方法論記事

イメージング免疫学的シナプスダイナミクス内皮平面内細胞モデル

DOI：

10.3791/53288

⸱

2015年12月24日

 , 
1Department of Medicine, Harvard Medical School - BIDMC

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

適応免疫は、T細胞と抗原提示細胞との間に形成される動的な「免疫学的シナプス」によって制御されます。このプロトコルは、研究が進んでいない生理学的APCとして、また新しいタイプの「平面細胞APCモデル」として、内皮細胞を調査するための方法を説明しています。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

適応免疫は、T細胞と抗原提示細胞（「APCの '）との間の動的な相互作用によって調節される「免疫学的シナプス」と呼ばれます。これらの親密な細胞間のインタフェース内の個別のサブセルラーMHC / AgをTCRのクラスター、F-アクチン、接着およびシグナル伝達分子を形成し、急速に改造。これらのダイナミクスは、病理学的免疫対開発し、したがって、保護の免疫応答の効率と品質の両方の重要な決定要因であると考えられています。生理学的なAPCとの免疫学的シナプスの現在の理解を得ることができる画像解像度の不足によって制限されます。人工基質モデル （例えば、平面脂質二重膜）は、優れた解像度を提供し、非常に貴重なツールとなっているが、彼 ​​らは本質的に非生理学的および単純化し過ぎています。血管とリンパ内皮細胞は重要な末梢組織（または間質）として出現した「半専門職のコンパートメントアルのAPC」。 （プロフェッショナルAPCの分子機構のほとんどを発現する）これらのAPCは、事実上平面状細胞表面を形成するユニークな機能を持っており、（蛍光タンパク質レポーターで、 例えば ）は、容易にトランスフェクトされています。基本的な抗原性シグナル伝達プロセスの改善されたイメージング及び質問のための新規な及び生理的な「平面セルラーAPCモデル 'に説明するように内皮細胞を実装するために、本明細書の基本的なアプローチ。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tリンパ球は、主要組織適合遺伝子複合体（MHC）に結合した、効率的ペプチド抗原（銀）を認識する能力を特徴と適応免疫系の分岐であるが、それらのT細胞受容体（TCR）を介して1分子。ナイーブリンパ球恒常移行し、「プロのAg提示細胞」（APCは、 例えば 、樹状細胞）をスキャンするメモリ/エフェクターT細胞が効果的に末梢組織内のAPCおよび潜在的な標的細胞の非常に広い範囲を調査する必要がある一方で、リンパ節内。

APC上の同族銀の当初認識以下分では、リンパ球は、それらの移動を阻止し、（IS）「免疫シナプス」と呼ばれる特殊な親密な細胞間のインタフェースを形成し始めます。持続（ すなわち 、30〜60分）は接点が増幅し、2-7のシグナリング維持する必要がありますされています。新興の研究では、IS内、それが連続形成し、迅速なRであることを識別強度および免疫応答2-7を得られるの品質を決定する（ すなわち 、MHC / AgをTCR、F-アクチン、接着およびシグナル伝達分子を含む）は、離散サブ細胞シグナルマイクロクラスタemodeling。しかし、このプロセスの動的な詳細及び調節機構は不完全に理解されている8,9。これは、APC表面の不規則なトポロジーに関連する技術的な課題や細胞間相互作用面のコントロール不良の向き、深く必要な時空間イメージングは8月10日 （Figure1A）に近づく制限の問題から大きく茎。

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イメージング免疫学的シナプスのダイナミクスについては、図1のA生理学的平面内細胞APCモデル。概略的には、T細胞とprofessio間の免疫学的シナプスの伝統的なイメージングを示しています最終APC（A）とT細胞とこの新規内皮平面APCモデル（C）と比較して、従来の平面脂質二重層APCモデル（B）。プロフェッショナルAPCは、生理学的、免疫学的シナプスを提供するが、不十分指向細胞間のインタフェースを提供（最適なX-Yの撮像面に対してすなわち 、;解像度〜0.2μm）で、劇的空間（Zの撮像面〜1μmの分解能）および時間的（ すなわち 、妥協します繰り返しイメージングのすべてのzイメージングプレーン）の解像度をスキャンする必要性に起因します。二層モデルは、最適な時空間分解能イメージングを提供する平面のトポロジーを持っているだけでなく、高度に簡略化された非生理学的な剛性です。この内皮細胞モデルは、生理学的な設定で最適な空間と時間的画像の解像度を提供するために、古典的なAPCの生理学的基質と脂質二重層の平面トポロジを兼ね備えています。M /ファイル/ ftp_upload / 53288 / 53288fig1large.jpg「ターゲット= "_空白">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

以前の研究は、部分的に最適なXYイメージングに平行である、単一の計画に、T細胞活性化の面を固定経由で最適な時空間解像度（ すなわちを提供し 、平面基板モデル（ すなわち 、脂質二重層と抗体被覆表面）、開発することによって、これらの障害物を回避していますプレーン）11-15（ 図1B）。これらのモデルは、動的なアクチン/ TCRシグナリングマイクロクラスター7,11-14の発見を含むT細胞における抗原性のシグナル伝達を制御する分子/細胞内動態に重要な洞察を容易にしました。しかし、このようなモデルは、本質的に単純化されるだけでなく、剛性（ 図1B）（3次元位相幾何学的特徴の開発/研究を排除）。したがって、PHYに、このような調査結果を関連付ける方法を依然として不透明siologic細胞 - 細胞免疫監視。

