ここでは、神経幹細胞および/またはそれらに隣接する上衣細胞の長期的な遺伝子改変のためのレンチウイルス粒子の使用に基づく手順を、成体の心室-心室下神経原性ニッチにおける長期的な遺伝子組み換えのために説明すると、神経幹細胞に対する細胞の自律的および非自律的な、ニッチ依存性の影響を別々に分析することができます。
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この記事について
サマリー
要約
比較的静止体性幹細胞は、大部分の成体組織における生涯細胞の再生をサポートしています。成人の哺乳類の脳内の神経幹細胞は、2つの特定の神経因性ニッチに制限されている：海馬における歯状回および心室-脳室下帯の顆粒下ゾーン（V-SVZを、また、上衣ゾーンまたはSEZと呼ばれる）の横の壁に心室。長期幹細胞における所望の導入遺伝子の発現およびそれらの派生子孫を生じる（ すなわち、哺乳動物の脳のもの）成体幹細胞集団のためのin vivo遺伝子導入戦略の開発は、現在、生物医学及びバイオテクノロジー研究において重要なツールです。ここでは、直接in vivo法は、LVのによる細胞周期に依存しない感染症およびV-SVZニッチの専門性の高い細胞構築を活用して成体マウスV-SVZ細胞の安定な遺伝的改変のために提示されています。具体的には、現在のプロトコルが関与しますV-SVZ自体のいずれかに特異的な導入遺伝子発現カセットをコードする空のLV（対照）またはのLVの注入は、上衣のターゲティングのために、in vivoでのニッチ内の細胞のすべてのタイプのターゲティングのために、または側脳室の内腔に、よ細胞のみ。発現カセットは、次にできるよう、またのLVによってコード導入された細胞と蛍光タンパク質のゲノムに組み込まれている標識された細胞とにおける細胞自律非自律、ニッチ依存効果の分析のための形質導入された細胞の検出、それら子孫。
概要
マウス心室脳室下帯（V-SVZ）、線条体に面した側脳室の壁には、嗅球の持続的な生産における前駆細胞の複製と分化の結果の中で継続的なプロセス（OB非常にアクティブな胚領域であり、 ）介在ニューロンと脳梁オリゴデンドロサイト1。 、星状細胞抗原グリア線維性酸性タンパク質（GFAP）を発現し、このようなネスチン、Id1のような細胞マーカー幹;これらの細胞の生涯の生成は、神経幹細胞（別名B1細胞のNSC）のこの領域に存在することによってサポートされているように見えます及びSox2の2。 GFAP発現B1細胞は、トランジット増幅前駆細胞転写がDLX2（遠位レスホメオボックス2）及びASCL1（哺乳類achaete-schuteホモログ1）を係数表現（TAP）細胞（C細胞）を、生成し、それらが生じる前に、急速に数回を分割神経芽細胞（A細胞）またはoligodendroblasts 3を移行します。新たに生成されたproliferative神経芽細胞は、彼らが粒状と差別化抑制性などの糸球体層に統合OBへの吻側渡り鳥ストリーム（RMS）を形成し、前方に移行します。移行若いoligodendroblastsは、彼らが局所的に分割または成熟ミエリン形成オリゴデンドロサイト1,4に分化していき未熟NG2陽性細胞となるCC、に移動。
胎児の放射状グリア細胞に由来B1細胞は、前任者の細長い偏光形態を保持し、それらの....
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プロトコル
倫理の声明：このプロトコルは、欧州指令63分の2010 / EUに準拠したバレンシア大学の動物のケアのガイドラインに従います。
研究をマーキングインビボのためのLVの1世代（図1aを参照してください）
注意：本明細書に記載された手順は、したがって、バイオハザードフード内のすべての次の手順を実行し、バイオセーフティーレベル2です。研究担当者は、適切な資格と、すべての手順の研修を受けていることを確認してください。ガウン、二重の手袋と適切な眼の保護を含め、個人用保護具を着用してください。最後に、完全に（70％エタノール、10％の漂白剤および/またはオートクレーブ処理で拭いて）承認された施設の消毒慣行に従ってウイルスと接触していたかもしれないすべてのツールとの表面を除染します。
- ヒト胎児腎臓293T細胞におけるLVの生産
- トランスフェクションのために純粋なDNAを調製することにより、このプロトコルを起動します。準備し、二重のCsCl卒業生によって各プラスミドを精製しient遠心分離またはエンドトキシンフリーDNAを得た他の市販のカラム法。このプロトコルでは、トランスファーベクタープラスミドpRRL-SIN-PPT.PGK.EGFP.Wpreを使用しています。推奨されるコアパッケージングプラスミドは、pMDLg / pRREとpRSV.REVとエンベローププラスミドpMD2G 13,18,19で....
