ハイスループットマイクロプレート呼吸測定のためのマウス骨格筋の最小量から単離されたミトコンドリアを使用して

サマリー

提示された方法は、マウス骨格筋の最小量から単離されたミトコンドリアを使用したマイクロプレートベースの呼吸測定アッセイのコレクションの性能について、段階的な指示を提供します。これらのアッセイは、一般的に使用される動物モデルにおけるミトコンドリア酸素消費量の機構的変化/適応を測定することができます。

要約

骨格筋のミトコンドリアは、多くの疾患の病理において特定の役割を果たします。そのため、この組織のミトコンドリア機能の指標としての酸素消費量の測定がより一般的になっています。さまざまな細胞、組織、種のミトコンドリア呼吸経路を測定する多くの技術やアッセイが存在しますが、マウス骨格筋から単離されたミトコンドリアをマイクロプレートベースの技術で使用するこれらのアッセイの編集に関しては、現在文献に空白があります。重要なことに、マイクロプレートベースの呼吸測定アッセイの使用は、最小限の単離されたミトコンドリアを使用してハイスループット測定を可能にするため、ミトコンドリア生物学者の間で増加しています。したがって、一般的に使用される動物モデルにおける酸素消費の機構的変化/適応を評価できるマイクロプレートベースの呼吸測定アッセイのコレクションが開発されました。本明細書に提示する方法は、最適な量のミトコンドリアタンパク質および試薬を用いてこれらのアッセイを実施するための段階的な指示を提供し、各アッセイのダイナミックレンジにわたる最小のばらつきによって証明されるように高い精度を提供します。

概要

骨格筋のミトコンドリアの主な生理学的役割は、酸化的リン酸化¹からATPを生成することです。重要なのは、骨格筋のミトコンドリアは^3、変性疾患⁴及びII型糖尿病^5老化 、運動能力²に特異的な役割を果たしています。高齢化社会、およびII型糖尿病、米国⁶における死亡の7 ^番目の主要な原因であるとして、ミトコンドリアの機能を評価する方法の必要性は、生物医学研究^7,8でますます普及しています。それは酸化的リン酸化⁹の機能構成要素を表現するために、ミトコンドリアおよび核ゲノム間の協調機能を表しているので具体的には、酸素消費量の測定は、ミトコンドリア機能の評価に非常に優れた有用性を有します。

いくつかの技術は、それが無傷の細胞に酸素消費量の測定を可能にし、単離存在しますDミトコンドリア^7-10。さらに、アッセイは、複数の細胞型や組織のために開発され、ミトコンドリア経路および呼吸制御^9,11,12の測定を可能とする様々な種にされています。しかし、マイクロプレートベースの酸素消費技術で使用するために、マウスの骨格筋から単離したミトコンドリアを用いて、これらのアッセイのすべてのコンパイルに関しては文献でvoid現在があります。重要なことは、マイクロプレートベースの呼吸アッセイの使用は、ミトコンドリアの生物学者の間で成長しており、単離ミトコンドリア⁹の最小量を用いて、高スループットの測定を可能にしています。したがって、マイクロプレートベースの呼吸アッセイのコレクションは、異常および/または適応が電子伝達鎖（ETC）で発生することができる場所の特定することができ、その開発されました。さらに、2つの付加的なマイクロプレートベースのアッセイは、呼吸協調betweeの評価を可能に開発されましたトリカルボン酸（TCA）回路やETC、およびSS-酸化との間などのn重要なことは、提示される方法は、一般的に使用される動物モデルにおけるミトコンドリア機能のメカニズムの変化を測定するための明確で簡潔な方法を提供します。

プロトコル

注：1が赤骨格筋からのミトコンドリアを隔離した後にこのプロトコルを開始します。赤色骨格筋¹³ 100mgの-以前〜75で説明したようにミトコンドリアを単離しました。 （Frisard ら ^13を参照してください）2（IBM）は、ミトコンドリアのタンパク質を10μg/μlではミトコンドリアのための分離バッファの≤50μlの最終的なミトコンドリアのペレットを再懸濁することにより、組織のこの量から達成されるであろう- 5の間。

