バイオメディカル応用のための機械的に調整可能な生物活性金属スキャフォールドの作製

サマリー

生体活性で機械的に信頼性の高い金属足場は、多孔質Tiの製造のための動的凍結鋳造とTi足場のコーティングと緻密化の2つのプロセスからなる方法で製造されています。緻密化プロセスはシンプルで効果的であり、機能的に等級付けされた足場の製造に適用できます。

要約

バイオメタルシステムは、特に耐荷重材料として、生物医学的な用途に広く使用されてきました。しかし、大きな課題は、金属の高剛性と低生物活性です。本研究では、新しいタイプの生理活性で機械的に信頼性の高い多孔質金属足場-緻密多孔質Ti足場を作製するための新しい方法を開発しました。この方法は、1)動的凍結鋳造による多孔質Ti足場の作製、および2)多孔質足場のコーティングと緻密化の2つの製造プロセスで構成されています。多孔質Ti足場を作製する動的凍結鋳造法により、化学汚染と構造欠陥を最小限に抑えることにより、多孔質足場の緻密化が可能になりました。高密度化プロセスは、3つの理由で特徴的です。まず、緻密化プロセスは、1つのパラメータ(緻密化度)の制御のみを必要とするため、単純です。第二に、多孔質の足場から生体分子を機械的に強化し、持続的に放出するため、効果的です。第三に、緻密化中に空間的に変化するひずみによる機能的に傾斜した多孔質足場の製造にも適用できるため、幅広い用途があります。

概要

金属の生体材料が広く、それらの優れた機械的強度や弾力性^、1-3の耐荷重インプラント、内部固定デバイスとして使用されてきたが、それらは2つの重要な課題が伴う：1）機械的な不一致を金属は生体組織よりもはるかに硬いので、望ましくない損害を引き起こします周囲組織としばしばしばしば異物反応（例えば、炎症または血栓症）を引き起こす、生物学的組織と悪い界面をもたらす^。4-6多孔性金属足場は改善、構造において骨成長を促進するために提案されている2）低い生物活性に骨-インプラント接触応力遮蔽効果は、それらの低減剛性を抑制しつつ^7-9また、種々の表面改質は、金属インプラントの生物学的活性を増強するために適用されています。このような改変は、生物活性分子（ 例えば、成長 FACで金属表面を被覆含まター）または薬物 （例えば、バンコマイシン、テトラサイクリン^）。10-12しかし、このような多孔性金属足場の減少、機械的特性等の問題が、剛性が低下し、生物活性コーティング層の迅速な放出は未解決のまま^。13-16

具体的には、チタン（Ti）およびTi合金は、その優れた機械的特性、化学的安定性、および良好な生体適合性の中で最も人気のあるバイオメタルシステムの一つです^。13,17-19彼らの泡状のアプリケーションが3Dので、関心の高まりをもを集めています多孔質のネットワークは、骨様の機械的特性に加えて、骨の内部成長を促進する^。20-22努力は、ポリマースポンジの複製、金属粒子の焼結、ラピッドプロトタイピング（RP）方式を含む新しい製造技術を開発することにより、機械的特性を改善するためになされている、および毛穴の様々な機能を制御するために、スペースホルダー法（例えば、細孔画分、形状、大きさ、分布、および接続）と材料特性（ 例えば 、金属相と不純物^）。23-25 ​​近年、水ベースの金属スラリーの凍結鋳造は、よく整列細孔と機械的に強化されたTi形態を製造するために、かなりの注目を集めています凝固時に一方向の氷のデンドライト成長を利用した構造。しかし、水と金属粉末の接触による酸素汚染は、Ti足場の脆化を最小限にするために、特別な注意が必要です^。14,15

したがって、我々は、生物活性と機械的に同調可能な多孔性のTi足場を製造に向けた新たなアプローチを開発しました^。25足場は最初に50％以上の気孔率を有する多孔質構造を有しています。製造された多孔質足場は、生物活性分子でコーティングされ、その後、最終的な多孔性、機械的特性および薬物放出挙動は、アプリによって制御された時に機械的なプレスを用いて圧縮しました。ED株。緻密化した多孔質チタンインプラントは、骨（3-20万気圧^）。2ので、コーティング層のと同等の剛性が低いのにもかかわらず、良好な強度と低い多孔性を示してきた、緻密化多孔質チタンの生物活性が大幅に改善されました。また、ために高密度化プロセスにより誘導されたユニークなフラットな細孔構造の、コーティングされた生物活性分子は徐々に長期間その有効性を維持し、足場から放出されることが見られました。

