ex vivoで腸嚢は、胃腸疾患のモデルに粘膜透過性を評価するために

サマリー

このプロトコルは、腸バリア機能のex vivoモデルとして、切除された腸組織製剤または「腸嚢」の使用について説明しています。このモデルは、消化器疾患の動物モデルにおいて、特定の腸部位における上皮バリアと粘液ゲル層の両方の完全性を評価するために使用できます。

要約

上皮バリアは、胃腸管の最初の先天的防御であり、選択的基盤となる組織区画に内腔からの輸送を調節し、上皮を通過する小さな分子の輸送を制限し、ほぼ完全に上皮高分子輸送を禁止します。この選択性は、親油性分子との両方の頂端受容体および上皮のタイトジャンクションタンパク質複合体の輸送を制限する粘液ゲル層によって決定される。上皮のin vitro細胞培養モデルは便利であるが、モデルとして、それらが欠け微生物、粘液ゲル、上皮および免疫系の間の相互作用の複雑さ。一方、腸管吸収または浸透性のインビボ評価を行うことができるが、これらのアッセイは、部位特異性の兆候と、全体的な消化管吸収を測定する。「腸の嚢」を用いてエクスビボ透過性アッセイ;腸の部位特異性の付加的な利点と、特定の分子の全体的な腸の整合性や比較のトランスポートのいずれかを測定するの迅速かつ高感度な方法です。ここでは、透過性の研究と見かけの透過性（P _アプリ ）の計算のための腸嚢の調製を記載 腸管バリアを通過する分子の。この技術は、薬物吸収を評価する方法として使用することができる、または胃腸疾患の動物モデルにおける地域上皮バリア機能障害を検討します。

概要

消化管の腸上皮障壁はヒト成人で400メートル²で推定粘膜表面積です。したがって、常に微生物、摂取薬、栄養素や細菌毒素から挑戦にさらされています。ホストが許容共生細菌と潜在的な病原体を区別しなければならないだけでなく、同​​時に、栄養素の吸収を可能にしながら、上皮関門を通過するから、これらの種とそれらの分泌分子を防止しなければなりません。このように、腸上皮の役割は、管腔の内容物¹に対する選択的障壁として作用することです。これは部分的に、構成的および誘導機構^{2からなる}反応性生物系を介して作用する粘膜における先天上皮防御システムによって、達成されます。

上皮バリア機能の喪失は、胃腸疾患の多数の特徴的な病理である。 インビボでの上皮のバリア機能の検査は、トレーサー分子およびその後の血清の分析³の強制経口投与を介して評価することができます。しかし、この技術は、バリア機能障害のサイトへなどの兆候を提供していません。 vitroおよびトランスウェルシステム^3を使用し、それぞれのチャンバ^4,5をアッシング経上皮抵抗のex vivoでの評価では、一般的に上皮のバリア機能の代理マーカーとして使用するが、動物モデル⁶の貢献疾患の生理機能を欠いています。このプロトコルでは、レベルの数で粘膜バリア機能を評価するために使用され得る腸の完全性との直接及び局所的な評価を可能にするエクスビボ組織標本のモデルが記載されています。重要なことに、この手法は、疾患の動物モデルに適用することができる、または薬理学的に粘膜障壁機能障害の深さ質問に可能にするように操作することができます。

プロトコル

このプロトコルのすべての動物の作業はニューカッスル大学の動物倫理委員会に厳密に準拠して行われている手順を承認しました。

楽器、文化メディアと皿の作製

1. プリ暖かいメディア199（TC199）またはダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）メディア37へ °C。 95％O _{2/5％CO 2}でバブリングすることにより事前含酸素媒体。媒体は7.3の最終pHを持っていることを確認してください。
2. 各嚢のための2つの5cmのセクションを切断して縫合糸を準備します。ループ閉じられていない結び目に縫合糸。

2.解剖および消化管の調製

1. 安楽死の前に固形食12時間を撤回。必要であれば、この時間の間に栄養ゲルサプリメントに動物を配置します。
2. 施設内倫理プロトに従って頸椎脱臼に続いてペントバルビタールナトリウムの過剰摂取（[200ミリグラム/キログラム]、腹腔内注射）によりマウスを安楽死させますCOLSは、腹部と胸部の上に70％エタノールをスプレーし。
3. はさみを使用して、腹部の真ん中に横切開を行い、腹膜を露出させます。
4. 分離し、幽門括約筋で胃から小腸上部を切断し、肛門縁で大腸を切断することにより、消化管を除去するために進んでください。優しく腸間膜を削除するために鉗子を使用します。予め温め、酸素媒体中で腸管を置きます。
5. （ 図1）の透過性について評価する腸の部分を特定し、腸管の残りの部分から自由にこのセクションをカット。
   1. 動物間の一貫性を維持する胃十二指腸および空腸の相対的なセクションを測定し、盲腸を結腸及び回腸の相対的なセクションを測定するために。
   2. 組織セグメントを選択する場合、そのようなパイエル板などの粘膜関連リンパ組織の存在に注意してください。これらは小さなうなずきとして同定することができますルーメンの漿膜側のジュール。
   3. 1ミリリットルの注射器を使用して、静かに予熱したPBS（37°C）でペトリ皿に腸セグメントの管腔内容をフラッシュします。これらの糞便内容は-80で廃棄または保存することができます 所望のように将来の分析のためにCを°。