1.セットアップ

1. その後のアッセイのためのワーキングストック溶液（ 表1）およびミトコンドリアアッセイ溶液（MAS）ミックス（ 表2）を準備します。
   注：最もストック溶液およびMASを格納できるようなアッセイのための調製物の大部分は、事前に行うことができます。
2. 37℃での非CO ₂インキュベーター内で実験前の夜1ミリリットルの較正溶液中の呼吸アッセイカートリッジを水和。
3. 実験の日、トンAKEアウト凍結ストック（基材とミトコンドリアのモジュレーター、MASミックス、MAS W / O BSA、 表1）および37℃のバスまたはインキュベーターで解凍。
4. すべての基質溶液（ 表3）、注射（ 表4-5）を準備し、（pH7.4）に、必要に応じてpHを調整します。 pHを調整した後、氷上で保存します。
5. プログラムの適切なミックス、待って、測定パラメータにマルチウェルの酸素消費量測定装置は、最初に「標準」モードに続く解析ソフトウェアを、次のように入力して、ラベルの背景とグループ/条件のウェル（ 表6を参照してください）。
   1. 「ゲスト」フォーラムに入力し、「アッセイウィザード」をクリックしてください。かつて「アッセイウィザード」で、ミックスを変更する待機し、パラメータを測定する「プロトコル」をクリックしてください。 「バックの下にバックグラウンドウェルにラベルを付けます。補正」タブをハイライト表示するようにしてください ""バックグラウンド補正を行います。
   2. ラベルCOND「グループ情報」タブに続いて「グループとラベル」タブ、上の最初のクリックしてitions。これらのパラメーターが入力された後、「テンプレート保存」に続いて、「終了」をクリックします。

2.ザ・アッセイを実行します

1. アッセイの実行カートリッジに注入溶液をロードし、最初の「標準」モードに入るに続く解析ソフトウェアを、入力してキャリブレーションを開始します。 「ゲスト」フォーラムに入ります。 「テンプレート」タブで、「XF」ドライブの下にステップ1.5で保存したテンプレートを開きます。オープンしたら、キャリブレーションを開始するには、「スタート」をクリックします。
   注：分析の実行カートリッジは、左下に切り欠きの角を持つマシンに入力する必要があります。これは、約30分かかります。適切なポートにソリューションを注入するように注意してください。 表4-5の注射はロードの順に表示されます。
2. 静かに、しかし完全にmitochondを混ぜますそっとそのオリフィスはハサミで先端の末尾から〜3ミリメートルを切断することによって広がってきた200μlのピペットチップで株式を粉砕に続いて、200μlのピペットチップで溶液を攪拌することにより、RIAの株式。
3. ミトコンドリアの株式のタンパク質濃度を決定するために、ビシンコニン酸（BCA）アッセイを実行します。
4. ステップ2.3から取得した株式の濃度を使用して、コハク酸/ロテノン基質ミックス（ 表3）のミトコンドリアタンパク質/ 200μLの10μgの再懸濁します。ミトコンドリアタンパク質の14μgの/残りの基質ミックス200μlを（ 表3）（ これは、各基質ミックスのために行われなければならない）再懸濁します。すべてのミトコンドリアタンパク質/基質を氷上でミックス置きます。
   注：以前^{9に記載されているように} 、各アッセイのために、ウェルあたりのミトコンドリアのタンパク質の最適量を決定しました。それが決定されたそのピルビン酸/リンゴ酸、パルミトイルカルニチン/リンゴ酸、グルタミン酸/リンゴ酸のANコハク酸/ロ​​テノンアッセイはミトコンドリアタンパク質2.5μgのウェルあたりを利用しながら、D電子流アッセイは、ミトコンドリアタンパク質の3.5μgのを利用しています。そのため、研究者は4があるので、このステップで複製するための十分なミトコンドリアタンパク質を再懸濁する必要があるのいずれかを2.5μgまたは50μLあたり3.5μgのはウェル当たりロードされる（ステップ2.6を参照してください）​​。
5. 静かに、しかし完全に静かに最後の〜3ミリメートルを持った200μlのピペットチップで株式を粉砕に続いて200μlのピペットチップを用いて溶液を、攪拌することにより、ミトコンドリア/基質溶液を混合を遮断します。
6. 氷の上と三重で細胞培養プレートを置き、ミトコンドリア/基質ミックスの各負荷を50μl/ウェル。マイクロプレートベースの呼吸アッセイの開発者は、好ましくは、細胞培養プレート上のいずれかの側に、2ブランク（無ミトコンドリア）をウェルの最小値を残してお勧めします。
7. 4℃で20分間、2,000×gで細胞培養プレートをスピン。プレートがsであるがピン止め、37℃の水浴中で基質溶液を温めます。
8. スピンが完了した後、慎重に各ウェルの上に各基質溶液450μlのをロード（ すなわち 、最初にこの基質溶液中に再懸濁させ、ミトコンドリアを持つウェルにピルビン酸/リンゴ酸基質をロード）。 RTでプレートをロードしてください。注：ブランクウェルは、基板の500μlのロードする必要があります。結合されたアッセイブランクウェルは、任意の結合アッセイ基質をロードすることができる一方で電子流アッセイのために指定されたブランクウェルは、電子流基板（ピルビン酸/リンゴ酸+ FCCP）をロードする必要があります。
   注：分析の実行が「音源」タブから「XFリーダー」プラットフォームを使用して完了した後、同じプレート上に結合され、電子の流れのアッセイを行う場合には、研究者がそれぞれのアッセイにバックグラウンドウェルを再割り当てする必要があります。かつて「インストゥルメント」の設定の中に、「管理」をクリックしてください「バックグラウンド補正」に続くタブ、。完了したら、「装置のセットアップモードを終了」ヒット。アスコルビン酸塩/ TMPDの組み合わせは、このように独立したバックグラウンド補正は、各アッセイタイプに必要とされる_O 2 _を消費することができるからです。
9. 基板の450μlの後、各ウェルに添加し、ミトコンドリアが単一の単分子層（20X倍率[ロジャース^9、 図4を参照してください ]）の中に均一に分散されることを保証することは、十分にミトコンドリアの層を表示します。均等に分散単層を持っているようには見えないウェルは、 事後除去することができます 。
10. ミトコンドリアの遵守のためにチェックした後、呼吸分析機器にマイクロプレートを挿入し、「OK」をクリックして実行しアッセイを開始します。
    注意：実行が開始される前にステップ2.1からのキャリブレーションが完了していなければなりません。研究者は、「OK」をクリックすると、機械は、キャリブレーションのために使用されたユーティリティ・プレートを排出します。
    1. ユーティリティプレートを取り外し、トレイ上のミトコンドリアを含む細胞培養プレートを配置します。細胞培養プレート上の青色のノッチは、トレイの左下隅に配置する必要があります。アッセイの実行を開始するには、「継続」、をクリックしてください。
11. 実行が完了すると、画面上で「取り出し」を押すことによって、細胞培養プレート、カートリッジを取り出します。
    1. プレートが排出されたら、削除して、細胞培養プレートとカートリッジを破棄し、画面上で「続行」をクリックします。ランは自動的に「データ」ファイル内の.xlsファイルとして保存されます。
12. このファイルを開いて、「Y1：」の下に下向きの矢印を押すことで「OCR」を「O2」から表示を変更マーカー。
    1. オプション：下の次の変更「中間点」を「ポイント・ツー・ポイント・料金」「速度データとして表示 "。これらの変更を適用するには、「OK」をクリックしてください。
13. 一緒に同じような条件のグループウェルに画面の左下に「まあグループモード」タブをクリックします。最後に、左に、画面の中央に向かって、「サンプル平均値/標準エラー」タブをクリックします。アッセイは「アッセイウィザード」の設定で開始される前に別の方法として、これらのコマンドを設定することができます。
    注意：各条件は各レートと各条件について表示平均±標準偏差を持つことになります。条件ごとに取得率の測定（4回の注射が続く状態2 [結合] / State3u [電子流れ]呼吸）があります。 、第二の測定の状態2速度の平均値を使用し、注射をオリゴマイシン後最小点での状態40を決定し、ADPとFCCP注入した後の状態3と状態3Uの最大ポイントを使用し、それぞれ、およびアンチマイシンAの最低ポイントを使用カップリングアッセイのために誘導された呼吸。最小値を使用して、ピルビン酸/リンゴ酸誘導状態の3U呼吸のための最大のポイントを使用しますロテノン誘発される呼吸のためのポイント、コハク酸誘導状態の3U呼吸のための最大のポイントを使用し、電子フローアッセイのためのアンチマイシンA誘発された呼吸のための最小点を使用しています。すべての実験は3回行い、示したデータは代表的なトレーシングの結果です。

