運動の時空間マッピングで<em&gt;エクスビボ</em腸の&gt;準備

サマリー

最近利用可能なビデオ録画と時空間マッピング(STmap)技術により、腸の運動性の伝播パターンと混合パターンの両方を視覚化し、定量化することが可能になりました。このプロトコルの目的は、GastroIntestinal Motility Monitoring(GIMM)システムを使用したSTmapsの生成と分析を説明することです。

要約

記録筋緊張の変化、腔内圧力、および膜電位：複数のアプローチを含めた消化管運動を記録し、評価するために使用されてきました。これらのアプローチのすべてが、その後、全体的な運動パターンの感覚を提供するために解釈され、同時に腸に沿って一又は複数の位置で活性の測定に依存しています。近年、録画時空間マッピング（STMAP）技術の発展により、観察し、結腸および腸の ex vivo全セグメントで複雑 ​​なパターンを分析するために行きました。一度記録され、デジタル化され、ビデオ記録は管腔直径はグレースケールまたはカラーに変換するSTmaps [呼ばれる直径マップ（Dmaps）]に変換することができます。 STmapsは、運動方向（ すなわち、静止し、蠕動、逆蠕動）、速度、期間、頻度及び収縮運動パターンの強度に関するデータを提供することができます。このアプローチの利点は次のとおりです。analysiを相互作用または同じセグメントの異なる領域で異なる運動パターンの同時開発のSは、運動パターンの可視化は、時間の経過とともに変化し、他の地域の一つの領域に影響を与える活動でどのように活性の分析。別個STmapsおよび運動性パターンをより詳細に分析することができるように、ビデオ記録は、異なる時間スケールおよび分析パラメータを用いて再生することができます。このプロトコルは、特に運動の生成に影響腔内流体の膨張と腔内刺激の効果を詳細に説明します。管腔受容体アゴニストおよびアンタゴニストの使用が開始され、1つのパターンを他のパターンに変換することができる方法を方法の特定パターンに関する機構的情報を提供します。技術のみ腔内圧力変化または筋肉の緊張のデータを提供することなく、管腔直径の変化を引き起こし、そして実験に基づいて、成果物を生成することによって運動を測定する能力によって制限されます。ただし、analysi方法は、これらの問題を考慮することができます。従来の技術と比較すると、ビデオ録画とSTMAPのアプローチは、消化管運動をより包括的に理解を提供します。

概要

腸の運動性を記録し、分析する様々な方法は、過去150年¹にわたって開発されてきました。これらは、最初のin vivoでの観察と説明ウィリアム・ボーモントのウォルターキャノンの測定と筋肉の緊張のマルチサイト記録の解釈のより最近の方法に、管腔内圧力、および/ ​​または膜電位（ すなわち、接合部電位^）2の範囲であってきました^{- 6。}これらの後者のアプローチは、全体的な運動パターンのスナップショットを提供するが、記録部位間での領域に記録部位の数とデータの補間の有効性によって制限されます。

録画時空間マッピング（STMAP）の最近の開発技術は、それが可能なコロンと腸のex vivoでの全セグメントにおいて、複雑な運動パターンを観察し、分析するために行きました。最初intesについて記述初期のアプローチ、1990年代後半^7,8でtinalセグメントは、ビデオ録画を分析するために研究者・設計されたソフトウェアに依存します。 ^{12 -}いくつかのグループは現在、この目的の^2,8のソフトウェアを作成または変更しました。多くのグループが独自のソフトウェアパッケージやプラグインを生成したが、それらすべては、組織セグメントの直径を分析し、グレースケール表現にそれらの種々の直径を変換します。市販の記録及び分析システムは消化管運動モニタリングシステム（GIMM）モルモット遠位結腸¹³と同様に推進し、混合運動性パターンの解析で糞便ペレット速度決意を経由して推進運動性の両方の分析を可能にするターンキー・アプローチを提供すると呼ばれます^{19 -}無傷の腸セグメント^4,5,14内の流体刺激と。この後者のアプローチはSTmapsの生成および分析に依存し、本論文で説明されています。この方法の目的は、Tを増加させることです彼は能力定性的および定量腸内に存在する様々な運動パターンを分析します。他のグループが独自のソフトウェアを介して運動性分析のためにSTMAPを使用しているが、これはSTmapsの生成により運動パターンを分析するためにGIMMを使用する方法の最初の記述です。組織径の変化を検出する能力、STmapsの作成を最大化するためにビデオ録画、録画パラメータを適切に設定するための腸組織の準備だけでなく、本論文では、詳細なステップバイステップの手順を提供GIMMシステムとImageJソフトウェアを使用してSTmapsの解釈と分析。

ここで説明する方法は、流体または腸運動パターンに影響を与える化合物を含有する半固体の管腔内灌流の分析に固有のものです。糞便ペレット推進の分析のための方法はMaweと同僚¹³による論文に記載されています。ここで説明する一般的な方法が考えられます以下のような他の管状の平滑筋臓器に適用：独自に、この方法は、圧力や筋肉の緊張の変化に関するデータを提供していませんが、小腸、血管、尿道、尿管など 、圧力を使用して結合することができますいくつかの他のグループは^{、2,15,20,21を示している}ように運動パターンのより完全な画像を提供するために、トランスデューサ、力変換器や電気生理学的測定。

