微生物群集を学びますインビボ：ホスト間の媒介の相互作用のモデルカンジダと緑膿菌航空で

サマリー

宿主と病原体の相互作用に関するin vitro研究は特定の免疫応答の特性評価を可能にしますが、複雑な反応の影響を観察するにはin vivoモデルが必要です。カンジダ・アルビカンスの曝露とそれに続く緑膿菌媒介性肺感染を用いて、人工呼吸器関連肺炎の病原性に関与する微生物相互作用のマウスモデルを確立した。

要約

宿主 - 病原体相互作用を研究することは、微生物感染の間に病原性の根底にあるメカニズムを理解することを可能にしています。ホストの予後は、病原体¹に対する適応免疫応答の関与に依存します。免疫応答は複雑であり、病原体およびいくつかの免疫または非免疫細胞型²との相互作用の結果である。in vitro試験は、これらの相互作用を特徴付けるおよび細胞-病原体相互作用に焦点を当てることはできません。また、特に化膿性慢性肺疾患を有するか、機械的に換気患者の患者における気道^3に 、複数菌のコミュニティが存在しており、宿主-病原体相互作用を複雑にする。 緑膿菌及びカンジダ・アルビカンスは、両方の問題が頻繁に気管支サンプルから単離し^、4病原体である、と特に集中治療^部 5に、重症感染症に関連します。微生物の相互作用が持っていますin vitroでこれらの病原体の間で報告されたが、これらの相互作用の臨床的影響は不明⁶のままされて。 C。アルビカンスとPとの間の相互作用を研究するために、 緑膿菌 、CのマウスモデルP.続いアルビカンス気道の植民地化、 aeruginosa-媒介急性肺感染を行いました。

概要

動物モデル、特にマウスは、広範囲の病原体に対する免疫応答を探索するために使用されています。自然免疫と獲得免疫は、げっ歯類およびヒト⁷との間で異なるが、繁殖の容易かつ多数の遺伝子のためのノックアウトの開発は、免疫応答^{8を研究するために}マウスに優れたモデルを作ります。免疫応答は複雑であり、病原体の相互作用の結果、常駐微生物叢およびいくつかの免疫（リンパ球、好中球、マクロファージ）および非免疫（上皮細胞、内皮細胞）細胞の種類は^2。 インビトロ研究は、観察ができませんこれらの複雑な相互作用は、主にユニークな細胞 - 病原体相互作用に焦点を当てています。動物モデルは、注意して使用し、非常に具体的で関連の質問に限定されなければならないが、マウスモデルは 、in vivoでの哺乳類の免疫応答に優れた洞察力を提供し、重要な臨床的な質問⁷の一部に対処することができます。

気道では、微生物群集は異なる微生物⁶の多数を関連付ける複雑です。構成するもの "通常の"気道microbiomeが決定されていないものの、居住者のコミュニティは、しばしば複数菌であり、多様な生態系のソースに由来します。化膿性慢性肺疾患（嚢胞性線維症、bronchectasis）の患者や人工呼吸器患者が環境に獲得した微生物⁹による気道の植民地に特定の植物相を示す。 緑膿菌及びカンジダ・アルビカンスは、両方の問題が頻繁に気管支サンプルから一緒に分離され^、5病原体であります、特に集中治療室^（ICU）4で、これらの患者における重篤な日和見感染症の責任。

P.に対する抗微生物処理におけるICU結果に急性肺炎の間にこれらの微生物の単離緑膿菌 BUT酵母は通常、このサイト⁵で病原性とはみなされません。Pとの間の インビトロ相互作用を緑膿菌とC.アルビカンスは、広く報告され、これらの微生物が成長し、お互いの生存に影響を与えることができるが、研究は結論付けていないことを示したされている場合はCの存在アルビカンスは、有害なまたはホスト¹⁰のために有益です。マウスモデルは 、Pのこの関連性に対処するために開発されました緑膿菌とC. 生体内で アルビカンスが、微生物間の相互作用が重要なポイントではありませんでした。実際、このモデルはCの関与を評価するために設立されました宿主免疫応答、および結果でアルビカンス 。