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結果
LV媒介遺伝子送達系は、増殖、遊走および分化の間にそれらの追跡及び遺伝的改変を可能にする、成体マウスのV-SVZにおける細胞の in vivo形質導入の長期に使用することができます。感染および発現は、非常に有効であり、含まれるレポーターの発現により他の非感染細胞の間で容易に区別することができる多数の細胞を得ました。我々は、これまで広範に発現ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーターにより駆動されるGFP蛍光レポーターで形質導入された細胞を可視化しているが、他のレポーターまたはタンパク質タグを使用することもできます。私たちは日常的にGFPに対する抗体を使用する代わりに、それはより強い蛍光シグナルを生成するようなレポーター発光の直接検出に依存します。また、脳は、新鮮な解剖し、固定液に浸漬するがはるかに良い結果がtranscardial灌流することによって得られることができます。
精製、濃縮されたベクターストックはゆっくりと私です線条体とその限界にV-SVZに定位指導の下njected（ 図2a、b）に 。二ヶ月注入後、.......
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ディスカッション
LVSは大人のNSC 16,18の遺伝的改変のための他のウイルスシステムに比べて重要な利点を提供します。 V-SVZニッチへのレンチウイルスの定位配信は、ラベルを付け、そのような複数の細胞分裂後に希釈されたBrdU、またはレトロウイルスなどの他の一般的に使用される方法の限界を克服B1-のNSCを分割まれにトレースし、細胞のみを標的とするための効率的な方法を表し、それは、アプリケーションの瞬間に増殖しています。 LVSは、一緒にアデノウイルスで、独立して自分のサイクリング状態の細胞に感染することができ、これは大人のNSC 16,18のように、このような上衣細胞としてではなく、サイクルを行う、又は比較的静止状態であるので、めったに分裂しない細胞に特に関連しています。導入遺伝子は安定して高効率形質導入された細胞およびその子孫の形態学的特徴を可能と統合し、表現になります。
NSCは、隣接細胞と専門性の高いニッチに抱いていますこのような上衣または血管細胞、ならびに独自の細胞の子孫は、このように厳密に調節された環境2を作成します
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開示事項
すべての操作はバイオセーフティーレベル2部屋で行われました。動物プロトコルは、バレンシア大学の倫理委員会によって承認され、すべての欧州指令63分の2010 / EUに準拠してありました。
謝辞
私たちは、MJパロップと大学・デ・バレンシアのSCSIEの技術支援の助けを認めます。我々はまた、有用なコメントや原稿の議論のためアントニアFollenziに感謝します。フンダシオンBotinのによってサポートされている場合は、そのサンタンデール大学グローバル部門を通じてバンコ・サンタンデールによると、Generalitatのバレンシア（PROGRAMAプロメテオ、ACOMP、およびISIC）とMINISTERIOデエコノミアのy Competitividad（：SAF2011-23331、CIBERNED及びRETICターセルMINECO）からの助成金によって、 。この作品は、また、（260511- MINECO と欧州研究評議会（ERC）2012-STGからBFU2010-21823とRETICターセル助成金によってサポートされていました AC BM-P へのPD-HUMMODEL）。 MINECOのスペインFPIの交わりの受信者です。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| パート1:in vivo送達用のLVの生成 | |||
| 機器: | |||
| 超遠心分離機 | ベックマン・コールター | オプティマXL-100K | |
| 超遠心ローター | ベックマン・コール | ターSW-28 | |
| 超遠心分離機ローター | ベックマン・コールター | SW-55 | |
| 超遠心チューブ | ベックマン・コールター | 358126 | 25 mm x 89 mm |
| 超遠心チューブ | ベックマン・コールター | 326819 | 13 mm x 51 mm |
| 超遠心分離機用アダプター | ベックマン・コールター | 358156 | |
| 6 ウェルプレート | SPL | PLC-30006 | |
| 24 ウェルプレート | SPL | PLC-30024 | |
| 10 cm ディッシュ | SPL | PLC-20101 | 100 x 20 スタイル |
| FACS チューブ | アフォラ | DE400800 | 12 mm x 75 mm、5 ml |
| カップ滅菌FACS | フィルターBD | 340626 | 30 µm |
| ニトロセルロースフィルター | ミリポア | SCGPU05RE | 0.22 μm |