まだunderstudiedものの、血管やリンパ管の内皮細胞は、「セミプロ」のAPC 16-18の大（ すなわち 、〜1000倍により、すべてのプロフェッショナルAPCより数の大きい）周辺の区画として浮上しています。これらの細胞は、MHC-I、MHC-II-および共刺激分子の多数を表現（例えば、CD40、LFA3、ICOSL、4-1BB、OX40L、TL1A、PD-L1;ではなく、CD80およびCD86）と戦略的です彼らは16-18特殊なセンチネル機能を果たし、血液-組織界面に位置します。以前の研究では、内皮細胞が効果的にエフェクター/メモリー、しかしナイーブではない、T細胞の19-25を再刺激することができることを実証しました。従って、内皮細胞は、T細胞の活性化、分化、メモリーと寛容16,17,26のローカル影響などの末梢組織中での適応免疫応答のエフェクター相に固有のAPCの役割を果たしている可能性があります。 CRIin vitroで増殖させた場合tically、 内皮細胞は、実質的に平面状のセル表面を形成し、（蛍光タンパク質レポーターを用いて、 例えば、）容易にトランスフェクトされています。これらの機能は、細胞間相互作用19,27の間の位相幾何学的力学の高時空間分解能イメージングに最適です。従って、内皮細胞は、抗原認識を駆動し、応答（ 図1C）19,20 を制御する細胞内分子/改造メカニズムの研究のための明らかに適した生理的な「平面携帯APC」モデルとなる恐れがあります。

接着および経内皮移動27中の白血球-内皮相互作用の詳細を研究するための（形質膜と細胞質ゾルの蛍光タンパク質メーカーと内皮細胞のトランスフェクションを含む）以前に確立された補完的なイメージング技術は、白血球が積極的にダイナミックによって内皮の表面を探査することを示しました挿入ANサブミクロンスケールのd後退は、アクチン豊富な円筒状の突起が（〜直径、深さ200〜1,000 nm）をinvadosome状突起（ すなわち 、「ILPS '）27,28と呼ばれます 。これらのイメージング手法は、さらに19,20を報告し、本明細書でさらに説明するように、T細胞、内皮免疫学的シナプスの高時空間分解能イメージングのための最初の方法を開発する内皮APC機能を利用するためのプロトコルの作成 ​​に伴って拡張されました。この小説平面携帯APCモデル由来中央知見は、T細胞ILPSは、初期のAg検出を促進する上で、その後のシグナル伝達を維持するには、両方の機能することです。実際、（安定化およびカルシウム流入初期に応じて計上されていた）、TCRと活性なシグナルなどのPKC-Q、ZAP-70、ホスホチロシンとHS1の示唆に富む分子でshow濃縮を複数ILPSの配列。したがって、ILPSは、TCRシグナルマイクロへの3次元生理学的同等を表しているように見えます平面二重層モデルで見られたクラスタ。このアプローチは、このように、敏感に明らかに/レポート分子と建築（および生体力学的暗黙の）ダイナミクスそうでなければ検出できません。

本明細書に記載の方法は、適応免疫応答の基本的なメカニズムを調べるために我々の能力を向上させるために、プロのAPCと人工APC基板モデル間のギャップを埋めるに有用であるはずです。ここでの焦点は、CD4 + Th1型エフェクター/メモリー細胞の活性化にある間に、以下に説明するように、この基本的なアプローチは、容易に、T細胞型とのAgの広い範囲を研究するために改変することができます。

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プロトコル

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このプロトコルで説明されているすべての実験は、初代ヒトT細胞および市販の一次ヒト内皮細胞（皮膚や肺の微小血管のEC）を用いて実施されているヒトを対象とする.ANY研究プロトコルは、治験審査委員会によって承認されなければならず、書面によるインフォームドコンセントから提供されなければなりません各血液ドナー。このプロトコルを使用して行った実験は、ベス・イスラエル・ディーコネス医療センターのIRBによって承認されました。