プロトコル

バージニアコモンウェルス大学の施設内動物管理使用委員会（IACUC）は、このプロトコルで使用されるすべての動物や安楽死の手順を承認しました。

ソリューションの調製

1. （：118のNaCl、4.75のKCl、1.19 KH ₂ PO _{4、1.2 硫酸}マグネシウム、2.54のCaCl _2、25のNaHCO _3、11グルコース[mMの中]で構成）クレブス緩衝液4リットルを準備します。 、各固体化学物質の適切な量を計量し、脱イオン水の適切な量に入れ、溶液が透明になるまでボルテックスを用いて混ぜます。
2. 37℃に加熱しながら、30分間carboxygenの溶液（95％O _{2、5％CO 2）を}通気。
3. HClを用いて、必要に応じて、37℃（器官槽と同じ温度）でpHを7.4に調整しながら、溶液のpHを決定します。実験期間を通してクレブス緩衝液を連続的carboxygenated、37℃で保管してください。
4. 入れバッファ容器への蠕動ポンプからの流入と流出管とチューブとオルガンバスシステム全体のバッファの灌流を開始するために蠕動ポンプをオンにします。
   注：バッファが最初に潅流バッファに器官浴や化学物質へのいずれかの組織の追加まで、元の容器に戻し圧送することができます。これは、実験のために必要なバッファの総量を減らすことができます。入って来ると発信バッファが混在しないように、そして、発信バッファ灌流ラインが空の容器の中に配置する必要があります。
5. 器官浴内のバッファになり、実験の期間中、37.0±0.5°Cのままであるように風呂サーキュレータに加熱システムの温度を調整します。確認し、必要に応じて、少なくとももう1つの時間ステップ2.8で浴に組織セグメントを配置する前に、クレブス緩衝液のpHを変更します。

組織の調製

1. 安楽死させます密閉されたチャンバー内の二酸化炭素吸入/窒息またはローカル動物のケアと使用委員会によって承認された別の安楽死法を用いてモルモット。
2. 動物の安楽死を確認した後、解剖ハサミで縦方向に腹壁を開き、腸を探しカット。盲腸を露出させる助けるために小腸に添付腸間膜をカットします。
   注：動物のケアと使用委員会によって承認された安楽死を確認するためには、二国間の開胸術などの二次の手順を実行します。
3. 盲腸の先端を見つけ、盲腸との接続にちょうど遠位近位結腸を横断。そして、最初の切断に近接結腸再び~8センチ先端を横断。
4. さらに解剖のために（セクション1に記載）温め、carboxygenatedクレブス液に結腸組織を置きます。解剖浴にコロンをピンとできるだけ多くの腸間膜脂肪を除去するために、はさみの小さいセットを使用します。
5. 時間でeated解剖トレイ、平滑末端のカテーテルに連結された注射器を用いて内腔を通ってクレブス緩衝液の優しく灌流により、すべての管腔内コンテンツを削除する（組織の穿孔を防ぐため）。この灌流プロセス中にセグメントの過膨張は避けてください。
6. 2火災研磨ガラス管のカテーテル（3 mmの直径）を入手し、組織内腔に入るガラス管の部分の周りにポリエチレンチューブの短い断片（〜3 mmの長さと〜3 mmの直径）を配置します。
   注：これは、縫合糸は安全なままに組織し、ガラス管の周りに配置され、準備が臓器浴にし、組織の長さの変化の間に置かれているように滑らないことを可能にします。
7. 組織標本の経口最後に1つのカテーテルを挿入し、外科医の結び目を使用してカテーテルを囲むチューブの小片を中心に縫合糸を結びます。ゆっくり結び目がぴったりであることを確認するために戻って出てカテーテルを引くしようとします。その後、他のカテーテル入るトンで同じアクションを実行します彼は、組織の終わりを尾方。
8. カテーテルが固定されると、器官槽のいずれかに解剖トレイから製剤全体（組織プラスカテーテル）を移動。ユーザから離れて直面している経口端に浴に準備を置きます。
9. 次に2を示唆のいずれかの方法で器官槽にガラス管のカテーテルを固定/マウント。
   注：ガラス管は実験中に長さを変更したり、浴中のクレブス緩衝液の表面レベルの上に来てからの組織セグメントを防ぐセキュリティ保護。
   1. オプションA：成形機の粘土やプラスチックのクリップを使用することによりプラスチック臓器槽の側面の上部にガラス管の上部を固定します。
   2. オプションB：プラスチッククリップを使用することにより、臓器浴剤の上にカメラを保持する金属極にガラス管を固定します。
10. カテーテルは風呂に固定されると、各カテーテルの開放端にチューブの5 cmの作品を添付します。経口猫のためのheterは、近位結腸セグメントの内腔にバッファを注入するために使用される10-mlシリンジ、このチューブを取り付けます。尾方カテーテルは、チューブのこの作品は、管腔の流出が回収容器（50ミリリットルのビーカー、貯水池など ）に向けられるようになります。
11. 経口端部に取り付けられた注射器を使用して、ゆっくりとフラッシュは、組織を通って流れることができる液体を確実にするために、組織内腔を通してクレブス緩衝液を加温しました。フローは、尾方カテーテルから出る液体によって確認されます。組織を30分間平衡化しながら、録画システム（プロトコルセクション3）を調整します。