本研究では、生物医学的用途における潜在的な使用のために緻密化した多孔質チタンの足場を製造するために、当社の確立された方法を紹介しました。プロトコルは、金属スラリーと多孔質足場の緻密化とダイナミック凍結鋳造が含まれています。まず、 図1（a）に示すように 、動的凍結鋳造法が導入された良好な延性を有する多孔質チタン足場を作製しました。 Ti粉末を液体カンフェン中に分散させました。次に、温度を下げることにより、液相は、Ti粉末ネ​​ットワークと固体カンフェン結晶間の相分離をもたらす、固化させました。その後、凝固したTi-カンフェングリーン体は、Ti粉末を連続チタン支柱と縮合され、カンフェン相が完全に多孔質構造を得るために除去された焼結しました。得られた多孔質足場を有するコーティング及び緻密化プロセスが緻密化し、初期空隙率の度合いを変化させること、を使用しました。コー​​ティング層およびその放出挙動は、GFPでコーティングされた高密度のチタンと比較して緻密化して多孔質とすることなく、チタンコーティングを採用して可視化し、緑色蛍光タンパク質（GFP）を用いて定量しました。最後に、二つの異なる多孔質構造を有する傾斜機能チタン足場が提案され、多孔質足場の内側及び外側部分の緻密化の度合いを変えることによって実証されました。

プロトコル

多孔性金属足場の作製1。

1. 4初期多孔度（40、50、60、及び70）を有する多孔質チタン足場のために、表1に記載したように材料の適切な量を秤量した後、市販のTi粉末、カンフェン、及びKD-4を混合したTi-カンフェンスラリーを準備します。 500 mlのポリエチレン（PE）ボトルにスラリーを注ぎ、30 rpmでボールミルオーブン中で30分間55℃でボトルを回転させます。
2. 60ミリメートルと60ミリメートルの高さの直径を有する円筒状のアルミニウム（Al）鋳型に、PEボトルからスラリーを注ぎます。対応するアルミニウムカバースリップで各アルミニウム金型を密閉し、10分間55℃で、30 rpmの速度でボールミルオーブン中で金型を回転させます。
   1. その後、44°Cまでボールミルオーブンの温度を低下させ、かつ連続的に12時間、44℃の一定温度で、30 rpmの速度で金型を回転させます。
3. ボール - から金型を取り出しさらに、冷却プロセスのために1時間室温で金型を回転させた後、ミルオーブン。アルプランジャーを使用したAl金型から凝固したチタン/カンフェン緑体を削除します。
4. 手でゴム製の袋に入れて固化したチタン/カンフェン緑体を配置し、完全に文字列を使用して袋の口を結ぶことにより、ゴム袋を密封します。 （CIP）プレス機を冷間静水圧の水タンクにゴム袋を置き、10分間200 MPaでの静水圧を適用します。ゴム袋から圧縮されたグリーン体を削除します。
5. 手でアルミナるつぼに上のTi-カンフェン緑体を移し、凍結乾燥機でるつぼを配置します。凍結乾燥で素地にカンフェンフェーズを昇華する素地を - 24時間、40℃。
6. その後、アルミナカバースリップでるつぼを閉じ、室温で（10 ^-6トル以下）の真空炉内で閉じたるつぼを配置します。その後、加熱Rで1300℃まで炉の温度を上昇させます5℃/分の食べて、2時間1300℃の温度を保持します。
7. 熱処理後、炉を完全に室温に冷却されるまで6-7時間炉内で焼結多孔質チタンを保ちます。
   注：冷却プロセスの6時間の間に、400℃以上の炉の平均冷却速度は〜15℃/分で、400℃以下の炉の平均冷却速度は〜2℃/分です。
8. 必要に応じて、放電加工（EDM）から直径16mmの円盤状の試料に焼結多孔質チタンのブロックをカット²⁷
   注：アルミニウム金型の大きさに応じて、焼結多孔質チタンの大きさは、加工工程（ 図2A）を介して変更する必要があります。
9. オートクレーブ内の多孔質チタンサンプルを有するガラスビーカーを置き、15分間121℃でサンプルを滅菌します。オートクレーブからサンプルを削除します。二回の70％エタノールで2回、次いで蒸留水を有する多孔質チタンサンプルを洗浄します。最後に、UV光の下でペトリ皿やクリーンベンチに室温で空気乾燥サンプルに多孔質チタンを残します。