ヒトCD4 +のTh1エフェクター/メモリーT細胞の準備1

  1. アルコールで静脈を拭く、ドナーの腕に止血帯を適用し、針を挿入します。ゆっくりと抗凝固剤としてEDTAを用いて真空採血に15mlの血液を描画します。血液が描画された場合には、針を取り外す前に止血帯をほどきます。すぐに針が除去されると、滅菌ガーゼで創傷に圧力を加えます。
  2. 50mlのチューブに血液を移します。 1希釈（最終容量30ミリリットル）：1で、RTでRPMI-1640を追加します。慎重に希薄オーバーレイこのような室温でフィコール・パックとしてプレフィルタリンパ球分離培地15 mlを含む2 50mlチューブへのD血。
  3. スイングバケットローターで1200×gで30分間室温で勾配を遠心します。遠心分離しながら、T細胞培地（RPMI-1640を500ml、50mlのFCS、5 mlのペニシリン/ストレプトマイシン）を調製。
  4. 遠心分離機から50 mlチューブを除去すると、四層を観察：赤血球のペレットを底部に、Paqueを、白血球（リンパ球を含む）細胞および血漿を含んでいる細胞の層を。慎重に50ミリリットルファルコンチューブ内のパスツールピペットや転送に白血球層を除去。
  5. （20 mlまで）RT RPMI-1460を添加し、1200×gで5分間、室温で遠心分離することにより白血球層を洗浄します。 T細胞を培地1ml中の白血球を再懸濁します。 1.5ミリリットル遠心管に250μlのT細胞培地に1ミリリットルの細胞懸濁液の5μLを加え、穏やかに上下にピペットで混ぜます。
  6. 25μlの希薄を追加25μlの0.4％トリパンブルーのD細胞懸濁液。標準血球計数器の各側に液10μlを追加。
  7. 低消費電力の光顕微鏡で血球計数器を置きます。 10倍の対物レンズを使用すると、トリパンブルー色素を除外し、血球計数器の両側の中央広場に存在している生きた細胞の数を数えます。
  8. 細胞濃度を計算するために、100（希釈係数）により2乗の平均値を乗算し、その後乗算による10 4細胞 / mlの数を与えます。
  9. T細胞培地中の0.5×10 6細胞/ mlの最終濃度を調整します。 1 / mlの細胞へのエンテロトキシンB（SEB）および毒素性ショック症候群毒素1（TSST）、ブドウ球菌細菌性スーパー抗原のそれぞれの最終濃度を追加します。 CD4 + T細胞集団を拡大するための72時間の培養（37℃、5％CO 2）。
  10. とT細胞の培地中の0.5×10 6細胞 / mlでT細胞ペレット（1200×gで、5分間）し、再懸濁ヒトIL-15（20 ngの/ ml）を添加します。転送は、T150フラスコにリンパ球。その後、必要に応じて（ すなわち 、メディアはわずかに黄色にピンクから変わるたびにメディアの色に基づいて）/すべての24〜48時間をフルで分割細胞中IL-15を拡大し続けます。最大15日間の結果リンパ球集団を維持します。
    注：設計では、このプロトコルは、具体的には、SEBおよびTSSTに反応性があり、その後、Th1様エフェクター/メモリー表現型に向かってそれらを駆動する CD4 + T細胞のサブセットを活性化し、拡大していきます。他の白血球細胞が生存し、直ちにフローサイトメトリーによって評価することができるように、ステップ1.10によって細胞は、少なくとも95％CD4 +、CD45RO + T細胞19となるように、これらの条件下で増殖することができません。所望の場合、さらなる精製は容易に市販の抗体/磁気ビーズベースの陽性または陰性選択キットを介して達成することができます。

2.初代ヒト内皮細胞の培養を開始

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  • コー​​ト無菌状態で、PBS中のフィブロネクチン（FN）を20μg/ mlのT25フラスコ。 30〜60分間室温のままにしておきます。 FNを取り外し、5ミリリットルを完全培地を追加（内皮基礎培地（EBM-2）媒体は、内皮増殖培地（EGM-2）singlequotsを補いました）。 37でプリインキュベート 少なくとも30分間℃で細胞培養インキュベーター。
  • 〜2-3分間、時折穏やかに撹拌しながら37℃の水浴中で凍結ヒト肺または皮膚微小血管内皮細胞（HLMVECsまたはHDMVECs）のバイアルを解凍します。すぐに予熱した培地を含むT25フラスコに細胞を移します。ゆっくり旋回し、37℃のインキュベーター内に置きます。
  • 〜4-6時間後にメディアを変更します。メディアに約48時間ごと（またはメディアがわずかに黄色になったときに）プレートが〜に達するまで90％〜95％の密集度を変化し続けます。

    • 3.一般的な分割および内皮細胞の増殖

    1. 〜90-95コンフルエントに細胞を増殖させます。これは、2-5日かかる場合があります。分割については、メディアを取り出し、PBSですすいでください。 PBSを削除し、新鮮な1×トリプシンの最小容積（T25 0.5 mlまたはT75 1.5 ml）で置き換えます。ゆっくりトリプシンですべての表面を覆うように渦。 37でインキュベートします 〜5分間℃です。低消費電力の光顕微鏡を用いてプレートからの細胞の剥離を監視します。
    2. 細胞の大部分は、丸みを帯びまたは切り離し、（追加されたトリプシン量に比べすなわち、）5ボリュームを追加あらかじめ温め完全EGM-2培地と穏やかにすべての細胞を剥離するために、フラスコの表面にピペットの表示された場合。
    3. 1.6から1.7に記載されているように血球計数器で内皮細胞を数えます。遠心分離（5分、1200 XG）により細胞をペレット化。上清を取り除きます。予め温めておいた完全EGM-2 MVメディアの添加によってミリリットルにつき0.5百万個の細胞の濃度を調整します。
    4. メンテナンスのために適切なFNコートしたディッシュまたはフラスコに細胞のアリコートを転送します。ゆっくり旋回し、インキュベーターに置きます。メッキの6〜12時間以内にメディアを変更します。メディア翔48時間ごとに、その後約変更することがULD。

    4.内皮細胞のトランスフェクション

    注：一次内皮細胞は、最も一般的な化学的および電気穿孔法によるトランスフェクションに難治性です。以下で説明するの核トランスフェクションベースの方法は、比較的高いトランスフェクション効率（〜50〜70％）を可能にします。効果的な代替方法は、適切なウイルスベクター（材料表中のコメントを参照のこと）による感染の使用です。