ビデオ記録システムの3キャリブレーション

1. 明るさとコントラスト、およびソフトウェアを使用して水平方向の距離をカメラの高さの配置、ビデオ設定を較正します。
   注：腔内灌流のセットアップに最適な設定は、ペレット推進¹³の速度を決定するために使用される設定とは異なります。
2. CLIカメラのための実験のタブのCKを校正​​します。そして、「ファイル」メニューの「キャリブレーションを]をクリックします。
3. ビデオは「キャリブレーションワークステーションのウィンドウに表示されたら、画像が結腸内腔に挿入されたカテーテルの先端を含んでいる高さにカメラを設定します。
4. 次に、それぞれのバスに接続されている半透明の定規ステッカーを使用して、画像で見て水平方向の距離を調整します。
   注：このキャリブレーションは、管腔直径と収縮波の速度の後のソフトウェアの計算に不可欠です。
5. 彼らはカメラ画像における支配者によると10ミリメートル離れているように、同じ「校正ワークステーションのウィンドウで、赤い垂直のガイドラインを設定します。次に、「距離カーソル」ウィンドウに適切な距離（10ミリメートル）を入力し、「CAL」ボタンをクリックします。
6. 次に、利得、明るさ、およびそのようにカメラ画像を変更するために「較正ワークステーション」ウィンドウ内でスライダをシャッターを調整します組織セグメントは、明るい背景に暗いシルエットとして表示されます。
   メモ ：図4は、このキャリブレーション手順の良い面と悪い例を示します。
7. 画像を適切に調整するには、また、カメラ自体にフォーカスや絞りのつまみを調整します。
8. キャリブレーションが完了しました。 [保存]をクリックし、ポップアップで「OK」をクリックし、最後に「終了」ボタンをクリックします。

4.一般的な実験手順

1. カメラキャリブレーション手順と組織の平衡の30分が完了した後、各実験プロトコルで裁判に名前を付けます。トライアル名を名前と化合物と液体の体積の濃度に基づいてすることができる管腔内実験の部分の間に組織セグメントに灌流されます。
2. その後、チューブのクランプを使用することにより尾方カテーテルから突出したチューブを閉塞。
   注：これは、府中尾方端から出るの管腔内の液体を防ぎますrther実験、膨満の様々なレベルを誘発するためにルーメン内の特定のボリュームの使用を可能にする（ 図1）。
3. モルモットex vivoでの準備の推進収縮を開始するのに十分な膨張を提供するために、近位結腸内腔に約0.7ミリリットルクレブス緩衝液のを注入。
   注： - 無傷のセグメントおよび器官槽内のセグメントに適用されるストレッチの量の全体の長さに応じて（0.2ミリリットル0.1）このボリュームは若干異なる場合があります。
4. セグメントは管腔の流体によって膨張されると、カメラの電源をオンにして、時間の予め決められた期間（ 例えば、10分）のための運動を記録します。
   1. 具体的には、実験的なカメラビューを開き、カメラのフィールドを表示するには、 "ON"の位置にトグルスイッチをクリックし適切な名前トライアルをダブルクリックします。そして、記録を開始するために、録音ボタンをクリックします（カメラが記録している間に録画ボタンが赤のままになります）AND録音を停止するには、もう一度録音ボタンをクリックします。
5. この初期制御膨満試験の終了時に、緩め/組織セグメントは、内腔の外に膨らませる液体を推進できるように、尾方カテーテルを閉塞するクランプを取り外します。
6. 10分間の再平衡期間の後、セグメント（ 例えば、短鎖脂肪酸またはデカンの推進運動性を変更するために管腔の流体中の栄養素、生物活性剤、薬剤、またはアゴニスト/アンタゴニストの種々のでこの手順を繰り返し酸^）10,18。
   1. バブルの進行結腸内腔への新たなソリューションの灌流時にユーザが時実験流体を知ることができるようになりますように、新しい実験的な流体は、結腸セグメントに入ったときにゲージを支援するために、注射器の港の近くに気泡を残します内腔に達しています。
   2. バブルはを完全に押されたまで開い尾方カテーテルを用いて管腔内灌流を続行管腔潅流システム（灌流液2〜3mlのが必要な場合があります）。その後、組織セグメントが最大5分間開いた尾方カテーテルを通して流体を排出することができます。
      注：この手順の後、内腔は内腔に液体の既知の体積の灌流を可能にすること、流体の無視できる量が含まれています。
7. シリンジを介して制御条件のように流体を膨らませるのと同じ量を注入する（ステップ4.3のように）、チューブクランプを使用して、尾方管腔カテーテルチューブを再閉塞。後で分析と（ステップ4.5のように）制御クレブス条件との比較のために実験期間中の運動パターンを記録します。
8. 繰り返しセクション4.4 - 異なる管腔の化合物または同じ管腔化合物の濃度の異なるプロトコルの4.7。