結果

図1は、ピルビン酸/リンゴ酸、コハク酸/ロテノン、パルミトイルカルニチン/リンゴ酸、およびグルタミン酸/リンゴ酸アッセイ（カップリングアッセイ）のための酸素消費速度（OCR）を表します。これらのアッセイの追跡は、酸素消費速度、またはOCR、対時間として表示されている背景がcorrecetedされ、ポイント・ツー・ポイント率として表示されます。各パネルはチャンスとウィリアムズ^14で説明したように、異なるミトコンドリアの状態での酸素消費量を表しています。最初のパネルは第二パネル基礎酸素消費量、または状態2を表し、ADPの注入後、最大の結合された呼吸を表し、または州第3のパネルは、オリゴマイシンA（複合体Vの阻害剤）を注入した後、原因で呼吸を表しプロトンリーク、または状態40へ。第四のパネルが、FCCPの注入後、最大の脱共役呼吸、または状態3Uを表します。最後に、第五のパネルは、アンチマイシンAの注入後に、酸化性呼吸の阻害を表します。注目すべきは、アルLミトコンドリアの状態は最小限の標準偏差を持っています。これは、ミトコンドリアの株式およびミトコンドリア/基板ミックス、および付着スピン（ステップ2.6）の後に、ミトコンドリアの単一単分子膜が得られるとの完全な混合に起因するものです。一方、各ウェルないマイクロプレートのウェル内にミトコンドリアの単一の単層を達成するに等しくないミトコンドリアをロードすると、図2に表示される各状態での標準偏差の増加につながります。

