方法論記事

エンジニアクォーラム焼入れラクトナーゼを使用して、病原性バイオフィルムの抗病原性破壊

DOI：

10.3791/53243

⸱

2016年1月1日

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1Department of Biochemistry, Yong Loo Lin School of Medicine, 2Department of Chemistry, University of Utah, 3Synthetic Biology Research Consortium, National University of Singapore

この記事について

サマリー

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クォーラムクエンチング酵素は、抗生物質耐性とバイオフィルム形成に関連する病原性因子と遺伝子の発現を防ぐことにより、耐性を生じさせるリスクなしに病因を軽減できる抗毒性および抗菌性の選択肢です。本研究では、細菌のバイオフィルム破壊におけるクォーラムクエンチング酵素の有効性を実証した方法を報告する。

要約

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多剤耐性菌の急速な出現により、生命を脅かす感染症に対抗するための新しい治療アプローチの必要性が加速しています。細菌感染の持続性は、多くの場合、クォーラムセンシングを介したバイオフィルム形成に関連しています。したがって、このシグナル伝達回路の破壊は、魅力的な抗病原性戦略を提示する。クォーラムクエンチングラクトナーゼは、クォーラムセンシング回路の効果的な妨害因子であることが報告されています。しかし、これらの酵素が細菌のバイオフィルム形成を阻害するのに効果的に使用されるという報告はほとんどありません。このプロトコルは、工学的クォーラム消光ラクトナーゼを使用して、臨床的に関連するA.バウマニーS1株のバイオフィルム形成を破壊する方法を説明しています。アシネトバクター・バウマニーは、世界的に深刻な院内感染に関与している主要なヒト病原体であり、その病原性は主にそのバイオフィルムの粘り強さに起因しています。遺伝子操作されたラクトナーゼ処理により、A. baumannii S1 バイオフィルムの大幅な減少が達成されました。この研究はまた、バイオフィルム媒介性細菌性疾患の将来の治療に人工クォーラムクエンチング酵素を使用する可能性を示しました。最後に、この方法は、有望なクォーラムクエンチング酵素の能力を評価するために使用できます。

概要

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感染症の治療の選択肢は、抗生物質1の広い範囲に影響されない多剤耐性菌の急速な増加によって複雑にされています。耐性細菌媒介性感染症からの高い罹患率および死亡率と、薬物開発プロセスをエスカレートおよび/または治療選択肢を改善するための優れた抗菌選択肢を探索する必要があります。最近では、抗病原性のアプローチは、したがって耐性機構2のリスクを軽減する、非殺菌方法を介して病原性を防止する上で、その潜在的な特定の関心を集めています。

クオラムセンシングは、このシグナリング現象の細菌の病原性と混乱の「マスタースイッチが「病因3に対する有望な抗病原性の方法です。重要な細菌の人口密度に達した後毒性の発症は細胞外環境における定足数の分子の蓄積が必要です。現状として、ラム酒の分子は、その同族受容体との結合は病原性因子だけでなく、抗生物質耐性およびバイオフィルム形成を4に関連する遺伝子の活性化につながる、細胞内マトリックスに戻って拡散します。一般的には、クオラムセンシング破壊が主要代謝経路に影響を与えることなく、定足数分子と受容体の相互作用を阻害することを含みます。したがって、細胞の成長に直接的な意味合いを持っていません。適応度が損なわれないので、進化し、そのような治療5に対する耐性を得るために、細菌のための最小限の選択圧があります。また、クオラムセンシングの破壊は、抗細菌剤からの保護を提供し、免疫応答をホストしてバイオフィルム形成の場合のように、固有の細菌の防御機構を妨害することができます。