5.時空間マップの構築（STmaps）

1. 実験の記録が完了した後、分析風を開くために、特定の試験の名前をダブルクリックしますOW STMAPの建設のため。
2. ビデオ再生エリア内では、分析のための画像が適切にするために、分析ウィンドウでコントラストと明るさスライダを調整し（明るい背景に黒い組織シルエット; 図4）。
   注：カメラキャリブレーションは、画像のみ、この時点ではより少ない程度に変更することができ、実験を開始する前に、適切に行われなかった場合。
3. 画像が適切に対比されると、分析のための組織領域を分離し、成果物を含む領域を削除するには、ビデオ画像のウィンドウ内で水平方向と垂直方向の赤のガイドラインを設定します。また、開始を決定することによって、記録から適切な時間セグメントを選択し、分析のための時点を停止します。
   1. 具体的には、解析ソフトの中に緑色の「A」、黄色の「B」ボタンを使用して、ビデオ内の開始点と終了点を選択します。分析するためにビデオセグメントの先頭にタイムスライダを設定し、nは緑の ''ボタンをクリックします。その後、分析し、黄色の「B」ボタンをクリックするセグメントの最後にスライダーを設定します。
4. 次に、STMAPウィンドウを開き、「ストップウォッチ」ボタンをクリックして「モータ分析]タブをクリックします。ストップウォッチをクリックした後、次のSTMAP生成を開始するために記録された映画の中の組織の黒いシルエットの中に十字線カーソルをクリックします。
5. 組織シルエットで十字線をクリックすると、ソフトウェアが生成し、ビデオのその地域のSTMAPが表示されます。
   注：これは、分析のために選択したビデオの長さに応じて数分かかることがあります。
6. 画像を調整するSTMAPとコントロールの拡大画像を表示する「ズーム」をクリックします。
   1. 代わりにグレースケールの色としてSTMAPを表示するには、新しく作成されたウィンドウ内の「色」オプションをクリックします。また、マップやV内の特定のピクセルにカーソルを置くことができるように「有効にする」オプションをクリックしますその特定の組織領域のための管腔直径の変化の追跡IEW。完了したら、[終了]をクリックします。
7. 論文やプレゼンテーションに使用するためにSTMAPをエクスポートまたはその後「メタファイルを ''データのエクスポート」を選択し、続いて「ファイル」メニューを選択することで、ImageJの中でさらに分析すること。その後の.emfファイルとして保存されますSTMAPを、名前を付け、「保存」ボタンをクリックします。
8. 代わりに、スクリーンショットをキャプチャすることにより、STMAPの画像を保存します。これは、STMAPの擬似カラーバージョンを保存することが必要です。

STmapsで収縮波速度の6分析

1. 収縮の伝播や収縮持続時間の速度を分析するために、最初.TIFF、.GIF、.JPG、または任意のファイル変換プログラムを通じてImageJのに受け入れられるの.bmpフォーマットにSTMAPの.emfファイルに変換します。
   注：ImageJのソフトウェアからSTmapsのの.emf形式の出力を開きません。
   1. Alternativエリー、画面上のSTMAPの写真を取り、適切なファイル形式で保存するためにスクリーンショットのキャプチャソフトウェアを使用しています。
2. その後、ImageJの中に再フォーマットされたSTMAPを開き、「プラグイン」メニューと選択」GIMMProcessorを開いてGIMMProcessorプラグインを開きGIMMProcessor」と「測定値表」の窓」。これは、両方を開きます」。
3. ImageJのウィンドウ内で「長方形選択ツール」をクリックし、STMAPの右上隅にあるスケールバーの全領域をクリックしてドラッグすることで概要を説明するために使用します。その領域を選択した後、プラグインで「セットのキャリブレーション」ボタンをクリックします。最後に、スケールバー上の値に応じて、キャリブレーションボックスに適切な距離（mm）でと時間（秒）を挿入し、「完了」をクリックします。
4. 次に、ImageJのウィンドウでライン描画ツールをクリックします。目の角に沿って伝播する収縮の中心を通ってSTMAPに線を引きますクリックしてSTMAP画像上にドラッグすることで、電子スロープ。代わりに、収縮持続時間を決定するために、非伝播収縮のバンドを通して垂直線を描画します。
5. 行は（唯一の行が一度に描画される場合があります）適切に描画された後、水平距離、垂直距離、及び直線の傾きの読み出しを生成するプラグインで「測定を行う」ボタンをクリックします。それぞれ長さ（mm）、時間（秒）、速度（mm /秒）に対応します。このデータは、「測定値を表」ウィンドウに表示されています。
6. 線画を繰り返し、分析は、与えられたSTMAP内で複数回のステップと.gmdファイルとしてデータを保存します。プラグインで「保存」ボタンをクリックし、ファイルに名前を付けます。次に、プロセスを完了するために、再度「保存」をクリックします。これらのデータは、後に他の試験データまたはSTMAPで使用するために再描画線と比較することができます。