ルーらによって確立された以前のモデルは、すでにCで初期定着を使用しましたPによって誘発される急性肺感染が続くアルビカンス 緑膿菌は。彼らのモデルを使用して、著者らは、pの有害な役割を発見しましたrior C.アルビカンスは ¹¹コロニー形成します。しかしルーらは、C の高負荷を使用しました3日間連続2×10 ⁶ CFU /マウスで彼らのモデルでアルビカンス 。我々は、Cの 4日間のモデルを確立しアルビカンスは、このモデルCに、肺損傷せずに植民地化、または少なくとも持続気道アルビカンスは、マウス （ 図^2B）12,13あたり10 ⁵ CFUの単一点眼後4日までに取得されました。 4日後、炎症細胞補充、炎症性サイトカインの産生も上皮損傷の証拠は観察されませんでした。 48時間、Cのピーク存在で- 24時、細胞およびサイトカイン先天性免疫応答が観察されたにもかかわらず、肺損傷の証拠はアルビカンスなかったです。驚くべきことに、マウスは、このようにCで植民地化前Pの鼻腔内点滴注入にアルビカンス 48時間緑膿菌は 、Pを用いたマウスに比べて感染を減弱していました単独の緑膿菌感染症 。私ndeed、マウスが少ない肺損傷を示し、細菌負荷^{12,13を減少させました} 。

いくつかの仮説は、Cで前植民地のこの有益な効果を説明することができますP上 アルビカンス 緑膿菌は、急性肺感染症を媒介しました。まず、各微生物クオラムセンシングシステム、homoserinelactoneベースのPを含む種間のクロストーク緑膿菌システムとファルネソールベースC.アルビカンスシステムは 、評価しました。第二に、C。肺上皮細胞からの病原体を流用緑膿菌のための「おとり」のターゲットとして機能するアルビカンスを検討しました 。どちらの仮説は（未発表データ）無効化されました。第三の仮説は 、Cによって先天性免疫系の「プライミング」のそれでしたP.に対する強化された後続の生得的応答を担うアルビカンス 緑膿菌 。この最後の仮定が確認されました。実際、C。アルビカンスのコロニー形成は、先天性免疫のプライミングthrouにつながりましたGH IL-22は、主に増加した細菌のクリアランスをもたらす、先天性リンパ系細胞によって分泌され、肺損傷^{12を減少させました。}

結論として、ホストは、自然免疫応答を調節し、種々の炎症性細胞型が関与する微生物との間の相互作用の中心的俳優です。これらの複合体の免疫相互作用がインビトロで切開することができるが、最初の仮説は、in vivoモデルで適切によって提供され得ます。以下のプロトコルは、他の微生物に適合させることができる宿主媒介病原体相互作用の in vivo研究の例を提供します。

プロトコル

動物実験のための地域の倫理委員会は、地域の治験研究指針における国内および国際的な動物のケアと用途に応じて、この方法を承認しました。

1.サンプルの採取

1. 試料保存
   1. 劣化を避けるために、冷凍保存まで20℃または氷上で - で保存してすぐにすべてのサンプルを収集し。気管支肺胞洗浄液（BAL）の性能を向上させるために、氷上で滅菌リン酸緩衝食塩水（PBS）を置きます。
2. 手術
   1. オートクレーブを使用して、すべての手術用機器を滅菌します。
      注：可能な場合は、交差汚染を避けるために、腹部と胸部のステップのための機器の二つの異なるセットを使用することをお勧めします。必要な解剖装置は、図4（a）に詳述されています