    1. （のための滅菌条件のいずれかのようなデルタTプレートとして顕微鏡培養プレートで、PBS中のフィブロネクチン（FN）20ug / mlの90％〜95％のconfluency.Coatの最終密度にHLMVECsまたはHDMVECsのT25やT75フラスコを（必要に応じて）準備（2.1）上記のようにして）、ステップ6のための24ウェル細胞培養プレート（ウェルの内部に配置され、ステップ5）または12 mmの円形のカバーガラス。
    2. 各24ウェルに顕微鏡文化への完全EGM-2培地1mlのplatesor 0.5ミリリットルを加え、プレートを平衡化で加湿37℃/ 5％CO 2インキュベーター。
    3. 収穫し、室温で5分間1200×gで細胞（サンプル0.5万個の細胞）の必要容量3.1-3.3.Centrifugeのステップのように内皮細胞をカウントします。サンプルあたり100μlのRT核トランスフェクション溶液中で慎重に細胞ペレットを再懸濁します。
    4. 1-5μgのDNAを100μlの細胞懸濁液を組み合わせます。認定されたキュベットに細胞/ DNA懸濁液を移します。サンプルは、気泡なしキュベットの底をカバーしなければなりません。
      注：（翻訳後のパルミトイル化のための信号が含まれているニューロモジュリンのN末端 ​​の20アミノ酸を介して）細胞膜にYFPかのDsRedをターゲットに構築物（単独膜-YFP単独膜のDsRed）を単独で使用されたかで同時トランスフェクト細胞質容積マーカー（ 例えば、膜 -YFPおよび可溶性のDsRed）。蛍光タンパク質マーカーの多くの順列を使用することができます。
    5. キャップでキュベットを閉じます。キュベットを挿入エレクトロのキュベットホルダへの細胞/ DNA懸濁液とエレクトロポレーションプログラムS-005を適用します。プログラムが終了したら、ホルダーからキュベットを取ります。
    6. キュベットに予め平衡化培地の〜500μLを加え、穏やかに核トランスフェクションキットに付属のプラスチック製のトランスファーピペットを用いてキュベットから細胞懸濁液を除去します。
    7. 顕微鏡培養プレートを用いた実験のために均等に予熱した培地を含有する2皿（ステップ4.2から4.3）の間に1つの反応から細胞懸濁液を分割。 24ウェル/プレート、パーティション3つのウェルとの間にも同様に一つの反応を用いた実験のために。
    8. 加湿37℃/ 5％CO 2インキュベーター中で細胞をインキュベートし、メディアに4-6時間を変更し、再び12〜16時間トランスフェクション後に。