生物活性剤と足場の2ディップコーティング

1. 9ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（DPBS、pHは7.4）の溶液10mlの中でMLは滅菌でGFPの1ミリリットルを混合することにより、クリーンベンチ内を100μg/ mlの1 mgの/から商業緑色蛍光タンパク質（GFP）を希釈表1に示すように、ポリスチレン（PS）チューブ。
2. RTにおけるGFP溶液とPSチューブにチタンサンプルを配置し、クリーンベンチに置くことによって、GFP希釈溶液（100μg/ ml）の10 mlの滅菌高密度又は多孔質チタンを浸します。
3. 真空デシケーター中のPSチューブを置き、GFPソリューションをより効果的に多孔質チタンの細孔を貫通確保するために10分間デシケーターを避難。
4. ピンセットを使用してPSチューブから多孔質チタンを削除します。直径10cm PEでGFP-コーティングされた多孔質チタンを配置トライディッシュとクリーンベンチに室温で空気乾燥O / N。
5. ガラスビーカー内のダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（DPBS）10mlで二回、多孔質チタンをすすぎ、クリーンベンチにRTでピンセットと空気乾燥を使用した直径10cmのペトリ皿に多孔質チタンを移動します。

多孔質足場の3緻密化

1. 円筒状の鋼製ダイに様々な高さと、GFP-コーティングされた多孔質チタンのサンプルを配置し、スチールダイ（ 図3A）の上部と下部の穴にパンチのセットを挿入します。
2. 0.05〜0.1秒の中間ひずみ速度でプレス機を使用したサンプル（ 図3A）のz方向の室温での鋼金型内に多孔質チタンを圧縮^-1、表2に示す所定の適用株に対する圧力を保持アンロードする前に1分間。
3. 鋼ダイから緻密化のTiサンプルを削除します。 DPBS 10mlで二回緻密化サンプルを洗いますクリーンベンチ上室温でビーカーや空気乾燥O / Nインチ

GFP-コーティングされた足場の4放出試験

1. 標本の3種類を浸し（GFP-コーティングされた密度の高いチタン（ステップ後2）、GFPは、コーティングされた多孔質のTi（ステップ1と2）およびGFP-コーティングされた高密度化された多孔質のTi（ステップ1-3）後の後）5ミリリットルのDPBS中（pH値クリーンベンチ上で37℃で10ミリリットル滅菌PSチューブに含まれている7.4）ソリューション。
2. GFPコーティングされたサンプルと吸引アウト各PS管からのすべてのDPBS溶液を1、2、3、5、8、12の予め定められた回数に応じて、ピペットを使用して、新しい5 mLのDPBS溶液（pH7.4）で補充し、 15、22および29日浸漬後。
3. 共焦点レーザー走査型分光法（CLSM）を用いて、浸漬（0日目）前22日浸漬後のGFPでコーティングされたサンプルの蛍光像を撮ります。
4. 使用してセクション4.2で各PSチューブから引き出された5ミリリットルのDPBS溶液の総から1ミリリットル溶液中で放出されたGFPの蛍光シグナル強度を測定します215ナノメートルの波長でUV分光法。強度値は、標準曲線を用いて、GFP溶液の濃度に変換します。
   注：測定の前に、0 NG / mlの濃度範囲でGFP溶液の蛍光シグナル強度を測定することにより、GFP溶液の標準曲線を描く - を10μg/ mlです。