2.マウス、細菌や酵母株

1. 再における動物の局所的な使用に準拠したハウスマウスバイオセーフティーレベル2微生物の使用にバイオセーフティーレベル2収容施設で、食料や水アドリブで、ケージあたり5匹を超えることなく換気ラック内検索委員会のガイドライン：P。緑膿菌とC.アルビカンス。
2. 40％のグリセロール培地中で-80℃で細菌株を保管してください。
   1. 10μlの接種ループを使用して滅菌LB培地の3ミリリットルを含む培養チューブに凍結ストックから直接細菌を追加します。軌道点眼前日（400 rpm）し振とうしながら37℃でN / Oのままにしておきます。
   2. 5分間2000×gで遠心分離することによって収穫細菌。
   3. 適切なクローズドバイオハザード廃棄物処理に上清を吸引除去します。培養管の底に白い付着ペレットを観察します。
   4. 5mlのPBSを使用してペレットを洗浄し、一時停止。
   5. 繰り返して、第二の洗浄を行うための第2の時間を2.2.3する2.2.2を繰り返します。
   6. 1mlのPBSを使用してペレット化した細菌を再懸濁し簡単なボルテックス。
   7. 光学濃度計を用いて600nmでの光学濃度計を使用して、接種密度を決定します。 0.9の密度は、PAO1 10 ⁹ CFU / mlに相当し、それに応じて希釈します。
      注：この結果は、較正された接種物の連続希釈物の濃度を決定することによって、各使用した株について得られなければなりません。
   8. シリアル対数希釈液によって接種物を確認し、ブロモクレゾールパープル寒天（BCP）プレートとO / N培養上の各希釈液100μlをプレート。鼻腔内に1mlあたり1×10 ^{8〜2×10 8} CFU（マウスあたり5×10 ^{6〜1×10 7} CFU）を含む溶液50μlを各マウスを管理します。
3. 使用C.参照株としてアルビカンス SC5314。 -80℃で40％グリセロール培地中で株を節約。
   1. 0.015％のアミカシンとサプリメント酵母ペプトンデキストロースブロス細菌汚染を回避し、さらに数を容易にします。
   2. および10を使用して酵母を追加＃181; 37℃でアミカシン、O / Nで補充準備YPDブロスにリットル接種ループ。
   3. 5分間2000×gで遠心分離することによって収穫酵母。
   4. 適切なbioharzardの廃棄物処理に上清を取り除きます。ホワイト付着ペレットは、培養管の底部に観察されるはずです。
   5. 洗浄し、PBSと簡単なボルテックスの5ミリリットルを使用してペレット化した細菌を一時停止します。
   6. 繰り返して、第二の洗浄を行うための第2の時間を2.2.3する2.2.2を繰り返します。
   7. PBSおよび簡単なボルテックスの1ミリリットルを使用してペレットを再懸濁。
   8. 40倍の倍率で、標準的な顕微鏡を用いてMallassezの血球にカウントすることにより、接種物のサイズを決定します。
      注：（酵母の数×10 ^{5）/（Mallassez}の血球のカウントグリッド矩形の数）：（CFU / ml単位）の濃度は、以下の式を用いて得られます。
   9. そのソリューションが含まれているを確認するために10 ^{-5、10 -6}シリアル対数希釈することによって確認し、2×10 ⁶ CFU / mlです。
   10. 0.015％のアミカシンを補ったYPD寒天プレート上にプレート。