    5.ライブセルイメージングと分析

    1. 内皮の準備
      1. 0日目：膜-YFPおよび可溶性のDsRedとの同時トランスフェクト一次HLMVECs nucleofe経由ction技術生細胞イメージング培養プレートにステップ4と板で説明したように。
      2. 1日目：MHC-IIの発現を誘導するために、IFN-γ（100 ngの/ ml）を含む新鮮な培地で培地を交換してください。 2日目には、既存のメディアへの20 ngの/ mlのTNF-αを添加することによりトランスフェクトされた細胞を刺激します。
      3. 3日目に、1 / mlの細菌性スーパー抗原ブドウ球菌エンテロトキシンB（SEB）および毒素性ショック症候群毒素1（TSST）のそれぞれ37時と内皮をインキュベート 実験の直前に30〜60分間℃です。 「-Ag「制御条件について、このステップを省略します。
    2. リンパ球の準備
      1. 5.1.3ステップと並行して、緩衝液A（フェノ​​ールレッドを含まないHBSS）を20mMのHepesを補充した調製液、pH7.4および0.5％v / vのヒト血清アルブミン37に予め温め °C。培養リンパ球のサンプルを取り、血球計数器（ステップ1.12から1.17）でカウントすることにより、密度を決定します。
      2. 遠心1の検体につき2万個の細胞、15ミリリットルコニカルチューブ中で室温で5分間、200×gで。静かに吸引し、メディアとは何の細胞クラスターが残っていないように緩衝液Aの2ミリリットルに細胞ペレットを再懸濁します。
      3. 1 mMのストック濃度を作るためにDMSOにフラ-2カルシウム色素および再懸濁の新鮮なアリコートを削除します。
      4. （2μM最終濃度）のT細胞懸濁液にフラ-2原液の2μlを添加し、チューブをキャップし、染料の均一な分散を確保するため、チューブを反転させてすぐに混ぜます。 37でインキュベートします 30分間°C。
      5. ステップ5.2.2のように遠心します。吸引除去バッファ-Aと穏やかに、しかし完全には新鮮な緩衝液Aの20〜40μlのリンパ球を再懸濁します。
    3. ライブセルイメージングの設定と取得
      注：システムの多種多様な直立および反転光顕微鏡上で生細胞の蛍光イメージングのために使用することができます。基本的な要件は、蛍光光源、フィルター、CCDカメラ、電動フィルター切替及びシャッター、加熱ステージ（またはmicroscを含みますOPE-マウント加熱室）および自動化された画像取得のためのソフトウェア。このプロトコル高い開口数は、高倍率（ すなわち 、40X、63X）油浸レンズは、必要な空間分解能を達成するために必要とされます。特別な注意は、すべてが必要な340/380 nmの励起波長に対応しているようフラ-2ベースのカルシウムイメージングのための適切な蛍光源とレンズを選択する際に注意する必要があります。 （標準緑と赤の蛍光フィルターセットと互換性のある）別のアプローチは、非ratiomenticカルシウム感受性色素を用いて使用することができる（例えば、フルオ4、Rhod-3）、これらは正確にカルシウムフラックスを定量だけ相対を提供することはできませんけれども/定量的な読み出し。
      1. 顕微鏡システム（操作用PC、顕微鏡、CCDカメラ、フィルターホイールやキセノンランプ）をオンにします。
      2. 指定されたソフトウェアを開きます。
      3. 自動化されたマルチチャンネルタイムラプスイメージングのための顕微鏡/ソフトウェアをセットアップします。広告の逐次取得を含めますifferential干渉コントラスト（DIC）、標準緑色蛍光、標準赤い蛍光を発すると、標準的な340および380 nm励起のFura-2画像。 10〜30秒、〜20〜60分の合計時間の取得のための間隔を設定します。
        1. フラ-2画像の露光時間を設定します。
          1. 新鮮な目的のオイルを追加し、加熱ステージアダプタ上にバッファ-Aのわずか0.5 mlを含む顕微鏡皿をマウントし、すぐに37に平衡オン ℃（〜2〜3分かかります）。
          2. 20μlのピペットを使用してマウント顕微鏡皿室にFURA2ロードされたリンパ球を休んで追加します。
          3. 明視野画像をオンにします。接眼レンズへの光路を選択します。 miscoscope皿の底に接触さの目的を持って来るために粗いフォーカスノブを使用します。皿の底に沈降したT細胞に集中する接眼レンズと微フォーカスノブを使用してください。
          4. 少なくとも10個の細胞を含むフィールドを選択するために、XYステージコントロールを使用します。避けるこれらのようなオーバー混雑フィールドおよび細胞凝集塊は、画像アーチファクトが作成されます。
          5. 蛍光光源に明視野から切り替えます。 CCDカメラに接眼画像から切り替えます。設定取得パラメータ（例えば、露光時間、検出器利得及びビニング）。 Fura2-340とFura2-380画像を休んで、ソフトウェアの取得を使用して（通常〜200〜1,000ミリ秒の範囲で、それぞれに対して同一の露光時間で始まります）。
          6. 各リンパ球のためFura2-340 / Fura2-380を計算するステップ5.4.1で説明した方法を使用してください。平均値は1に近いまで、Fura2-340とFura2-380露光時間を調整する画像を取得し、比率を計算する繰り返し反復を実行します。
        2. MEM-YFPとのDsRedのための露光時間を設定します。
          1. miscroscope皿とステップ5.3.3.1で使用される顕微鏡皿を交換することは、トランスフェクトされた活性化したサグが治療（または未処理;コントロール）を含む細胞培養インキュベーター（ステップ4.5からHLMVECsまたはHDMVECs。1）。予め温めておいたバッファ-Aの〜1ミリリットルの添加により1時間をすすぎ、急速にメディアを削除するには、使い捨てのトランスファーピペットを使用してください。その後吸引し、バッファー-Aの0.5ミリリットルを追加します。
          2. 明るい蛍光陽性のトランスフェ内皮細胞が存在し、整形式間接合部との健全表示されるフィールドを特定します。
          3. MEM-YFPとのDsRedの取得パラメータ （例えば、露光時間、検出器ゲインとビニング）を調整します。各チャネルの平均蛍光シグナル強度が25％と、検出器のダイナミックレンジの75％の間にあることを確認してください。
      4. 生細胞イメージング実験を行います。