| フローサイトメーター | BD | LSR Fortessa | Blue laser 488 nm |
| Steritop filter | Biofil | FPE-204-500 | 0.22 以上m |
| 試薬: | |||
| pMDLg/pRRE plasmid | Addgene | #12251 | コアパッケージングプラスミド |
| pRSV.REV プラスミド | Addgene | #12253 | コアパッケージングプラスミド |
| pMD2G プラスミド | Addgene | #12259 | エンベローププラスミド |
| pRRL-SIN-PPT.PGK.EGFP.Wpre プラスミド | Addgene | #12252 | トランスファーベクタープラスミド |
| ダルベッコ改変イーグル培地 | Biowest | L0101-500 | HeLa細胞培養用 |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium | Life technologies | 12440-053 | 293T細胞培養用 |
| Tris-EDTA (TE) | Tris-HCl (sigma, T5941), 0.1 mM EDTA (sigma, E5134), pH 7.6, DNAse/RNAseフリー、0.2 µm滅菌ろ過された | ||
| 2x HBS | 0.28 M NaCl(Sigma、S7653)、0.05 M HEPES(Sigma、H7523)、1.5 mM無水Na2HPO4 (Sigma、S7907)のdH2O(できればMilliQではない)でろ過します。NaOH溶液(Calbiochem, 567530)でpHを7.0に調整します。 | ||
| ウシ胎児血清(FBS) | Biowest | S181B-500 | 100倍のストック溶液で、最終濃度10倍のHeLaおよび293T培地を調製するために使用されます。 |
| Glutamine | Sigma-Aldrich | G7513-100 | 200 mM のストック溶液で、最終濃度 6 mM の HeLa および 293T 培地の調製に使用されます。 |
| ピルビン酸ナトリウム | ライフテクノロジー | 11360-039 | 100 mMのストック溶液で、最終濃度1 mMのHeLaおよび293T培地を調製するために使用されます。 |
| GlutaMAX Supplement | Life technologies | 35050-061 | 最終濃度1%の293T培地の調製に使用。 |
| ペニシリン/ストレプトマイシン | Sigma-Aldrich | P4458 | ストック溶液には、5,000 単位/ml のペニシリンと 5 mg/ml のストレプトマイシンが含まれています。HeLaおよび293T培地の最終濃度1%で調製するために使用されます。 |
| トリプシン-EDTA | ライフテクノロジー | ズ25200-056 | ノールレッドと、2.5gの豚トリプシンと0.2gのEDTA 4Na/L HBSSが含まれています。 |
| リン酸緩衝生理食塩水 (PBSの) | Sigma-Aldrich | D1408 | 塩化カルシウムおよび塩化マグネシウム不使用、10倍、液体、滅菌ろ過済み、細胞培養に適しています。細胞培養グレードの水で1x PBSを調製するために使用したストック溶液。 |
| ポリブレン(臭化ヘキサジメトリン) | シグマ-アルドリッチ | H9268 | パウダー。dHO |
| パラホルムアルデヒドEMグレード16% | EMサイエンス | 15710 | |
| Name | Company< | strong>カタログ番号 | コメント |
| パート2:SEZ固有または側脳室へのLVのステロタキシック注射. | |||
| 機器: | |||
| Vernier定位固定装置 | NeuroLab、ライカ | 39463001 | |
| http://www.leicabiosystems.com/ カニンガムマウスおよび新生児ラット | アダプターNeuroLab、ライカ | 39462950 | |
| シリンジ | ホルダーKDサイエンティフィック | KDS-311-CE | |
| 33ゲージシリンジ | ハミルトン | P / N 84851/00 | #85RN |
| 電動ドリル | ファインサイエンスツール | 98096 | |
| サーマルブランケット | Ufesa | AL5512 / 01 | 230-240 V、100-110 W、タイプC_AL01 |
| シェーバー | Jata | MP373N | モデル:美しさ、3 V、300 mA、タイプHT-03。 |
| 試薬: | |||
| メデトミジン | エステベ | DOMTOR | 1 mg / mlの商業溶液。 |
| ケタミン | メリアル | イマルゲン 500 | 50 mg / mlの商業溶液 |
| メデトミジン/ケタミン混合物 | 生理食塩水中に、最終濃度0.2 mg / ml希釈のメデトミジンと最終濃度15 mg / mlのケタミンの作業混合物を準備します。.体重1kgあたり0.5-1mgのメデトミジンと体重1kgあたり50-75mgのケタミンの最終濃度を得るために、容量を注入する麻酔として使用します | ||