それは、地球上の微生物の99％は目の中に生きた微生物に重要な生存の利点を付与する、複雑なバイオフィルムのようなマトリックス中に存在することが推定されていますESEの構造6。さらに重要なことは、これらの固着ドメインの形成は、最も永続的なおよび慢性院内感染7の原因である。 アシネトバクターバウマニは、グローバルな院内感染に関連付けられており、その毒性が大きくクオラムセンシングに起因する主要なヒト病原体の一つであります媒介バイオフィルム形成8。クォーラム消光酵素は、グラム陰性菌9によって生成されたN -アシルホモセリンラクトン（AHLs）として知られている化合物群をターゲットにして、クォーラムが介在するシグナル伝達を妨害するで正常に使用されています。いくつかの研究はまた、バイオフィルム10,11における毒性因子の発現および細胞数の削減による細菌の病原性を遮断するために、これらの酵素の使用に拡大しています。残念ながら、細菌性病原体によるバイオフィルム形成に対する定足数消光酵素の有効利用の触知可能なデモの欠如が残っています。ザ・再A.を破壊し 、定足数阻害剤（AHL類似体）、代わりの定足数消光酵素を使用する試みてきましたバウマニバイオフィルム形成12。小分子阻害剤を使用して、この方法が有効なアプローチであるが、翻訳の用途におけるその生物学的利用能を維持することが課題であることができます。酵素は治療効果のための生物医学装置の表面上に固定化に対してより敏感に反応するように逆に、触媒定​​足数消光酵素の使用は、生物学的利用能の問題を回避することができます。

ここでは、クリスタルバイオレット染色および共焦点レーザー走査顕微鏡（CLSM）を用いて、細菌のバイオフィルム形成に13（GKL） ゲオバチルスのkaustophilusから操作さクオラムクエンチングラクトナーゼの効果の評価を説明します。この研究は、臨床的に関連するAのバイオフィルム破壊の最初に成功した実証であります定足数消光酵素を用いバウマニ S1株。方法が記載さこの研究において、病原性グラム陰性菌に対する後続の治療の開発努力の他のクオラムクエンチング酵素の有効性を評価するために有用です。

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プロトコル

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Aのバイオフィルム形成の1クリスタルバイオレット定量バウマニ S1

  1. A. 5mlの文化を育て振盪インキュベーター（220 rpm）し、30℃でのLB培地（LB）（トリプトンを10g / L、酵母エキス5グラム/ L）でバウマニ S1 16時間。
  2. A.の文化を調整バウマニ S1 0.8の所望のOD 600まで。 96ウェルプレートを使用して、細菌培養物接種：精製GKL酵素（40 mg / mlで）の10μLを含有する新鮮なLBに（1 100希釈）。新しい文化の最終容量は100μlです。
  3. 同様に対照培養物を準備し;これは、任意の酵素が含まれません。複製の所望の数を得るために同様の条件を繰り返します。
  4. 蓋付きプレートを覆い、密封された10リットルのプラスチック容器に入れてください。優しくメディアを削除する前に、3時間、30℃でプレートをインキュベートします。
  5. 新鮮なLB培地の別の100μlをウェルに加え、30℃で21時間静置します。
  6. インキュベーションの第二の期間の後、静かにすべてのメディアを削除します。 200μlの滅菌水でプランクトン細菌細胞を洗浄します。洗浄中の細胞にのみ最小限の乱れがあることを確認します。
  7. 各ウェルに1％クリスタルバイオレット溶液100μlを加え、室温で15分間インキュベートします。 200μlの滅菌水でよく洗浄することにより、クリスタルバイオレット溶液を除去します。さらに2回の洗浄を繰り返します。
  8. 各ウェルに33％酢酸を100μl加え、穏やかに振盪しながら15分間インキュベートします。これは、色素を溶解します。
  9. 600nmにおけるクリスタルバイオレットの吸光度を測定することによって形成されたバイオフィルムの量を定量します。クリスタルバイオレットの量は、形成されたバイオフィルムの量に比例します。