傾斜多孔質チタンの足場の5作製

1. 1.7ステップにステップ1.1を繰り返して、焼結多孔質のTiのブロックを生成します。
2. マシンEDMにより所定の構造設計（例えば、 図5aおよび図5d）に応じて焼結多孔質チタンブロック。
3. ダイの直径よりも小さい0.1ミリメートル〜多孔質チタンの直径はスチール製金型に高さ分布と機械加工のTiサンプルを置き、スチールダイの上部と下部の穴にパンチのセットを挿入します。
4. ステップ3.2および3.3を実行します。

6.気孔率ミーTiの足場のasurement

1. チタン足場の質量（M _s）を測定します。
2. チタン足場の長さ、幅と高さを測定することによって見かけの体積（V _s）を計算します。
3. 以下の式を用いて気孔率を計算します。
   
   ここでPは、全気孔率の割合で_、ρTiはチタンの理論密度であり、m の_S / V _Sはサンプルの測定された密度です。
   注：マイクロCTイメージングは​​、マイクロコンピュータ断層撮影スキャナを使用して実施された後のTi試料の気孔率を直接マイクロCT画像から取得することができます。

結果

多孔質チタン足場を製造するために使用される製造プロセスは、 図1Aに示されています。 Ti粉末を12時間44℃で容器の連続的な回転によってカンフェン中に均一に分散保持され、液体カンフェンが完全に固化している間、比較的重いTi粉末のいずれかの堆積物を最小限にすることができます。その結果、均質のTi-カンフェングリーン体は、図1（b）に示すように 、動的凍結鋳造法を用いて製造し、ここで3次元的に相互接続された大カンフェン孔は、Ti粉末相（ 図1C）によって囲まれています。しかし、容器の不正確な回転は、多くの場合、熱処理後の多孔質足場の歪みや割れを引き起こし、グリーン体中のTiとカンフェン相の不均一な分布になります。回転速度の最適条件は、ほとんどの場合、均質な成形体を製造することができた30 rpmで、であることが見出されました。前に進んでください熱処理とる、カンフェンの大規模な成長は、図1Cに示すように、チタン、カンフェン成形体の断面を観察することにより確認されます。カンフ...

ディスカッション

バイオメタルシステムは、広く、生物医学的用途に使用されているが、特に、荷重支持材料として、高い剛性と低い金属の生物活性は、主要な課題とみなされてきました。本研究では、新しい金属系、生体模倣機械的特性ならびに持続的な放出挙動を持つ生理活性表面を有する緻密化多孔性金属足場の製造方法を確立しました。当社の製造方法の主要な利点は、1を含む）に、我々はすでに開発前のダイナミック凍結鋳造方法には変化しない^、28 2）緻密化するための多孔質の機械的強化および生体分子の持続的な放出挙動の両方を達成する一つのパラメータ度の制御金属足場と傾斜機能材料への3）潜在的なアプリケーション。

緻密化多孔性金属を製造するために必要とされる重要なステップの一つは、2つの重要なfeatuを有している多孔性のTiの製造でRES：1）延性が生物活性分子および機械的特性の放出速度を制御し、2）高い細孔相互接続は、ロードした生体分子を解放します。しかし、以前に制限された孔の相互接続性または延性のいずれかを示している多孔質のスペースホルダー法を用いて製造チタン足場、スポンジテンプレート法、粉末冶金を報告...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
チタン粉末アルファ	Aesar	#42624-325	メッシュ、99.5%(金属ベース)
Camphene	SigmaAldrich	#456055	95%, C10H16
KD-4	Croda	­	Hypermer、高分子分散剤
リン酸緩衝液(PBS)	Welgene	ML 008-01	­
緑色蛍光タンパク質(GFP)	株式会社ジェノス	-	純度>98%、1 mg / ml
ボールミルオーブン	SAMHENUG ENERGY	SH-BDO150	­
凍結乾燥機	イルシンラボ	PVTFD50A	­
冷間静水圧プレス(CIP)マシン	SONGWON SYSTEMS	CIP 42260	­
真空炉	JEONG MIN INDUSTRIAL	JM-HP20	­
電動ケージマシン	ファナック ロボカット	0iB	社外用
プレス機	CG&S	AJP-200	­
共焦点レーザー走査型分光法(CLSM)	Olympus	FluoView FV1000	外部使用