結果

直径マップなどの理解時空間マップ（STmaps）（Dmaps）

この技術によって生成されたマップは時空間であるが、組織の管腔直径の変化は、具体的には、距離と時間の両方で可視化パラメータです。 STMAPは、下部にトップと終了時には開始時間と（秒単位）、y軸上の水平（mm単位）、x軸上の組織セグメントに沿った距離と時間を描いています。右上には、xとy軸（ 図1-4）の両方のスケーリングと同様、最小値と最大管腔直径を表示伝説、です。このように、グレースケール画像内の異なるピクセル色合いが異なる管腔の直径に対応しています。暗いピクセルは、より広い直径に対応し、明るいピクセルは、より小さな直径に対応しています。このように、円形の筋肉の収縮波が（による管腔直径の減少により明るいピクセル化の領域として表示されます。 図1黒矢印）。これとは対照的に、原因円形筋弛緩または流体の大きな塊に管腔膨満はSTMAP / DMAP（ 図1C白矢印）での管腔直径の増加と暗いピクセルの原因となります。 STmapsの形成と意味のさらなる議論は、ラマース^群 11によって、紙に記載されています。

腔膨満誘発伝播収縮

図1では 、モルモット近位結腸は、各ボリュームで5分間クレブス緩衝液の0.5、1.0、1.5、および2.0 mlを膨張させました。伝播収縮が≥1.0すべてのボリュームによってミリリットル誘発し、STMAP（ 図1）のように薄い白いバンドを表示させました。腸管腔の膨満が伝播する収縮の開始を引き起こします。 図1に示すように 、より大きな管腔内容積を有する内腔の直径が大きくなるとSTMAPの画素その直径に対応する総合的な暗い背景を作成暗くなります。膨満のいくつかのレベル蠕動反射が活性化された（1.0ミリリットル;図1）では、内腔の直径を小さく経口最後に収縮の推進波を開始し、セグメントの肛門の端に向かって移動（白いバンドとして示されます図1及び図 4）。収縮を表すホワイトバンドは、多くの場合、先に蠕動波（ 図1C白矢印）の尾方緩和を表し、暗いバンド、先行します。これらの白と暗いピクセルは、昇順の収縮に対応しており、それぞれ蠕動反射^、22,23の緩和要素を降順。 STMAP 図1のパネルAでは、0.0ミリリットルで0推進波、0.5ミリリットル膨満で0推進波、1.0ミリリットル膨満で3推進波、1.5ミリリットル膨満で6推進波、および5推進波aがありますトン2.0ミリリットル膨満。

栄養誘発文房具/ミキシング収縮

収縮を伝播する波がSTmapsによって可視化することができる唯一の​​運動パターンではありません。そのような分割として運動の混合パターンもSTmapsと対応する画像（ 図2A）に見ることができます。このパターンは、収縮を伝播とは異なります。混合パターンの間に多くの小、静止収縮が同時に（同じ水平線内の複数の小さな白い四角として可視化するが、お互いに接触していない）で異なる領域で起こります。各分節収縮が静止しており、伝播する収縮のために説明したように肛門的に口頭で移動しませんが、長い期間にわたって複雑な収縮パターンを説明するためのSTmapsの能力は、（ 図2A肛門時間をかけて収縮の進行を遅らせるの可視化を可能に黒い矢印）。の期間各個々の収縮はまた、ImageJのプラグインと関連した（ 図2A）を使用して、白色収縮正方形を通して垂直線を引くことによって決定することができます。短鎖脂肪酸の結腸内灌流から生成され、この特定のSTMAPでは、平均固定収縮時間は約2秒（1.9〜2.1秒の範囲）です。組織セグメント上に残っている腸間膜分析にアーチファクトを引き起こすことができるが、腸間膜（ 図1B、2B）によって生成された縦線アーチファクトは、縦筋の動きを決定するために用いることができます。 図1B および図2Bに黒い縦線の水平移動は、収縮および縦走筋の弛緩によるものです。縦筋のこの横方向の動きは、（ 図1B、2B）腸間膜アーチファクトによって発生する垂直帯の水平移動としてSTmapsに可視化することができます。

ImageJのとPlugiSTmapsのn分析

両方の伝搬波（ 図3）と同様に収縮の持続時間（ 図2）の速度は、ImageJのとGIMMProcessorプラグインを使用することによって決定することができます。 （：0.21 0.35ミリメートル/秒の範囲） 図3に 、直立歩行のと逆行性の両方の波の伝搬速度は〜0.25ミリメートル/秒でした。 STマップ上のビデオ画像に見られるように、分析線（映像上にボックスを形成する赤線）は、組織セグメントの一方の端部の周りの代わりに、セグメント全体の周りに正確に設定されました。これは、ソフトウェアのガイドラインの重要な用途です。これらのガイドラインの正確な設定は、さらなる議論のセクションで分析したビデオの適切な分析に不可欠です。これは、筋原リップル収縮^{24を可視化} STMAPを生成することができます。これらの収縮は、原点で筋原性であり、非常に管腔直径を変更しないでください。また、別のディレクトリリップルのために共通している伝播ections（直立歩行のまたは逆行）は、（ 図3）は、この技術を用いて分析することができます。 図2に示すように、収縮の持続時間は、組織セグメントの異なる領域で変化させることができます。