        1. 画像の取得を開始し、ベースラインを確立するために、画像のいくつかの間隔をキャプチャするために自動化されたソフトウェアを使用してください。
        2. 取得中に少量（P-5の先端を挿入することにより、顕微鏡皿撮像領域の中心に（ステップ5.2から）の濃縮のFura-2を負荷したリンパ球の〜5μLを適用またはP-20）ピペットゆっくり目的と噴出の中心部に近いメディアへ。
        3. リンパ球は、撮像フィールドに落ち着くように、T細胞、内皮細胞インターフェイス（免疫学的シナプス）ことを保証するために焦点の微調整を行う焦点面に保持されます。 40および63X目的で、フィールドあたり〜10-20細胞が最適です。少数の細胞は、イメージング分野の繰り返しステップ5.3.4.2で認められた場合。
        4. 実験の所望の観察間隔が出場した後、撮影を続けると、すぐに最大のカルシウムフラックス/フラ-2シグナリング信号を誘導するために2μMの最終濃度になるように（5.3.4.2のような技術を使用して）miscoscope皿に直接イオノマイシンピペット（ すなわち 、キャリブレーションの手段は、解析5.4を参照してください。）。
        5. 実験の所望の観測間隔を5.3.4.4afterするための代替を競っているように、すぐにバッファ-Aを吸引し、で5分間0.5mlで固定液（PBS中3.7％ホルムアルデヒド）を交換してくださいRTは、PBSで3回洗浄しました。次に、手順6に進みます。
    4. ライブセルイメージングの解析
      注：取得したファイルを保存した後、それらを直接分析してもよいし、オフライン画像解析ソフトウェアアプリケーションの多種多様な分析のためにエクスポートされました。 ImageJが自由に利用できると、ほぼすべての取得ソフトウェアパッケージと互換性があり、特に貴重な、汎用性の高いパッケージです。ステップ5.1から5.3に記載の撮像実験の設計は、同族のSAgの非存在下および存在下でのリンパ球と内皮APCの間の相互作用の高い空間分解能と時間分解能のダイナミクスが得られます。携帯形態計測/シグナリングダイナミクスの撮像データをアドレス指定する際に、ほとんど無限の分析が可能です。この特定のプロトコルに記載されている具体的な目的は、協調ダイナミックとともにリンパ球の移動およびシグナリング（ すなわち 、動態および細胞内カルシウムフラックスのレベル）を定量化するためにありますアルは、特定の機能（ すなわち 、ILPS / podo-プリント）を中心とした免疫学的シナプスのアーキテクチャに変更されます。個別の標準および非標準のもので、以下の例は、分析（ すなわち 、これらの実験/質問のために特別に開発されました）。
      1. リンパ球のカルシウムフラックスを測定
        1. リンパ球の添加前に取得した初期Fura2-340（340nmのEX-510 nmの EM）とFura2-380（380nmのEX-510 nmの EM）画像を選択します。背景画像としてこれらを使用し、デジタルでそれぞれのチャネルについて時系列の画像のすべてからそれらを引きます。
        2. 各時点についてバックグラウンドを差し引いたFura2-340とバックグラウンドを差し引いたFura2-380画像（すなわち、340nmのEX-510 nmの EM-背景/ 380nmのEX-510 nmの EM-背景）のデジタル比画像を作成します。
        3. 適切なソフトウェア描画ツールを選択します。私の円形領域を描画するために、画面上でクリックしてください各リンパ球の周り（ROI）をnterest。これらは、それぞれのリンパ球と時間枠のピクセル平均比の値を生成します。
        4. 適切なソフトウェアアプリケーション（例えば、スプレッドシートプログラム）を使用して、時間の関数として計算された比をプロットします。フィールド当たりリンパ球の全ての比の値を合計し、各時点でのリンパ球の総数でその値を除算することにより実験の平均カルシウム流束を計算します
      2. lympocyte移行トラッキング分析を実施します。
        1. 各ビデオからDICチャンネルを使用して適切な細胞追跡ソフトウェアアプリケーション（例えば、ImageJの）を用いて細胞のT細胞移動を分析します。 ImageJの細胞トラッキングプラグインを使用して、手動で各プログレッシブフレームでそれをクリックすることで、各フレーム内の各セルの重心を識別します。
        2. O（総距離移行/全区間平均速度を計算するために、結果として得られるシリアルのxy座標（マイグレーション・パスの、すなわち 、トレース）を使用しますf画像）と蛇行（総距離）/最初と最後の画像でセルの場所との間の線形のエンドツーエンドの距離を移動しました。
        3. カルシウムフラックス（5.4.1）セル単位でダイナミックにこれらのパラメータを相互相関します。
      3. IS内Podoプリント/ ILP密度を評価
        1. 各T細胞内に形成されたILPの総数をカウントする定義された間隔（例えば、T細胞の5分後添加）。これらは、リンパ球接着の部位に内皮APC上の細胞質のDsRedにくまで局在同時離散ミクロンスケールの蛍光膜YFPリングを識別することができます。
        2. セル単位でのカルシウム流を有する得られた「ILPインデックス '（5.4.1）のダイナミクスを相互相関します。
      4. podoプリント/ ILP寿命を測定します。
        1. 各podoプリント/ ILPのために与えられた中でILPが表示されていた最後の時間点とその寿命を計算IS - ときにpodoプリント/ ILP Fiの時点をRSTが登場しました。平均ILPは、ISの両方ごとに寿命。
        2. カルシウムフラックス（5.4.1）セル単位でダイナミックにこれらの有効期間は、クロス相関します。
      5. 初期ILPの形成とカルシウム流出の間の時間的関係を評価します。
        1. 各リンパ球のためのカルシウムは、最初のベースライン19より上に上昇する時点（フレーム）を特定します。
        2. 各リンパ球の最初のpodoプリント/ ILPが表示された時点を特定します。
        3. 各リンパ球について初期podoプリント/ ILPのことから初期のカルシウムフラックス時点を減算することにより、「時間オフセット」を計算します。フィールドのすべてのリンパ球の値を平均します。正の値は負の数が反対を示しているのに対し、ILPの形成はカルシウム流入の前に示しています。
          注：これらの実験は、容易に説明さ1として市販の平行壁流イメージングチャンバーを用いて生理学的に関連する層せん断流の下で行うことができます9。