A. 2.共焦点レーザー走査顕微鏡バウマニ S1バイオフィルム

  1. A. 5mlの文化を育て16時間振とう培養（220 rpm）し、30℃でのLBでバウマニ S1。
  2. 広告A.だけの文化バウマニ S1 0.8の所望のOD 600まで。 35mmのガラス底のμ-皿を使用して、細菌培養の接種：精製されたGKL酵素（40 mg / mlの）の30μLを含む新鮮なLBに（1 100希釈）;新しい文化の最終容量を1 mlです。
  3. 蓋付きのμ-皿を覆い、密封された10リットルのプラスチック容器に入れてください。優しくメディアを削除する前に、3時間30℃でμ-皿をインキュベートします。 1ミリリットルの全容量にそれをもたらし、精製GKL酵素と新鮮な培地30μlのを追加します。 30℃でさらに21時間インキュベートします。
  4. 繰り返しステップ2.3および30℃でさらに24時間μ-皿をインキュベートします。そして、そっとメディアを削除します。
  5. μ-皿にハンクス平衡塩溶液（HBSS）中に溶解し5μg/ mlのアレックスのFluo 488結合小麦胚芽凝集素（WGA）の500μLを加え、37℃で30分間インキュベートし;これは、形成されたバイオフィルムを染色します。 T染色溶液を除去し、洗浄彼はHBSS 2mlで皿をμ。洗浄ステップをもう一度繰り返します。
  6. HBSSに溶解した3.7％ホルムアルデヒド500μlのを追加し、37℃で30分間インキュベートし;これは、μ-皿にバイオフィルムを修正します。 HBSS 2mlで一度μ-皿を洗い、その後、完全に溶液を除去。 μ皿バイオフィルムで固定前CLSM画像に4℃で暗所に保存することができます。
  7. CLSMイメージングおよび分析のために、スタックあたり0.21ミクロンの間隔で画像あたり97スタックを生成するために、63倍の倍率を使用しています。

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結果

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クリスタルバイオレット定量実験では、2つの定足数消光酵素がバイオフィルム形成を破壊で実行可能性を実証するために使用した：野生型GKLおよび改善GKL二重変​​異（E101G / R230C）。両酵素は、3-ヒドロキシデカノイル- L -ホモセリンラクトン（3-OH-C 10 -HSL）、A.で使用される主要な定足数分子に対するラクトナーゼ活性を示すことが示されていますバウマニ S1 14。バイオフィルム破壊の有効な評価のために、（以前AHLリガンドを封鎖しないように示す）には、それぞれの触媒的に不活性な酵素も即時コントロール（GKLのD266N変異体とGKL E101G / R230C / D266N変異体）として含めました。野生型A.を使用するだけでなくバウマニ S1、変異体Δ アバイ株 （AHL合成酵素欠損）のバイオフィルム形成能も試験しました。定足数消光酵素、野生型GKLとGKL E101G / R230C変異体の両方が大幅に前にバイ...

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ディスカッション

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実験の両方のセットは、A.バウマンニ S1は、高い塩濃度とのNaClなしLB培地で培養したバクテリア15によって形成されたバイオフィルムの量を減少させることができます。このようなアーティファクトの存在は、バイオフィルム形成量、ならびに異なる処理条件全体の定足数消光酵素の影響を過小評価する可能性があります。触媒的に不活性な酵素の使用は、酵素隔離の影響の可能性を排除するために、陰性対照として重要である。非アクティブな酵素が定足数分子を隔離する場合でも、 図1に示す図 、バイオフィルム形成が中断されていません。

A.バウマンニ S1は、96ウェルプレートのウェルに空気と液体の界面との間の微妙なリング状のバイオフィルム構造を形成します。したがって、それは、細菌バイオフィルムの偶発的除去を防止するために、メディアの取り外しおよび洗浄工程の間に過剰な撹拌を避けるために重要です。 LB培地は、各インキュベーション後に削除されました浮遊細胞を除去します。加えて、96ウェルプレートを、空気流中の摂動を最小に...

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開示事項

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著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

謝辞

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この作業は、教育省の学術研究基金、国立医学研究評議会、およびシンガポール国立研究財団からの助成金によって支援されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
トリプトン BD211705
酵母エキスBD212750
96 ウェルプレートCostar3596
クリスタルバイオレットシグマ-AldrichC6158
酢酸ラボスキャンPLA00654X注意: 可燃性
μ-ディッシュIbidi80136
Alex Fluo 488-共役 WGAインビトジェンW11261
ハンク'の平衡塩溶液 Invitrogen141475095
ホルムアルデヒドSigma-AldrichF8775注意:腐食性 
Synergy HT マイクロプレートリーダーBioTek
1X-81 倒立蛍光顕微鏡Olympus

参考文献

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  1. Alanis, A. J. Resistance to antibiotics: are we in the post-antibiotic era? Archives of medical research. 36, 697-705 (2005).
  2. Cegelski, L., Marshall, G. R., Eldridge, G. R., Hultgren, S. J. The biology and future prospects of antivirulence therapies. Nature reviews. Microbiology. 6, 17-27 (2008).
  3. LaSarre, B., Federle, M. J. Exploiting quorum sensing to confuse bacterial pathogens. Microbiology and molecular biology reviews : MMBR. 77, 73-111 (2013).
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