STmapsの適切な分析

STmapsの創造の一つの潜在的な問題は、実験方法に可能なアーティファクトの生成です。例えば、組織の外側に残って腸間膜はSTMAP（ 図1、図2（b））の垂直黒い線を作成する組織のそのセグメントの直径測定値を増加します。腸間膜の存在はまた、人工的にスケールのコントラスト測定の鈍化をもたらす最も広い腔の測定を、増加させることによって、グレースケールマップを広げます。このためには、組織を穿孔することなく、セグメントからできるだけ完全に腸間膜を除去することをお勧めします。アン他の可能STMAPアーチファクトが原因で、黒（ 図4B）と対比することができません腔液内の気泡に白い縦線です。これらの気泡は、管腔直径が解析ソフトウェアに小さく表示またはSTMAPで運動パターンに光/白領域をオーバーレイすることがあります。そのため、分析の前に組織セグメントとビデオ録画の適切な明暗の設定がSTmapsの構築に成功した（ 図4）に絶対的に重要です。適切および不適切な対照的なセットアップは、図4に示されている。これは、実験前のカメラキャリブレーションとポスト実験解析ウィンドウの両方が適切なSTMAPの生成と解析に不可欠であるにその映像調整を注意することが重要です。不適切な画像のキャリブレーションは使用できないデータ（ 図4A）とSTmapsにつながることができます。

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近位結腸に伝搬波1.図。 （A）（モルモット近位結腸で行わ）膨満-応答曲線は、このセグメント（白水平バンド）に波を伝播開始するために、適切な管腔内の流体の体積を決定するために使用しました。黒い矢印は、完全長の伝搬波の例を示します。白矢印は、不完全な腸間膜の除去に起因するラインアーティファクト。（B）パネルAと同様の実験からSTMAP生成することによって達成収縮を伝播の拡大図が、より短い持続時間のビデオを説明します。これは、収縮が肛門方向に口頭で進行し、このマップは、また腸間膜の成果物の別のビューを提供するパネルAに比べて先にホワイトバンドの暗い領域として表さ前の尾方リラクゼーションを識別することに注意することは容易です。赤いボックスは、このパネルには、さらに近くビューOを示し、このSTMAPの領域はパネルC.（C）で展開を識別する同じビデオFとBの白矢印は伝搬波に流体尾方により管腔の膨張に起因している暗い画素に「流体膨満」ポイントをラベルパネルのようにマップされます。これらは、円形の筋肉の弛緩は、円形の筋収縮に尾方起こる領域です。伝播収縮が原因で、マップの長いタイムスケールにパネルAにおいて完全に水平線のように見えることに注意してください。収縮波が測定され、波の移動速度として報告することができるスロープを有するように、パネルBおよびCでは、時間スケールが徐々に短くなっている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

STMAPによって収縮時間の2決意図。 （A）モルモットの近位大腸SH短鎖脂肪酸（酪酸）の管腔内灌流に応答して、混合/分節運動パターンOWS。縦の赤い線は、Image JとGIMMProcessorプラグインを使用して収縮持続時間を決定するために収縮の期間を通して描かれています。黒い矢印は、静止収縮の伝播の尾方方向を示している。（B）マウス回腸内を伝播する収縮は、多くの場合、持続的な収縮の領域を示しています。垂直の矢印は、より多くの口腔領域がより長い期間のために契約したまま、このマップのショーに描かれました。この調製では、準備の肛門の端は、組織の収縮時にクローズドシステムを残してから流体を防ぐために閉鎖されました。パネルの上部にある画像は、全体の肛門の端部が流体（STMAPに黒）によって膨張している間に組織全体の経口端は、（STMAPに白）収縮する時間を示しています。パネルB STMAPの真ん中に黒い縦の横方向/水平方向の動きがの動きを示しています縦筋層。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図3.双方向運動パターン。伝播する波は、方向（経口肛門）（肛門に経口）と逆行両方直立歩行の中に移動することができます。黒の実線の矢印は、通常の直立歩行の伝播を示し、破線の黒い矢印は、逆行性伝播を示します。このSTMAPで直立歩行のと逆行収縮の両方の伝播速度は、ImageJの分析によって決定され、〜0.25ミリメートル/秒でした。画像解析ライン（STMAP上記ビデオ画像上のボックスを形成する赤線）は、多くの場合、直立歩行のに向いて低振幅である筋原リップル収縮、浅い収縮を可視化するために近くの組織の一方の端に設定された、Retrograde、または両方の方向は、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

STMAP世代のための適切な画像コントラストの4重要性を図。パネルBは、適切に対比画像とSTMAPを示している（A）は 、不適切に対比画像とSTMAPを示しています。 （A）は 、適切に対比画像（B）から発生する水平白いバンドは、明らかではなく、原因グレースケールであること最初の画像に複数のアーティファクト（ホワイトシェーディング）があります。 STMAPでグレースケールの白シェーディングアーティファクトが消え正しく対比画像（B）から生成され、伝播する波はより顕著です。また、黒の濃淡が緩和ああを表します伝播する収縮波のEADは、収縮の各波とSTMAPの肛門最後に見ることができます。パネルBでは白矢印は、適切に対比することができなかった画像の領域で生成されたSTMAPアーティファクトを示しています。このタイプのアーティファクトは、時折実験プロトコルの過程で準備で発生した気泡管腔内に、主に起因している。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