各ミトコンドリアの状態のため、各基板については、図1の表示プラトーで追跡。 2測定サイクル後に達成プラトーが良いミトコンドリアの品質とミトコンドリアは、アッセイの期間中、ウェルに付着したままであることを示唆しています。これは、このように発生する可能性があるバイアスを減らすこと、研究者はこれらのミトコンドリアの状態での平均OCRを取ることができますので、また、頭打ち最大速度の達成がより望ましいかもしれ任意の点を選択することもできます。

ウェルあたりのミトコンドリアの量を最適化試験により決定しました。これらの値は、マルチウェル酸素の動的な酸素検知範囲内にあるため、ウェルあたりのミトコンドリアの最適量は、100〜200ピコモル/分/ウェルと状態3率<1500ピコモル/分/ウェルとの間の状態2速度をもたらすべきです消費測定装置。ウェル当たりすぎてミトコンドリアタンパク質をロードすると、測定器（ 図3A）のダイナミックレンジを超えたのOCRをもたらすことができる。 図3は、ウェルあたりのミトコンドリアのタンパク質2.5μgの（赤のロードに比べて、ウェルあたりのミトコンドリアタンパク質（青トレース）の3.5μgのをロード描きますコハク酸/ロ​​テノンアッセイのために）トレース。ウェル当たりすぎてミトコンドリアタンパク質をロードすると、また、このようにそれぞれの連続測定^9（ 図3B <ためのOCRの正確な測定を防止し、ウェルのマイクロチャンバー内の酸素の枯渇につながることができます/強いです>）。ポイントツーポイントのOCRは、OCRの瞬間的な変化率です。フラット場合は、OCRは/着実に安定であるが、減少ならば、生物学的または技術的な問題がある可能性があります。状態3と状態3U呼吸（ 図3A）で、OCRの急激な減少は、測定（ 図3B）の終了前に酸素供給を排出ミトコンドリアによって引き起こされます。

図4は、電子の流れの分析のための時間対OCRを表します。 図1で説明したようにトレースが修正され、表示されます。このアッセイで最初のパネルは、第二のパネルは、ロテノンの注入後、複合体I媒介呼吸の抑制を表す複雑なI.経由ピルビン酸/リンゴ酸の状態3Uの呼吸を表します。第3のパネルが、コハク酸の注入後、基板を表し、電子が複合体II（複合体II媒介呼吸）でE​​TCを入力して国家3Uを刺激しました。 Antimの注射後第四パネル、ycin Aは、複合体IIIので、総呼吸の抑制を表します。最後に、第五パネルは、アスコルビン酸/ TMPDを注入した後、複合体IV媒介呼吸を表します。 図1の追跡と同様に、すべてのミトコンドリアの状態は、最小の標準偏差を有しており、それぞれの速度がプラトーに達したほぼ持っていますか。

図1.カップリングアッセイ。（A）の10mMピルビン酸/ 5mMのリンゴ酸、（B）10mMのコハク酸/ 2μMロテノン、（C）、40μMパルミトイルカルニチン/ 1mMのリンゴ酸、および（D）10 mMのグルタミン酸/ 10mMの酸素消費のマルチウェル測定によって決定されるようにリンゴ酸は、ミトコンドリア呼吸アッセイ追跡を結合しました。値は平均±SDとして表されます。ウェル当たりロードミトコンドリアタンパク質は、コハク酸/腐敗を除くすべてのアッセイのために3.5μgのでしたミトコンドリアタンパク質2.5μgのウェルあたりを利用エノン、。データは、n = 3ペアの生物学的複製を表します。 OCR =酸素消費速度; ADP =アデノシン二リン酸;オリゴ=オリゴマイシンA; FCCP =カルボニルシアン化物4 - （トリフルオロメトキシ）フェニルヒドラゾン;アンチA =アンチマイシンA; PYR =ピルビン酸; SUCC =コハク酸; ROT =ロテノン; PAL-Cは、パルミトイルカルニチンを=。 GLUT =グルタミン酸。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2.非常に可変ピルビン酸/リンゴ酸アッセイ。不完全なので、変数のミトコンドリアプロにつながる、基板/ MASミックスでミトコンドリアの在庫からミトコンドリアを混合することによって引き起こされる非常に可変性の10mMピルビン酸/ 5 mMのリンゴ酸アッセイ各ウェル中のテイン搭載。ウェル当たりロードミトコンドリアタンパク質は、3.5μgのでした。データは、n = 3ペアの生物学的複製を表します。 OCR =酸素消費速度; ADP =アデノシン二リン酸;オリゴ=オリゴマイシンA; FCCP =カルボニルシアン化物4 - （トリフルオロメトキシ）フェニルヒドラゾン;アンチA =アンチマイシンA; PYR =ピルビン酸。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