C. 3.航空植民地化アルビカンス

注：環境順応後、マウスを一日二回秤量します。

1. ヒュームフードの下では、4センチメートル×4センチガーゼ（オープン・ドロップ技法^）14へのセボフルランの預金を500μl。
   1. すぐに約750ミリリットル導入室の床の上にガーゼを置きます。すぐに動物とガーゼの間の直接接触を避けるために、ガーゼの上にメッシュ上げプラットフォームを配置します。
   2. 気密蓋を閉じて、チャンバ内のセボフルランの拡散を可能にするために、1〜2分待ってください。
   3. プラットフォームと開閉蓋を噛み合うようにケージからマウスを転送します。保存された自発呼吸と軽い麻酔は30〜45秒で達成されるべきです。
   4. マウスをf除去することができる点で、正向反射の消失を観察することにより、低血圧を監視ボックスをROMや点眼。
2. 鼻腔内点滴注入（訓練を受けたオペレータにより10秒で実行することができます）。
   1. 片手が（ 図4B）直立開催の背中に囲まれ、マウスを押したままにします。
   2. 人差し指を使って、頭をサポートし、顎を維持するために親指を使用喀出（ 図4C）を回避するために、閉鎖しました。
   3. ステップ2.3.8で説明したように、準備されたCのことを確認してくださいアルビカンスソリューションは、ボリュームを点眼50μlのための1mlあたり2×10 ^{6 CFU}を含んでいます。
      注：第2の臨界点は、点眼ボリュームです。ボリューム下の50μlを不十分植民地化や気道の不均一な点滴をもたらす可能性よりも、より大きなボリュームは溺死/窒息と死を誘導する可能性があります。
   4. 鼻孔にピペットに接近することにより、マウスの鼻腔内を浸透さ。
   5. その後spontaneouslによって吸入鼻の溶液を含む泡を形成する50μlのドロップを、ピペットY呼吸マウス。
   6. リカバリ領域に入れマウス（例えば、オーバーヘッド加熱ランプを持つ大規模な、よく通気裸ケージ）。マウスは完全に覚醒するまで監視する必要があります。それは胸骨横臥し、立ち直り反射を維持するのに十分な意識を取り戻したまで無人の動物を放置しないでください。この時点で、マウスは、通常の住宅ケージに戻すことができます。

4. P.緑膿菌誘発性急性肺感染

注：マウスは、4つの次の日中に秤量します。通常、マウスは 、Cの間に体重が増えますアルビカンス媒介気道コロニー形成（ 図2A）。

1. Pを含有する懸濁液を準備緑膿菌 O / Nの成長（2.2節）後の点滴の日。
2. 前述したように（セクション3.1）吸入セボフルランを使用して簡単に麻酔。
   注：急性肺感染症を実行するために提案されている細菌負荷を推奨表1。
3. ポスト点眼回復に特に注意して（セクション3.2）のようにマウスを浸透さ。