    6.固定細胞イメージングと分析

    1. 固定エンドポイント、T細胞 - 内皮を形成し、染色IS
      1. 1で述べたように内皮細胞を準備し、T細胞を準備します（ - / +のSAg）ステップ5.1のように（トランスフェクション、ステップ5.1.1はオプションです）。培養リンパ球のサンプルを取り、血球計数器（第1節）でカウントすることにより、密度を決定します。
      2. 3分間200×gで15ミリリットルコニカルチューブと遠心分離機に少なくとも3×10 5リンパ球/サンプルにリンパ球の培養液量相当を転送します。上清を除去し、6×10 5リンパ球/ mlのバッファーA（ステップ5.2.1）の濃度でリンパ球のペレットを再懸濁。
      3. 細胞培養インキュベーターから内皮細胞を削除し、連続吸引メディアを（一度に1つずつサンプルを進める）およびリンパ球懸濁液（3×10 5リンパ球/サンプル）の0.5mlで置き換えて、37に置き換えます °C、Incubator。
      4. 適切なインキュベーション時間の後、上述したように、ウェルから培地を吸引し、完全に試料 （例えば、24ウェルプレート中〜300〜500μl）をカバーするために十分な固定液（PBS中3.7％ホルムアルデヒド）を追加します。 5〜10分間室温でインキュベートします。
      5. PBSでサンプルを3回すすいでください。 RTで60分間一次抗体を添加することにより染色（表を参照）。一次抗体は、細胞内タンパク質に向けられている場合、追加の透過化工程を完全に室温で1分間サンプルをカバーするのに十分な透過液（PBS中0.01％トリトンX-100）を添加することにより行う必要があります。 PBSでサンプルを3回すすいでください。 RTで60分間、適切な二次抗体（場合によっては同時に蛍光ファロイジン）を追加します。
      6. 画像スライド上の円形ガラスカバースリップをマウントします。固定エンドポイント、T細胞 - 内皮を形成し、染色されています。顕微鏡ステージ上のサンプルを含むイメージングスライドイメージング場所を開始し、63X油を選択するには目的。新鮮な液浸油を適用します。
    2. 焦点面を見つけるために、明視野撮像モードと接眼レンズを使用してください。落射蛍光に切り替えて、接眼レンズを介して、サンプルを検査します。興味のある分野を選択します。レーザースキャンモードに切り替えます。
    3. 個別に高速走査モードを使用し、可能な最も広い分野での作業は、理想的には、特定の信号強度が少なくとも〜25％、およびダイナミックレンジのない75％以上に達するような信号を最適化するために、各チャンネルのレーザパワー及びゲインを調整します検出器の。
    4. マニュアルフォーカスコントロールを使用して、すぐに（通常は全ての情報のは〜15μmの厚さの中に含まれるべきである）、Z軸をスキャンし、切片の上限と下限を特定します。 〜0.2〜1.0ミクロンの範囲内のZ軸切片厚を選択します。
    5. 最後に、ズーム/関心や行動のスキャンの特定の領域に撮像領域をトリミング。非常に明るく、特定の蛍光SIを有することに加えてサンプル中gnal、高解像度の3Dイメージングを取得するスキャンの反復を必要とし、取得パラメータの調整を行います。目的は、かなりの光退色することなく、最大のx-y、z軸の解像度を得ることです。
    6. 定性的に適切なソフトウェアアプリケーション（例えば、画像j）を介して得られた光学切片のデジタル3D再構成を行うことにより、ISの3次元トポロジーのトポロジーを分析します。同様のアプリケーションを介して定量的に蛍光シグナルの分布を評価する（例えば、ピアソンの共局在と相関蛍光強度ラインスキャン分析と直交閲覧）。

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    結果

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    内皮細胞を使用し、生理的な複雑さとプロフェッショナルAPCの変形能を有する平面脂質二重層モデルの解像度の利点を組み合わせた新たなイメージング手法は、（ 図1）を開発しました。2本で観察された典型的な移行、カルシウムフラックスとトポロジカルダイナミクスの例を示します。図アプローチ。内皮上のサグ不在下でサグ特異的CD4 +のTh1リンパ球が急速に偏光さ、広がり、カルシウムを流動させずに内皮表面（ 図2A）を介して横方向に移動する（図示せず）。 〜5-10分以内に、これらのリンパ球は、内皮を通過する遊出を開始します。彼らが示す、その間、内皮へのSAg搭載の存在下では、リンパ球（すなわち、30〜60分間）は、細胞内カルシウムフラックス（動画1 図2B）持続、「目玉焼き」トポロジーと対称的に広がっ開始しますほとんど、あるいは全くの移行（ 図2...

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    ディスカッション

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    全体的に、このプロトコルは、ⅰ）understudied生理学的なAPCとして内皮細胞を調査するための方法を説明し、ii）の「平面携帯APCモデル」の新規タイプとして。前者に関しては、ますます適応免疫応答16-18を形成する上で（造血APCに比べて、 すなわち ）を、周辺非造血（または「間質'）APCは、重要な、非冗長な役割を果たしていることが理解されるようになりました。このような「セミプロ」のAPC、血管と（非常にプロフェッショナルAPCを上回っ）リンパ管内皮細胞の中では最高の16〜18感謝の一つです。しかし、シグナル伝達事象の詳細とその結合された免疫学的シナプスの大部分は未調査のままです。本明細書に記載の方法は、この新興地域での理解を進めるための基礎を提供します。例えば、個別のadaptivを示すことが知られている別の組織からの内皮上に形成されたISの研究にこれらの方法を適用しますE免疫学的機能 （例えば、肝臓およびリンパ内皮）が特に有益かもしれません。

    重要なことに、この方法は、適応免疫応...