コハク酸/ロテノンアッセイのために、図3のオーバーロードミトコンドリアタンパク質。 （A）ウェルあたりミトコンドリアタンパク質（赤トレース）2.5μgのをロードに比べて、ウェルあたりのミトコンドリアタンパク質（青トレース）の3.5μgのをロードすることによって引き起こされるマルチウェル酸素消費量測定装置のダイナミックレンジ外の酸素消費速度を。（B ）牛近づいて緊張をygenゼロADPおよびウェルあたりのミトコンドリアのタンパク質の最適量（2.5μgの）（赤トレース）をロードに比べても（青トレース）当たりの過剰なミトコンドリアタンパク質（3.5μgの）をロードすることによって引き起こされるFCCPの注射後。データは、ミトコンドリアタンパク質量当たりのn = 3ペアの生物学的複製を表します。 OCR =酸素消費速度; ADP =アデノシン二リン酸;オリゴ=オリゴマイシンA; FCCP =カルボニルシアン化物4 - （トリフルオロメトキシ）フェニルヒドラゾン;アンチA =アンチマイシンA; SUCC =コハク酸; ROT =ロテノン; O ₂ =酸素;水銀のミリメートル水銀柱ミリメートル=。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図4.電子フローアッセイ。5mMのピルビン酸/ 1mMのリンゴ酸+ 4μMのFCCP、電子F酸素消費のマルチウェル測定によって決定されるように、トレース低いミトコンドリア呼吸アッセイ。値は平均±SDとして表されます。ウェル当たりロードミトコンドリアタンパク質は、3.5μgのでした。データは、n = 3ペアの生物学的複製を表します。 OCR =酸素消費速度;アンチA =アンチマイシンA; ASC =アスコルビン酸; TMPD = N、N、N '、N' -tetramethyl- のpフェニレンジアミン。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

試薬	ストック濃度	MW	最終容積	大量追加	コメント/説明
	（M）	（グラム/モル）	（ミリリットル）	（グラムまたはミリリットル）
EGTA、pHは7.2	0.1	380.35	1Mトリス塩基の100ミリリットル	3.801グラム	4℃で保存
HEPES	1	238.3	DIH 2 Oを 250ミリリットル	59. 57グラム	4℃で保存
MgCl 2、六水和物	1	203.31	DIH 2 Oを 250ミリリットル	50.82グラム	4℃で保存
ピルビン酸のpH 7.4	0.1	88.06（14.11 Mソリューションとして付属しています）	DIH 2 Oの40ミリリットル	ピルビン酸の0.283ミリリットル	-20℃で1ミリリットルのアリコートとストアを行い、隔週新鮮作ります
コハク酸のpHは7.4	0.5	118.09	DIH 2 Oを 100ミリリットル	SUの9.4グラムccinic酸	-20℃で1ミリリットルのアリコートとストアを作ります
マラテ、pHは7.4	0.5	134.09	95％エタノール100ml	リンゴ酸6.7gの	-20℃で200μlのアリコートとストアを作ります
TMPD	0.01	164.25	10ミリリットル	0.0164グラム	-20℃で300μlのアリコートとストアを行います。減少TMPDを維持するためにアスコルビン酸の等モル量と混合
パルミトイルL-カルニチン塩化	0.01	436.07	95％エタノール1.14 mlの	0.005グラム	-20℃で40μlのアリコートとストアを作ります
オリゴマイシンA	0.006	791.06	95％エタノール0.987ミリリットル	0.005グラム	-20℃で20μlのアリコートとストアを作ります
FCCP	0.01	254.17	95％のエタノールの3.9ミリリットル	0.01グラム	-20℃で40μlのアリコートとストアを作ります
ロテノン	0.001	394.4	95％のエタノール10ml	0.0039グラム	-20℃での保存
アンチマイシンA	0.005	548.63	95％のエタノールの9.12ミリリットル	0.025グラム	-20℃での保存
K + ADP	0.5	501.32	DIH 2 Oを 3.9ミリリットル	1.0グラム	-20℃での保存
リンゴ酸、pHは7.4	0.5	134.09	40ミリリットル	2.68グラム	-20℃で200μlのアリコートとストアを作ります