ディスカッション

腸運動は、記録されたパラメータの性質に基づいて、視点の数から見て説明してきました。ビデオ録画と時空間マッピングは、セグメントに沿った特定のポイントで腸の長いセグメントにわたる全体的な動きおよび/または推進の分析だけでなく、活性の分析を可能にする貴重なツールであることが分かっています。録画時空間マッピングに取られたアプローチは二つあること、検査部位の反射および管腔内容の性質であることができます。コンテンツは、より半固体である場合管腔内容物はより液体および近位結腸である腸セグメントにおいて、活性は、ボーラスまたは注入による流体の管腔内導入によって誘導されます。これらのビデオ記録から作られた時空間マップは、上述したように、全体のセグメントの動きを表現するように設計されています。これとは対照的に、内容がより固体である遠位結腸に半ばに、活動は糞便PELLEを挿入することにより開始されますトン（エポキシは自然ペレットまたは人工ペレットを被覆した）と時空間マップはホフマンらのJOVEの記事に示すように、コロンを通ってペレットの動きを反映するように設計されている^。13。このように、実験と解析の設定が重要であると研究されて刺激し、地域のタイプに依存します。したがって、流体誘発性腸運動の時空間マップの生成と分析のための重要なステップは、次のとおりです。解剖組織からの腸間膜の1）適切な除去; 2）記録前の適切な画像校正。 STMAPの生成と分析の間のアーティファクトの3）適切な除去; 4）分析システムの適切なセットアップ。及び5）カテーテルを挿入し、それらを損傷することなく、セグメントを縫合するための手先の器用さを増し。

管腔直径のSTmapsの使用は腸の領域にわたって完全な運動パターンを視覚化し、分析する能力を向上させているがと組み合わせると、技術が使用されている最高の圧力や筋肉の収縮^2,15,20の機能測定。例えば、いくつかの筋肉の収縮がわずかに管腔直径を変更し、いくつかのSTmaps（ すなわち、筋原リップル）上に表示され、彼らが実際に腸の内容物²⁵の任意の推進や混合を引き起こさないことがあります。これは、他の機能の測定値にこの技術のカップリングなしに知ることができません。また、（ポンプシステムによって、すなわち、閉じた管腔システムまたは一定腔灌流）このタイプのシステムの多くの組織調製物の性質はSTmaps内のアーチファクトにつながります。これにより、ユーザは、その特定の臓器の準備と実験が起因する組織の無力にデータとデータ分析では、これらのアーチファクトを回避または除外する方法でアーティファクト（例えば、腸間膜に誘発される垂直線や暗いピクセル化につながることができる方法を知っていなければなりません）閉じた管腔準備でシステムから流体を排出します。管腔灌流のための複数の方法があります。クローズドシステムに加えて、腸のセグメントをタクト。一つの方法は、代わりに調製^8-10,30の肛門端に上昇管および/ ​​または一方向弁を使用することによって一定の管腔内/背圧を維持する開放系を使用することです。これは、流体が推進収縮時に準備の外に移動することができます。

システムは管腔直径の変化を検出するために、主にセットアップされているように、非常に管腔直径に影響を与えないもの収縮や運動パターンは、多くの場合、このプロトコルによって可視化することは困難です。 STMAP内のピクセルシェーディングの変化は管腔直径の変化に基づいているため、強力な収縮も同じ記録内に存在している場合、直径の大きな変化を生じない運動パターンは、この方法でうまく可視化されることはありません。近いトンの録画で分析線を設定し、リップル型の収縮（ 図3）の可視化および解析のために記載したようO組織壁は、この問題を回避することができます。最小限にしか組織径を変更収縮を可視化することができるように、この方法は、STMAP内に表示される最大直径を減少させます。この問題を解決するための別のオプションは、小さい収縮がより容易に可視化されるように大きく、管腔の直径に影響を与える収縮を排除するために、分析されたビデオセグメントの継続時間を変更しています。これは、最小限の収縮が大きく管腔直径を変えた個別のSTMAPに似て探して管腔直径が変化する運動性の潜在的な問題につながります。地図上の白画素の決意は、所与のビデオ内の最小直径に基づいているからです。ビデオ内の直径がはるかに変動（円筋肉のほとんど、あるいは全く収縮）が存在しない場合は非常に準備の直径を変更しない、非常に小さい収縮は別のビデオから蠕動収縮に似て見ることができます。したがって、図を考慮することが重要ですマップの右上の伝説。最大値と最小直径の差が小さい場合には、それは、STMAPに示すように、画素の濃淡変化の妥当性を判断するために生成されたビデオにSTMAPを比較することが重要です。したがって、実際の記録と併せてスケールバーの検査では、マップの解釈を修正することが重要です。