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    開示事項

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    著者らは開示するものは何もない。

    謝辞

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    代表的な画像を生成するための支援をしてくださったPeter T. Sage博士に感謝します。この研究は、C.V.C. (HL104006) に対する NIH R01 助成金によって支援されました。

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    材料

    この記事で使用された材料の一覧
    名前会社カタログ番号コメント
    BDバキュテナーストレッチラテックスフリー止血帯BDバイオサイエンス367203
    BDアルコール綿棒BDバイオサイエンス326895
    BDバキュテイナーセーフティロックBDバイオサイエンス367861K2 EDTA
    BDバキュテイナープッシュボタン採血セットBDバイオサイエンス367335
    RPMI-1640グマ-アルドリッチR8758-1L
    Ficoll-PaqueSigma-AldrichGE17-1440-02使用前にRTに持参
    FCS-OptimaAtlanta Biologicss12450熱不活性化
    ペニシリン-ストレプトマイシンSigma-AldrichP4458-100ML
    トリパンブルーSigma-AldrichT8154-20ML
    ブドウ球菌エンテロトキシンB毒素技術BT202REDPBS
    毒素ショック症候群毒素1技術TT606REDストック溶液1mg / ml
    D Systems247-IL-025PBS
    PBSLife Technologies10010-049
    FibronectinLife Technologies33016-015H20
    HMVEC-d Ad-Dermal MV Endo CellsLonzaCC-2543他のヒト微小血管ECs、すなわちHLMVECs
    EGM-2 MV弾丸キットLonzaCC-3202
    トリプシン-EDTASigma-AldrichT-4174ストック溶液 10x、PBSで希釈
    amaxa-HMVEC-L Nucleofector KitLonzavpb1003ステップ4に必要なキット
    IFN-gSigma-AldrichI3265ストック溶液 1mg/ml in H20
    TNF-alpha 10ug, humanLife TechnologiesPHC3015Stock solution 1mg/ml in H20
    phenol Red-free HBSSLife Technologies14175-103
    HepesFisher ScientificBP299-100
    塩化カルシウムSigma-AldrichC1016-100GH20
    Sigma-Aldrich2083371M H20
    ヒト血清アルブミンSigma-AldrichA6909-10ml
    Immersol 518 F蛍光フリー 液浸油フィッシャーサイエンティフィック12-624-66A
    フラ-2 AM 20x50ugライフテクノロジーズ F1221DMSO
    pEYFP-MEM (Mem-YFP)クロンテック6917-1
    pDsレッドモノマー (可溶性細胞質 DsRed)クロンテック632466
    pDsレッドモノマー メンブレン (Mem-DsRed)クロンテック632512
    pEGFP-ActinClontech6116-1
    Alexa Fluor 488 PhalloidinLife TechnologiesA12379
    ホルムアルデヒド溶液 37%Fisher ScientificBP531-500有毒、フュームフードを使用
    Triton X-100Sigma-AldrichX100-5ML&
    nbsp;ファルコン15mLコニカル遠心分離管フィッシャーサイエンティフィック14-959-70C
    ファルコン50mLコニカル遠心分離管フィッシャーサイエンティフィック14-959-49A 
    ファルコン組織培養処理フラスコT25ッシャーサイエンティフィック10-126-9
     ファルコン組織培養処理フラスコT75ッシャーサイエンティフィ  13-680-65
     コーニング細胞培養処理T175ッシャーサイエンティフィック10-126-61 
    ガラスカバースリップ フィッシャーサイエンティフィック12-545-85 直径12mm
     ファルコン組織培養プレート 24ウェルフィッシャーサイエンティフィック08-772-1
    デルタ-Tプレートバイオテックス04200415B
    ウィートン 使い捨てパスツール ピペットフィッシャーサイエンティフィ13-678-8D
    1.5 ml エッペンドルフチューブ フィッシャーサイエンティフィック05-402-25
     ICAM1 マウス 抗ヒトBD Biosciences555509
    HS1 マウス 抗ヒトBD Biosciences610541
    抗ヒト CD11a (LFA-1α) 精製ebioscienceBMS102
    抗ヒト CD3 Alexa Fluor® 488ebioscience53-0037-41
    抗 MHC クラス II 抗体 Abcamab55152
    抗タリン1抗体Abcamab71333
    抗PKCシータ抗体 Abcamab109481
    ホスホチロシン (4G10 プラチナ)ミリポア50-171-463
    ヌクレオフェクター IIアマクサ バイオシステムステップ 4 に必要なエレクトロポレーター
    ツァイス アクシオバートカール ツァイス マイクロイメージング
    ツァイス LSM510 Carl Zeiss MicroImaging
    Zeiss Axiovison ソフトウェアCarl Zeiss MicroImaging
    NU-425 (Series 60) 生物学的安全キャビネットNuAIRENu-425-600
     フォルマSTRCYCLE 37 °C、5% CO2細胞培養インキュベーターフィッシャーサイエンティフィック202370
    遠心分離機 5810エッペンドルフEW-02570-02
    血球計算盤Sigma-Aldrich Z359629Bright-Line 血球計算盤
    Isotemp Waterbath モデル 202Fisher Scientific15-462-2
    シ毒素 PBSヒトIL-15R&のを使用することができます。 H20 Sigma-Aldrich フィフィックフィック

    参考文献

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