ストックソリューション

試薬	ストック濃度	大量追加	最終モル濃度/パーセント
	（M）	（グラムまたはミリリットル）
スクロース	-	11.98グラム	70 mMの
マンニトール	-	20.04グラム	220 mMの
リン酸二水素カリウム	-	0.34グラム	5 mMの
MgCl 2、六水和物	1	2.5ミリリットル	5 mMの
HEPES	1	1.0ミリリットル	2 mMの
EGTA	0.1	5.0ミリリットル	1 mMの
基本的に脂肪酸自由BSA	-	1.0グラム	0.20％

表2 MASミックスのpH 7.4、500ミリリットル：-20ºCで小分けし25ミリリットル、店舗*注：アッセイ注射剤に用いられるMASミックスのためのBSAを除外します。

基質中	最終濃度	在庫量（μL）	MAS *の量（ミリリットル）
ピルビン酸/マラテ	10 MM / 5 mMの	ピルビン酸：1,000	9
		マラテ：100
Succicinate /ロテノン	10 MM / 2μM	コハク酸：200	10
		ロテノン20
*ピルビン酸/リンゴ酸+ FCCP	5 MM / 1 MM / 4μM	ピルビン酸：500	10
		FCCP：4
		マラテ：20
パルミトイルL-カルニチン/マラテ	40μM/ 1 mMの	パルミトイルカルニチン：40マラテ：20	10
グルタミン酸/マラテ	10 MM / 10mMの	グルタミン酸：400	10
		マラテ：200

表3.基質溶液のpHを7.4：実験の新鮮な一日にします。 *電子流分析ソリューション。

注入中	濃度	在庫量（μL）	MASの量（ミリリットル）	カートリッジに注入量	最終濃度
					（後プレートに注入）
ADP	50 mMの	300μlの	3	50μlの	5.0 mMの
オリゴマイシンA	20μM	10μlの	3	55μL	2.0μM
FCCP	40μM	12μlの	3	60μlの	4.0μM
アンチマイシンA	40μM	24μL	3	65μL	4.0μM

T結合アッセイのためにできる4.注射pHは7.4：実験の新鮮な一日にします。 *カップリングアッセイが含まれます（ただし、これらに限定されない）、ピルビン酸/リンゴ酸、コハク酸/ロ​​テノン、パルミトイルカルニチン/リンゴ酸、およびグルタミン酸/リンゴ酸。

注入中	濃度	株式の量（gまたはUL）	MASの量（ミリリットル）	カートリッジに注入量	（後プレートに注入）最終濃度
ロテノン	20μM	60μlの	3	50μlの	2.0μM
コハク酸エステル	50 mMの	300μlの	3	55μL	5.0 mMの
アンチマイシンA	40μM	24μ;リットル	3	60μlの	4.0μM
TMPD / Ascorabte	1 mMの、100mMの	TMPD：300μlの	3	65μL	100μMの、10mMの
		アスコルビン酸：0.059グラム

電子フローアッセイ表5.注射 pHは7.4：実験の作る新鮮日

コマンド	時間（分）	サイクル＃
キャリブレーション
待つ	（プレートが付着段階から温めることを可能にする）10分
ミックス	1分	2
私にASURE	2分
Aを注入
ミックス	1分	2
メジャー	2分
Bを注入
ミックス	1分	2
メジャー	2分
Cを注入
ミックス	1分	2
メジャー	2分
Dを注入
ミックス	1分	2
メジャー	2分

表6.インストゥルメントを実行しますプロトコル。

ディスカッション

マウス骨格筋の100 mgの - この記事で紹介した方法は、75から分離されたミトコンドリアを用いて、マイクロプレートベースの呼吸アッセイのコレクションのパフォーマンスのためのステップバイステップの手順を提供します。これらのアッセイは、三連のウェル間の緊密な標準偏差によって証明されるように高精度に行うことができます。重要なことに、これらのアッセイは、異常呼吸及び/又は適応は、一般的に使用される動物モデルにおいてETC、TCAサイクル、β酸化経路、基板の輸送等に発生することができる場所を特定する可能にします。