| ブトルファノール | ファイザー | トルブゲシック | 10mg/mlのストック溶液 生理食塩水で1mg/mlの鎮痛剤として使用されます。 |
| アティパメゾール | エステベ | アンチセダン | ストック溶液を5 mg / mlで、生理食塩水の最終濃度0.5 mg / mlで麻酔から出ます。. |
| 0.9%生理食塩水 | ブラウン | 13465412 | |
| Histoacryl | Braun | 1050052 | 局所皮膚接着剤 |
| ハイドロゲル | クリア H2O | 70-01-5022 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34120 | 11 cm x 21 cm |
| 漂白剤/Virkon | デュポン | ||
| サージカルマーカーペン | Staedler | 313-9 | パーマネント ルモカラー |
| オックスルミック ローション | SICCAFLUID | 0.5 g /ドーシス、カルボマー974P | |
| ポビドンヨードベ | タジン | 694109.6 | 10%ポビドンヨード |
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
| パート3:組織学的分析. | |||
| 設備: | |||
| 自動蠕動ポンプ | Cole-Parmer Inst. Co. | HV-07524-55 | Masterflex L/S 可変速エコノミードライブ、1.6-100 rpm、230 V |
| ポンプヘッド | Cole-Parmer Inst. Co. | HV-07518-00 | Masterflex L / S Easy-Loadポンプヘッド(精密チューブ用)。PSFハウジング、CRSローター |
| シリコンチューブ、 | コールパーマー研究所 | HV-96410-16 | プラチナ L/S 16 |
| 頭皮静脈セット | Vygon V-green | 70246.05T | 25 G, 30 cm チューブ長 |
| ビブラトーム | ライカ | VT1000 | |
| 共焦点顕微鏡 | オリンパス | FluoView FV10i | |
| ホットプレート | Tehtnica | SHP-10 | |
| 試薬: | |||
| リン酸緩衝液 (PB) | 0.2 M PB: 0.2 M Na2HPO4 (Sigma, S7907) および 0.2 M NaH2PO4 (Panreac, 141965.1211) in dH2O, pHを7.2-7.4に調整 | ||
| パラホルムアルデヒド(PFA) | Panreac | 141451.1211 | 毎回新鮮に準備します。dH2Oを最大55＆ndashまで加熱します。60度;Cは、ヒュームフードに設置したホットプレートを用いて、攪拌しながらPFA粉末を注ぎ、8%溶液を得る。溶液は白く濁り、PFAは溶けにくいです。溶液が透明になるまで、1N NaOHを一滴ずつ加えます。冷まし、Whatman紙でろ過し、0.2 M PB相当の量を追加します。 |
| 食塩水 | 0.9% NaCl dH2O | ||
| 瞬間接着剤 | LOCTITE | 767547 | |
| アジ化ナトリウム | Panreac | 122712.1608 | |
| グリシン | Sigma-Aldrich | G7126-100 | |
| 正常なヤギ血清 | ミリポア | S30-100 | |
| トリトン X-100 | シグマ-アルドリッチ | T9284 | 洗剤 |
| 抗GFPウサギ抗体 | ROCKLAND | 600-401-215 | 1:500希釈で使用 |
| Alexa Fluor 488 Donkey 抗ウサギIgG(H+L)抗体 | 分子プローブ | A-21206 | 1:750希釈で使用 |
| 6-Diamindino-2-phenylindole dihydrochloride hydrate (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | 蛍光核染色。ddH2Oで2 mg/mlで使用し、4°Cの暗所に保管してください。 |
| Fluoromount-G | EM Sciences | 17984-25 | 蛍光製剤用封入剤 |
参考文献
- Fuentealba, L. C., Obernier, K., Alvarez-Buylla, A. Adult neural stem cells bridge their niche. Cell Stem Cell. 10 (6), 698-708 (2012).
- Silva-Vargas, V., Crouch, E. E., Doetsch, F. Adult neural stem cells and their niche: a dynamic duo during homeostasis, regene....
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