肺損傷指数の5測定

1. FITC標識アルブミンを含む溶液を調製します。殺処分する前に、この溶液2時間を注入。
   1. 適切な機器とアルブミン-FITCの0.2 mgの計量。
   2. 1mlのPBSに0.2ミリグラムを追加します。簡単に言うと渦。すぐに使用しない場合は、周囲光への暴露を避けるために、ホイルにソリューションを配置します。
   3. 各マウスにFITC標識アルブミン溶液の腹腔内に200μLを注入します。
2. 安楽死
   1. 最後の重量データのためのマウスを秤量します。
   2. 5.47パーセントのペントバルビタールを300μl：ペントバルビタールの致死過剰摂取の腹腔内注射を用いた研究委員会のガイドラインにおける動物の局所的な用途に応じて、単一のマウスを安楽死させます。
   3. ケージからマウスを削除し、Lを受け取りますオペレータによるethal注入。
   4. 注入後、任意の他の動物から隠さ別のケージに単独でマウスを転送します。運動の不在になるまでマウスを観察します。死を確認して動き、特に呼吸運動、パルスの欠如が存在しないことです。
   5. したがって、麻酔薬や鎮痛剤なしで、死んだ動物のサンプルを外科的にコレクションを実行します。
3. 外科サンプル収集：胸部ステージ。
   注：無菌状態を維持するために、すべての手術は、バイオセーフティーレベル2環境で滅菌装置を用いて行われます。
   1. 皮膚にエタノールを適用します。ハサミで半ば腹部に胸骨から正中皮膚切開を行います。いずれかの側の胸郭に沿って正中切開から。胸郭を視覚化するために胸部の両側に皮を折り返します。
   2. どちらの側が船尾で全体の前部胸壁をリクライニングすることができるように、鎖骨に向かって行く上で胸郭の縦切開を行いますええと心臓や肺（ 図5A、5B）の完全な可視化を可能にします。
   3. 心室間の動脈の隣に心穿刺によって事前にheparined注射器を用いて血液を採取します。プラズマの少なくとも100μLを得るために、500μlの最低を撤回。氷上で血液サンプルを置きます。
   4. 気管（ 図5B及び5C）を可視化する正中頸部切開を行います。慎重に気管の周りの筋膜を切開します。気管（ 図5Cおよび5D）の背後に縫合糸を配置します。その後縫合糸は、適切な洗浄を確実にするためにカニューレ挿入針の周りに閉じられます。
   5. 20-Gを使用して気管をカテーテルを挿入強制経口投与針（ 図5Dおよび図4（a））を修正しました。以前に配置された縫合糸を挿管気管の周りに外科的な結び目を作ります。
   6. 気管支肺胞洗浄（BAL）を実行するには、静かに徐々に肺からの/への氷冷PBSを500μlを注入し、描画します。私にサンプルを置き、細胞溶解を回避するために、CE。
   7. 2ミリリットル遠心管（ 図5E）に1,500μlのBAL液とプール洗浄試料の合計を取得するための手順を繰り返し5.3.6、3回。
   8. 胸から肺を取り出します。 80°C - 1.5ミリリットル遠心管に（サイズが1肺またはローブの半分に対応する必要があります）とで急速に保存肺のセグメントを配置します。
   9. 細菌負荷を決定し、氷の上に置くために、PBSを含む予め秤量した溶血チューブに肺のセグメントを配置します。
4. 外科サンプル収集：腹部のステージ。
   1. 腹部の左側に別の切開を行います。腹膜を介して脾臓を守ってください。
   2. 氷上で1mlのPBSと場所を含む第二の溶血管に脾臓と場所を削除します。
5. 肺損傷指数
   注：肺胞毛細血管膜透過性は、肺胞 - interstに血管区画からのFITC標識アルブミンの漏出を測定することによって評価されますitialコンパートメント。
   1. 遠心血液サンプルと1500×gで10分間のBAL液。新しい遠心チューブに上清を収集します。ペレットは、血漿またはBAL細胞を動員し、氷上に置かれるべきである対応します。
   2. 96ウェル透明板（300μlのウエル）に各血液上清（血漿、黄色）、またはBALの上清100μlを追加します。すぐに使用しない場合はプレートに箔を置きます。
   3. 血漿中の蛍光レベルを測定し、BALは、蛍光マイクロプレートリーダー（励起、487 nmで、発光520 nm）を用いて上清。
   4. 蛍光比を計算することにより、肺損傷指数を決定[（BAL上清/血液上清）×100]。
6. 気管支肺胞洗浄（BAL）の細胞計数差動。
   注：ステップ5.5.1でBAL液の遠心分離から得られた細胞ペレットを使用してください。
   1. 必要に応じて、赤血球溶解緩衝液を使用。セルを含む遠心管に赤血球溶解緩衝液500μlを加えますLペレット。簡単に言うとボルテックスし、氷上で10分のままにしておきます。赤血球の溶解を停止するために500μlのPBSを追加します。
   2. 1,500×gで10分間の遠心分離によって細胞を回収。上清を除去し、滅菌PBS 1 mlの中に細胞ペレットを中断。 Mallassezの血球の細胞を列挙します。セルをカウントする血球計算盤を使用しました。サイトスピンでスライド上の細胞を濃縮します。
   3. セル識別および計数（マクロファージ、リンパ球、好中球）を可能にする着色キットを用いて染色細胞。
7. 肺細菌負荷および細菌普及
   注：肺細菌負荷を評価するために、細菌の普及、肺および脾臓をそれぞれ1mlのPBS（ステップ5.3.9）を含む予め秤量した溶血チューブに収集し、保存しました。
   1. 1mlのPBSおよび肺または脾臓のいずれかを含む溶血管を計量。肺ホモジネートおよび脾臓ホモジネートを得るために、組織ホモジナイザーを用いてサンプルを均質化します。
   2. デポジット組織ホモ100μlのシリアル対数希釈液を得るために、無菌のPBS 900μLを含む遠心チューブにgenates。
   3. Pの BCP寒天のいずれかのプレート2の最後の適切な希釈した試料（10 ^-3および10 ^-2） Cの 緑膿菌やYPD-アミカシン補充寒天アルビカンス肺および脾臓負担決意。
   4. 37℃でプレートO / Nインキュベートします。翌日、プレート上のコロニーを列挙。
   5. インデックス肺重量の結果は、肺のグラム当たりのCFUを得ました。肺サンプルサイズが同じではない、その結果、肺のグラム当たりのCFUで表現する必要があります。
      インデックスの計算式は次のとおりです。[CFU]×[溶血管と肺の重量​​] - [溶血管の重量]。