これは、このプロトコルで使用されるさまざまな燃料や阻害剤を使用するための理論的根拠を強調することが重要です。ピルビン酸/リンゴ酸およびグルタミン酸/リンゴ酸呼吸アッセイは私が呼吸を媒介、ならびにそれらのそれぞれのトランスポーターの評価、およびグルタミン酸の場合、デアミナーゼ¹⁵における複合体の評価を可能にします。代替的に、の組み合わせロテノンは、複合体Iを阻害し、コハク酸は、フラビンアデニンジヌクレオチドの還元により複合体IIに電子を提供するので、コハク酸/ロテノンは（FADH _^2）15 ETCの複合体IIを介してミトコンドリア呼吸フラックスの評価を可能にします。これらのアッセイは、結合効率と最大呼吸のような基板の特定の情報を提供します。電子流アッセイは、基質および阻害剤の組み合わせが、ミトコンドリア呼吸フラックス⁹中に複数の複合体の評価が可能になるという点で独特です。コハク酸続いロテノンの注射は複合体IIによって駆動評価の最大の呼吸を可能にしながら、ピルビン酸/リンゴ酸+ FCCPの初期基質ミックスは、複合体Iで駆動される最大の呼吸の評価を可能にします。アスコルビン酸/ TMPDがあるので、アスコルビン酸/ TMPDの注入に続いてアンチマイシンA、複合体IIIの阻害剤の注入は、複合体IVで駆動される呼吸の評価を可能にチトクロームC /複合体IVへの電子供与体。結合効率についての情報が得られないが、この方法は、独立して複数の基板を実行して排除する非常に小さなサンプルサイズに最適です。最後に、パルミトイルカルニチン/リンゴ酸を使用することは、β酸化およびパルミチン酸（β酸化）フラビンタンパク質^15を電子輸送を通じてETCに供給の酸化から生産削減同等以来ETC間の調整の評価が可能になります。これは、カップリングと電子フローアッセイはまた、何らかの介入（薬物治療、遺伝子操作）にミトコンドリア機能の変化を同定するために連携して使用することができることに留意すべきです。

これらのアッセイのために達成し、高精度は、前タンパク質決意に、または基板ソリューションであるかどうかを、主にミトコンドリアの完全な混合に起因するものです。この線に沿って、ミトコンドリア一度基板solutioにresuspendendされますNSは、それが広がったオリフィスピペットチップでステップ2.2で説明したように細胞培養プレートをロードする前に十分、この溶液を混合することが重要です。ミトコンドリアをミックスに失敗すると、徹底的に分析内の大きな変動につながります。また、ミトコンドリアを混合しながら剪断力を作成し、狭いオリフィスピペットチップを使用すると、接着ステップ（2.7）も、このプロトコルにおける重要なステップであるミトコンドリア膜およびシトクロムCの放出を損傷する可能性を増大させます。長い/十分に速くロードされた細胞培養プレートを回転しないと、このように井戸と測定値の間の増加変動をリードし、ウェルにミトコンドリアの不完全密着性になります。

記載されているプロトコルが含まれるように最適化されています：、ウェルあたりのミトコンドリアのタンパク質の最適量をロードする株式及び基板ソリューションを作るために正しい濃度/調製法を用いて、ミトコンドリアの状態ナンプラーを確保するためのアッセイの実行を変更しますteaus、およびミトコンドリア株式およびミトコンドリア/基質混合物の適切な混合。これらの最適化の取り組みに先立ち、著者らは、アッセイの実行に落とし穴が発生しました。以下は、このプロトコルを最適化するのに便利でしたトラブルシューティング方法/修正について説明します。マイクロチャンバー内の酸素を排出し、不正確な測定につながるあまりミトコンドリアのロード中に、最適な負荷に関して、負荷が少なすぎるミトコンドリアは、強固な応答を誘発しません。ロジャースら ^9は、マイクロプレートベースの呼吸アッセイのために、ウェルあたりのミトコンドリアの最適な積載量を決定する例を示します。多くの場合、あまりにも多くのミトコンドリアはロードごとにだけでなく、100〜200ピコモル/分/ウェルと状態3速度オーバー状態2速度/ウェル> 1500ピコモル/分によって証明されます。 （。 - 10μgの例えば 、1の間）は、動的R内のOCRを引き出すためにオーバーロードが発生した場合は、ミトコンドリアタンパク質の濃度を変化させて実験を行います酸素消費量測定装置のアンジュ。準備と基板との株式の正確な濃度を使用することは最も重要です。常に基板/注射の酸形態を使用し、水酸化カリウムまたは塩酸を用いてpHを調整します。ナトリウムバッファ/ソリューションが推奨されていません。また、DMSO中の基質/株式または100％エタノールを再懸濁して、測定の障害やエラーになります。指摘の95％エタノールを使用してください。パルミトイルカルニチンは、このように大きな変動を引き起こし、凍結ストックを解凍した後、95％エタノールから沈殿することが一般的です。使用する前によくパルミトイルカルニチンストックと渦をウォームアップしてください。また、非常に可変ピルビン酸/リンゴ酸分析結果が原因ピルビン酸在庫が> 2週齢であることとすることができます。 2週間ごとにピルビン酸の凍結アリコートをリメイクしてください。アッセイの実行は、ミトコンドリアの状態のプラトーを確保するために2分間の測定に変更されました。 ADPの枯渇の観察が必要な場合は、研究者はよいです「アッセイウィザード」フォーラムの下で「プロトコル」タブの下に測定時間を延長します。ミトコンドリアの株式やミトコンドリアプラス基板ソリューションが完全にロードする前に均質化されていない場合最後に、大きな変動が発生します。ウェル間の変動は、アッセイの実行後に高い場合は、完全に先立って次の実験に基質溶液を混合してください。決してミトコンドリア/基質溶液をボルテックスしない、むしろ、マッシュを攪拌し、ゆっくりと広げオリフィスピペットチップで粉砕します。