腸嚢の調製

1. 試験化合物または分子の300μlの容量で1ミリリットル注射器を準備します。粘膜の完全性、FITCデキストランM.Wt.の1mg / ml溶液のための4,400を使用してもよいです。 4,400-70,000ダの大きさの範囲のプローブは、増加した感受性のために使用することができます。安全注射器の上に小さな動物の血管カテーテルにフィット。
2. メジャー5腸セグメントの開口部からセンチ、セグメントをネクタイはしっかりとこの時点で、縫合糸ループで閉じます。静かに腸の開口部の周囲に予め結んだ縫合糸ループを配置し、鈍化カテーテルを挿入します。腸のセグメントを確保するために、閉じた縄を引いてそして、すべての溶液が注入されることを確認して、腸にシリンジから300μlのボリュームをリリース。
3. 同時に腸嚢の閉鎖を確保​​するために、縫合糸縄を引きながらゆっくりカテーテルを削除します。腸からの緩い腸嚢をカットし、37に予熱酸素培地20mlを充填した50mlコニカルチューブの中に置きます °C。

透水4.測定

1. 37に設定された加熱水浴中で腸の嚢を含む場所コニカルチューブ °C。 0、30、60、90および120分の時点で、各インスタンスで新鮮な培地100μlでボリュームを交換し、円錐管および転送から96ウェルプレートに100μlのサンプルを取ります。
2. 最終的なサンプルが採取された後、粘膜表面を露出させ、縫合糸の時点で、セグメントの長さに沿って開いた嚢をカット。
3. 各腸のセグメントの長さと幅を測定します。指名打者の場合赤、スナップ-80セグメントと店を凍結 タンパク質または生化学的解析、あるいは、分子アッセイのためのRNA安定化溶液中の店のためのC°。
4. 1から1×10 ^-6の範囲内のFITCタグ化分子に対する対数希釈の標準曲線を構築します。
5. 蛍光プレートリーダー上のFITC用の測定試料および標準、FITCの励起/発光：/ 519 nmの495 nmの。

各個別の腸サックのための見かけ透水5.計算

1. 時間単位は秒に変換します。
2. 各時点について、累積濃度、Qを計算します
   
   Q _tの=（C _トンの * _Vrを）+（Q _tの_和 * V _s）は 、ここで：
   
   時刻tでのQ _トン =累積濃度
   Cの_T =時間tにおける濃度
   受信機側でのV _{R =}巻
   以前のすべてのQ _tのQ _tの_和 =合計
   V _S =ボリュームをサンプリング
   
3. プロット対時間Q（T）と傾きを計算：δQ/ΔT
4. 見かけの透過性を計算する（P _アプリ ）
   
   P _アプリ =（δQ/ΔT）/（*株）、場所：
   
   組織のA =エリア
   C ₀ =初期濃度

結果

このプロトコルは、胃腸疾患の動物モデルにおいて腸のバリア機能の地域の変化を調べるために使用することができます。胃腸管⁷の変化領域に粘膜表面を横切って傍細胞プローブの流量を測定することにより、上皮のタイトジャンクションの完全性を評価することができます。また、大きさ（ 図2）または疎水性（ 図3）、上皮摂動の程度、または粘液ゲル層の完全性を傍プローブの性質を変化させることによっても測定することができます。より大きな分子量マーカーを用いることが、このような経上皮電気抵抗（TEER）などの電気生理学的測定によって明らかではないかもしれない控えめな変化を、検出、粘膜の傍細胞透過性のより敏感な尋問は可能ですが、その傍細胞輸送を可能にするのに十分である（ 図2）。ムコサル炎症は杯細胞と正常に重なり、上皮インターフェースを保護する保護粘液ゲルの減少の損失につながる可能性があります。疎水性のプローブを用いて、腸の粘液ゲル層の完全性は、（ 図3）

ディスカッション

ここでは、粘膜バリア機能のex vivoで評価するために分離および腸嚢の調製を詳述しています。腸の嚢の調製物は、主に腸を横断候補薬物の吸収を調べ、薬学研究に利用されています。しかし、このアッセイは、腸疾患の研究のためにも同様に適しています。領域と透過性の部位特異的な評価によって大きく異なる場合があります腸の透過性は、消化器疾患における粘膜の整合性の地域の重要性をよりよく理解することができます。アッセイは堅牢であり、適切な生理学的条件の下で、孤立した組織は、最大6時間の死後のための実行可能なままです。安楽死に続いて、組織標本の速度が重要であり、腸は、その内容をフラッシュし、できるだけ迅速に含酸素媒体に転写されるべきです。動物間の一貫性を確保するためには、適切な腸の領域がidentifiであることが不可欠ですED（ 図1）。十二指腸と空腸のセグメントは胃から測定されながら、結腸と回腸セグメントは、盲腸から測定されることをお勧めします。異なる株、モデルやトランスジェニック動物が大きくなる可能性があるため、より長いGITSを持っている、それは透過性アッセイに従事する前に、モデル内の平均長または...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
デカンテル 非吸収性シルク縫合糸	Braintree Scientific	SUT-S 116
Media 199 (TC199)	Life Technologies	11043-023	蛍光を阻害するため、フェノールレッドはありません
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Life Technologies	21063-045	これは蛍光を妨害するため、フェノールレッドはありません
N-アセチルシステイン	Sigma Aldrich		メディアで10 mMで使用
小動物血管キャサテル: Physiocath	Data Sciences International	277-1-002
FITC-デキストラン 4,400 MW	Sigma アルドリッチ	FD-4
FITC-デキストラン 20,000 MW	シグマ アルドリッチ	FD-20
FITC-デキストラン 70,000 MW	シグマ アルドリッチ	FD-70