンシングを実施してくださったWeill Cornell Medical CollegeのGenomics Resources Core Facilityにも感謝いたします。YJはASH Scholar Awardの支援を受けました。WTとOEは、Weill Cornell Cancer Center Pilot Grantの支援を受けています。OEは、NSF CAREER賞、Starr Cancer Consortium、およびHirschl Trustによってサポートされています。また、このプロジェクトへの寛大な支援について、キャサリン・ベネッシュ、JD、MPH
に感謝します。....アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| エタノール | VWR | 89125-170 | 200プルーフ、分子生物学 |
| TEバッファ | ライフ | テクノロジー12090-015 | 10 mM Tris·Cl、pH 8.0;10 mM EDTA |
| キシレン | VWR | EM-XX0055-6 | 500 ml |
| プロテイナーゼ K | Life Technonogies | 25530-015 | 100 mg |
| デオキシヌクレオチド三リン酸 (dNTP) 溶液ミックス | Promega | U1515 | 各ヌクレオチド |
| 10x PCR バッファー | ロシュ | 11699105001 | MgCl2 |
| AmpliTaq Gold DNA ポリメラーゼ 金バッファーおよび MgCl2 | Life Technonogies | 4311806 | 50 & micro;5 U/µのl;l |
| 試料制御サイズラダー | Invivoscribe Technologies | 2-096-0020 | 33反応 |
| IGH 体細胞超突然変異アッセイ v2.0 - ゲル検出 | Invivoscribe Technologies | 5-101-0030 | 33反応、IGVHFR1検出用ミックス2 |
| IGH遺伝子クローン性アッセイ - ゲル検出 | Invivoscribe Technologies | 1-101-0020 | 33反応、IGVHFR2検出用チューブB |
| GoTaq Flexi DNAポリメラーゼ | Promega | M8291 | 20 µ5 U/µのl;l |
| 10X トリス-ホウ酸-EDTA(TBE)バッファ | Corning(セルグロ) | 46-011-CM | 6x1 L |
| 50X TAEバッファ | VWR | 101414-298 | 1 L |
| 臭化エチジウム | Sigma-Aldrich | E1510 | 10 mg/ml |
| 25 bp DNA Ladder | Life Technologies | 10597011 | 1 & micro;g/µl |
| 100 bp DNAラダー | ライフテクノロジー | 15628-019 | 1 & マイクロ;g/µl |
| UltraPure Agarose | Life Technologies | 16500-500 | 500 g |
| 40% アクリルアミド/Bis 溶液 | Bio-Rad Laboratories | 1610144 | 500 ml |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | 50 columns |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter | A63881 | |
| Qubit dsDNA High Sensitivity Assay Kit | Life Technologies | Q32854 | |
| 高感度DNAキット | Agilent Technologies | 5067-4626 | |
| 2100 バイオアナライザー | Agilent Technologies | ||
| PhiX Control v3 | Illumina | FC-110-3001 | |
| MiSeq | Illumina | ||
| Qubit 2.0 Fluorometer | Life Technologies | Q32872 | |
| 再懸濁バッファー (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| End repair mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| A-tailing mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| Ligation mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| DNA アダプターインデックス (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| Stop ligation buffer (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| PCR primer cocktail (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| PCR master mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | イルミナ | FC-121-2001 | |
| 磁気スタンド | ライフテクノロジー | 4457858 | |
| ゲルイメージングシステム | ・ラッドラボラトリーズ | 170-8370 |
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
このJoVE記事のテキストまたは図の再利用許可をリクエスト
許可をリクエスト