注目に値するこの技術のいくつかの制限があります。最初に、これらのアッセイのために使用される細胞培養プレート上のウェルの数が比較的低い（ すなわち 、24ウェルおよびブランクウェルのために指定される少なくとも2）。それは、1つのプレート上にこれらのアッセイのすべて5を実行することが望まれる場合、研究者は、一度に1つのマウスからの応答を調べることができます。しかし、96ウェル機器がhigheために利用可能であることに留意すべきですR・スループット。第二に^、1無傷の細胞中に比べて単離ミトコンドリアにおけるミトコンドリア機能障害の評価に固有の長所と短所があります。いくつかの弱点は、無傷の細胞と分離プロセスから誘導成果物に比べて少なく、生理学的関連性を有するものが挙げられます。最後に、この方法の成功は、ミトコンドリアの単離プロセスの品質次第です。

これらのアッセイのいくつかは、どちらかの異なるシステムが開発されているまたは他の動物モデルで確認されているが、本明細書に提示される方法は、マルチウェル酸素消費量測定装置を用いてマウスに最適な使用のための上記のアッセイの全てを合成する最初のものです骨格筋。したがって、最小限の材料で高いスループットを提供し、マウス骨格筋100mgの - 重要なことに、これらのアッセイの全ては、5〜75から単離されたミトコンドリアの量を行うことができます。大きな意義、マルチウェルの能力の酸素消費技術が最適化された分離方法と組み合わせて、ミトコンドリアの最小量とのアッセイを実行するために、研究者は、骨格筋組織の残りは他の実験（ 例えば 、ウェスタンブロットの多数を実行することができ、RT-PCR、酵素アッセイ、など）、多くの場合、この動物モデルとの闘いです。

結論として、本明細書に提示する方法は、マウス骨格筋の最小量を用いて、マイクロプレートベースの呼吸アッセイのコレクションのパフォーマンスのためのステップバイステップの手順を提供します。重要なことは、提示された方法は、組織およびミトコンドリアの最小量を必要とします。一度習得し、本明細書に記載の技術は、研究者が一般的に使用される動物モデルにおいてミトコンドリアの酸素消費量に対する化合物または遺伝子産物の潜在的なメカニズムを決定することを可能にします。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
スクロース	Sigma Aldrich	S7903	RT
D-マンニトール	Sigma Aldrich	63559	RTに保管
リン酸カリウム一塩基性、最小99.0%	Sigma Aldrich	P5379	RTに保管
塩化マグネシウム六水和物、ACS試薬、99.0-102.0%	Sigma Aldrich	M9272	RT
HEPESに保管 最低99.5%滴定	Sigma Aldrich	H3375	RT
EGTA	Sigma Aldrich	E4378	RT
Essentially Fatty	シグマアルドリッチ	A6003	4 °で保存;C
酸フリー-BSA
ピルビン酸、98%	シグマアルドリッチ	107360	4°Cで保管。C
コハク酸	シグマ Aldrich	S9512	RT
L(-) リンゴ酸、BioXtra、≥95%	Sigma Aldrich	M6413	RT
L-グルタミン酸	Sigma Aldrich	G1251	RT
N,N,N′,N′-テトラメチル-p-フェニレンジアミン	Sigma Aldrich	T7394
99%に保存、粉末 [TMPD]
パルミトイルL-カルニチン塩化	Sigma Aldrich	P1645	-20°Cで保存;C
オリゴマイシン A, ≥ 95% (HPLC)	Sigma Aldrich	75351	-20 °C で保存;C
シアン化カルボニル 4-(トリフルオロメトキシ)	Sigma Aldrich	C2920	2 - 8 °C
フェニルヒドラゾン
≥98%(TLC)、粉末[FCCP]
Streptomyces sp.由来のアンチマイシンA。	シグマ アルドリッチ	A8674	-20 °C
アデノシン 5′-二リン酸一カリウム塩脱水 [ADP]	Sigma Aldrich	A5285	-20 °C;C
ロテノン	シグマ アルドリッチ	R8875	RT
ピアス&トレードの店舗。BCAタンパク質アッセイキット	Thermo Scientific	23225	該当なし