^30、ラット^{7,9,30 - - 33、}モルモット^{5,6,8,13 -}ビデオ録画と腸および結腸セグメントの時空間マッピングは、ゼブラフィッシュ^26、マウス^25,27を含む様々な種に適用されている^{19、 24,30,32,34,35、brushtail}のポッサム^12,36、ウサギ^{2,30,37,38、}鶏^39、豚^40,41と人間^42。最も広く研究されている種モルモットです。これは、モルモット腸神経系のHので、驚くべきことではありません最も完全に特徴付けられて歴史的に、それはほとんどの腸⁴³の推進運動性に関して、in vitroでの研究動物されているよう。時空間マッピングは、主に小動物から腸の管状のセグメントに適用されています。ただし、変更されたシステムを使用して、ウサギおよびブタでの研究は、より大きな動物にこの方法論の適用を示しています。ウサギの場合、アプローチは、より大きなセグメントおよび器官槽^30を用いたこと以外は小さい動物のものと同一です。豚に使用されるアプローチは、臓器浴に解剖組織セグメントの麻酔したブタではなく、浸漬から腸の体外ループを使用することでした。また、STmapsは相互相関ではなく、ほとんどの研究⁴⁰で使用透照法により作製しました。録画時空間マッピングのため、単離され、灌流vascularlyループ調製物はまた、ラットのような小さい種に適用されています ^{33。 Kuizenga らによる最近の研究。ビデオのSTmapsの最初の使用は、ヒトの腸42 の ex vivoセグメントにおける運動パターンを記録しています。 STmappingアプローチは 、インビボ3,44 ヒトにおける圧力計（圧力）記録の分析に適用されている、にもかかわらず。ヒト組織における記録運動パターンは、同様の技術を使用して、すでに動物モデルで記録されたものと同様であり、ヒトの組織へのこのアプローチの拡張を検証します。これは、この研究は力変換器によって記録された筋収縮の測定にビデオ録画由来STmapsを組み合わせたことは注目に値します。 エキソビボセグメントに挿入された光ファイバーマノメーターカテーテルによって管腔内圧力の測定も管腔直径の変化よりも視覚化するためにSTMAPの多様性を示す、STMAPに変換しました。この組み合わせアプローチ相関筋肉の緊張は、管腔内圧力と壁の動きが可能にビデオ記録から生成STmapsのより詳細な機能解析のために。}

（もDmaps呼ばれる）壁の動きから生成STmapsおよび管腔直径の変化の研究は、このような推進蠕動波やローカライズされた分節性収縮などの運動パターンの詳細な説明を可能にしました。これらのパターンは、以前の実験方法によって同定されたが、現在のアプローチは、このような波紋と新規抗蠕動収縮^{9,24,25,30,31,42}などのローカライズされた収縮の動きをより洗練された定義を可能にします。 STmapsと運動パターンの変化の分析の建設は、腸および大腸の消化管運動における重要な問題に適用されています。これらには、神経性および筋原性収縮の分化とカハール^{6,9,11,12,16,24,26,27,29}の間質細胞の役割の定義^{- 31,33,37を - 40,42を} 、複合体を理解します様々な運動パターンの管腔内栄養素^10,18,19の効果調べる円形と縦走筋層^{2,7,8,11,12,32,39,40}の間の相互作用、微生物株^34、及び粘度^{12,36、 7,9,10,13 - -}世代の^17,28,35,40および運動性の修正と様々な内因性の神経ホルモン剤、及び^2,4-外因性薬剤の役割を理解します。この技術の将来は、圧力、電気生理学と緊張/収縮などの他の測定値とそれをカップリングさせることを含みます。最近の研究は、多くの場合、追加の相関の詳細^{2,42を提供する}映像記録時空間マッピングと併せて、これらの測定値の一つ以上が組み込まれています。また、システムは、他の管状および非管状の器官で運動性を測定することができます。例えば、試みが使用して胃の運動を測定で行われていますこのようなシステムが、技術およびソフトウェアは、より良い、そのような非管状器官⁴⁵に運動性を定量化するために洗練を必要としています。時空間マッピング技術だけではと分析のより伝統的な方法との組み合わせでの使用がより深い、将来的に消化管運動の包括的な理解につながることは間違いありません。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
塩化ナトリウム(NaCl)	Fisher	BP358	クレブス緩衝液用。
塩化カリウム(KCl)	Fisher	BP366	クレブス緩衝液用。
リン酸カリウム (KH2PO4)	Fisher	P285	ブス緩衝液用。
硫酸マグネシウム(MgSO4)	Sigma	M2643	クレブス緩衝液用。
塩化カルシウム(CaCl2)	Sigma	C7902	クレブス緩衝液用。
重炭酸ナトリウム(NaHCO3)	Fisher	BP328	クレブス緩衝液用。
グルコース	シグマ	G7021	ブス緩衝液用。
Carboxygen (95% O2/5% CO2)
解剖ピン
解剖トレイ/皿
ダンキン ハートレー モルモット	チャールズ川	051
ImageJ		http://imagej.nih.gov/ij/	オンラインで無料入手可能。
胃腸運動モニター(GIMM)	Catamount Inc.、セントオールバンズ、バーモント		以下の部品が含まれています。
蠕動ポンプ			はGIMMに含まれています。
GIMMに含まれる	バスカメラ
Bath TransIllumination			はGIMMに含まれています。
オルガンバス			GIMMに含まれています。
バックライト強度制御			GIMMに含まれています。
GIMM プロセッサ ImageJ プラグイン			GIMM に含まれています。
ポリエチレンチューブ			GIMMに含まれています。
GIMMに付属	チューブコネクタ
蠕動ポンプ			はGIMMに含まれています。
ヒーティングバス/ウォーターサーキュレーター			GIMMに含まれています。