結果

プロトコル記述中に以前に見られるように、実験は、（：実験のタイムライン図1）を完了するために5日必要があります。一人のオペレータは、実験の全実行中に募集され、最大10匹のマウスの最大のプロセスを処理することができます。多くの動物が必要な場合は、二人は、特に外科用サンプル採取のために必要とされます。実際、すべてのサンプルは、最後のマウスでのFITC標識アルブミンの増加パッシブ肺胞毛細血管の漏れを回避するために、2時間の下で収集されなければなりません。

最初のステップは、Cの製造でありますCで気道コロニー形成を得るためにアルビカンス接種材料と鼻腔内点滴注入アルビカンス 。 4日永続性モデルはCの 5×10 ⁵ CFUの鼻腔内点滴注入することによって得られますマウスあたりアルビカンス （ 図2B）。これらの4日の間に、マウスは体重（ 図2A）および 5×10 ...

ディスカッション

動物モデル、特に哺乳動物は、免疫の分野における宿主 - 病原体相互作用の複雑なメカニズムを解明するのに有用です。もちろん、唯一の動物モデルから得られる情報の必要性が不可欠である必要があります。そうでなければ、動物の使用は 、in vitroモデルに置き換えなければなりません。この動物モデルは、病原体の間の相互作用が多成分宿主応答によって媒介されるので、唯一の動物モデルで提供することができる洞察を示しています。現在、この宿主 - 病原体の相互作用を研究するために使用したマウスは、成熟と変化していない免疫応答で6〜10週齢の若年成人です。先天性免疫応答に着目した場合、のC57Bl6 / Jバックグラウンドマウスが好ましいです。セックスと免疫応答のホルモンサイクル（特にエストロゲン）の影響を回避するために、男性はそのための最良の選択です。統計的有意性を達成するために、グループは、実験の終了時に、少なくとも5個体を持っているが、すべての動物experimenによって示唆されるようにしなければなりませんテーションのガイドラインは、使用する動物の数は、厳格な最小限に低減し、洗練されなければなりません。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
セボラン、セボフルランア	ボット	05458-02	250 mlペットボトル
蛍光リーダーMithras LB940	Berthold Technologies	最初の列の参照	コメントはありません
Bromo-cresol 紫寒天	Biomerieux	43021	単位あたり 20x
ペントバルビタール ソディク 5.47%	CEVA	6742145	100ml プラスチックボトル
2ヘッドバルブ	Distrimed	92831	ノーコメント
滅菌接種ループ 10 & マイクロ;l	Dutscher	10175	x1,000 コンディショニング
Insuline シリンジ 1 ml	Dutscher	30003	per 100 コンディショニング
2 ポジション 培養チューブ 8 ml	Dutscher	64300	ノーコメント
Ultrospec 10	ゼネラルエレクトリックライフサイエンス	80-2116-30	ノーコメント
溶血チューブ13 x 75 mm	ゴセリン	W1773X	per 100
PBS - Phosphate-Buffered Saline	Lifeテクノロジー	10010023	500 mlの
アミカシン1 g	Mylan	62516778	per 10
ヘパリン 10,000 UI 2 ml	パン ファーマ	9128701	1 ユニットあたり 10x
RAL 555 着色キット	RAL 診断	361550	100 mL
1.5 ml 微量遠心チューブ	Sarstedt	55.526.006	x 1000
透明 300 & マイクロ;l 96ウェルプレート	Sarstedt	82 1581500	ノーコメント
Yest-peptone-Dextrose Broth	Sigma	95763	in powder
FITC-albumin		Sigma A9771	in powder
Luria Bertani Broth	Sigma	L3022	in powder
25 gauge needle	Terumo or unisharp	A231	x 100
Conditioning, Cytocentrifuge	Thermo Scientific	A78300003	コメントはありません