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方法論記事

動静脈瘻の障害の新規マウスモデル：詳細の外科的手順

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DOI:

10.3791/53294

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2016年2月3日

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1Department of Nephrology, Leiden University Medical Center, 2Einthoven Laboratory for Experimental Vascular Medicine, Leiden University Medical Center, 3Department of Surgery, Leiden University Medical Center, 4Division of Nephrology, University of Cincinnati

この記事について

サマリー

ここでは、臨床的に関連性のある吻合構成が組み込まれた動静脈瘻(AVF)不全のマウスモデルを提示します。このモデルは、病態生理学の研究や可能な治療介入のテストに使用できます。

要約

動静脈瘻(AVF)は、不十分なリモデリングと内膜過形成による多数の失敗にまだ苦しんでおり、正確な病態生理学は不明のままです。病態生理学を解明するために、AVF不全のマウスモデルが開発され、吻合の構成が臨床現場での好ましい状況に類似しています。断続縫合糸を使用して、外頸静脈の枝の静脈端を総頸動脈の側に接続することによりAVFが作成されるモデルが説明されました。組織学的レベルでは、失敗したヒトAVFにも見られる静脈流出路の進行性狭窄性内膜病変が観察されました。この手順は、動物の寸法が小さいため技術的に困難な場合がありますが、十分なトレーニングを行った結果、97%の手術成功率を達成することができました。マウスモデルの主な利点は、トランスジェニック動物が利用できることです。AVFの失敗の原因となるさまざまな提案されたメカニズムを考慮すると、血管のリモデリングに関与する可能性のある遺伝子を無効にすることは、AVFの失敗の複雑な病態生理学を解明するのに役立ちます。

概要

機能的な血管アクセス導管は生き続けるために慢性血液透析に依存腎不全患者のために極めて重要です。動静脈瘻（AVF）の建設は、現在、血管アクセスのための好ましい選択肢です。しかし、AVF関連した合併症は、慢性血液透析を受けている患者のための罹患率の主要な原因を構成しています。広範な科学的な努力にもかかわらず、小説のどれもAVFの耐久性の大幅な改善をもたらすでしたAVFへのアクセスに関連した合併症を減らすために近づいていません。この残念​​な進歩の一部は、血液透析アクセス障害の根底にある病態生理の不完全な理解に関係します。

AVアクセス障害の病態生理を解明するために、厳密にヒト病理を模倣する動物モデルは、最も重要です。この点で、動物種だけでなく、吻合部位、必要な抗凝固療法とサージ後のフォローアップの期間ryは、アカウント1に入れなければなりません。大型動物は、新たな治療戦略を開発することを目的とした介入研究のために最も適しているが、マウスモデルは、トランスジェニックマウスの在庫状況によりAV・アクセス障害の根底にある分子メカニズムでより多くの洞察を得るための大きな可能性を持っています。また、マウスの大多数は、より大きな動物での使用に比べて低コストで、この目的のために使用することができます。

AVF障害の最初のマウスモデルはKweiとらによって 2004年に記載された。このモデルでは2、のAVFは、血管内カテーテルを使用して、エンド・ツー・エンドの方法で頸動脈と頸静脈を用いて構築しました。このモデルは、エンドツーエンドの構成及び血管内カテーテルの存在が人間のAVFのためのこのモデルの有効性を制限するが、のAVFの早期静脈適応を研究するのに有用であり得ます。改良されたAVFモデルはCastierやらによって導入された。3最後のました頸動脈は、頸静脈の側に接続されています。しかしながら、血液透析患者でのAVFは通常、動脈の側に静脈の端部をanatomizingによって構成されています。それは導管4内の血行力学的プロファイルを決定するため、AVFの正確な構成は、AVアクセスモデルの重要な特徴です。後者は、機能不全および内膜肥厚（IH）5のその後の発展を内皮細胞への重要な貢献者です。

小説のマウスモデルは、最近、ヒト6で利用されているものと同一の解剖学的構成で開発されました。このモデルでは、AVFは断続縫合で総頸動脈の側に外頸静脈の枝の先端を吻合することにより、C57BL / 6マウスに作成されます。本論文では、複雑な病態を解明することを目的とし、このマウスモデルの普及を促進するために、このモデルの顕微手順に焦点を当てます血液透析アクセス失敗の。

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プロトコル

すべての実験は、ライデン大学医療センターの動物福祉に関する委員会によって承認されました。

1.動物の準備と麻酔

  1. 三から四パーセントイソフルランで満たされた連続麻酔導入チャンバー内のマウス（1-3ヶ月齢）を麻酔。
  2. 首と電気かみそりを使用して、左上の脚の内側部分の腹側を剃ると毛を除去するために、テープ片を使用します。
  3. 両眼に眼軟膏を適用します。
  4. 鼻換気マスクが固定されている加熱毛布の上に動物を配置します。粘着テープを使用して、鼻マスクにヘッドを固定。
    1. 以下の流量で酸素富化空気のセットを使用して1.5-2.0％の濃度でイソフルランを送達：空気0.3リットル/分、100％の酸素0.2リットル/分。麻酔の深さを評価し、必要に応じてイソフルランの濃度を調整するために足の指の間の皮膚をつまみます。
  5. に動物を固定仰臥位℃で約37に設定されているすべての手足に粘着テープで加熱ブランケット。
  6. 0.1ミリグラムの用量で塩化ナトリウム（NaCl）で0.9％に溶解したブプレノルフィンを注入/動物の脇腹に無菌の0.9％NaClを皮下の0.5ミリリットルと一緒kgです。
  7. 準備されたエリアにクロルヘキシジンチンキに0.5％を適用します。

2.皮膚切開

  1. 外科医に向かって頭を顕微鏡下で動物を置きます。
  2. マイクロはさみを使用して、腹側頸部の正中線に約1.5センチ縦切開を行います。
  3. 鉗子で唾液腺をつかみ、それが部分的に傷の外になるまで頭側右の唾液腺を移動させます。

3.静脈を解剖し、準備

  1. 識別し、露骨に拡散することにより、その血管周囲組織から完全に右外頸静脈の背内側枝を分析だけ長辺と血管の方向です。
  2. 解剖静脈の周りにループ（10.0縫合糸）を配置し、それをロックすることなく、1つの結び目を適用します。

4.胸鎖乳突筋の削除

  1. 鉗子を使用して、ぶっきらぼうにその境界線に沿って拡散することによりその周囲から右胸鎖乳突筋を分析。孤立した筋肉の下でオープンピンセットを置き、それが6.0縫合糸で近位および遠位連結。その後、焼灼器を使用して筋肉を切除。

5.共通の頸動脈を解剖し、準備

  1. 鉗子を使用して、右総頸動脈を特定し、解剖。動脈の操作を補助するために、動脈の周りに6.0縫合糸を配置します。
  2. 遠位および近位に可能な限り血管クランプを適用します。
  3. 特殊なマイクロシザーを用いて約1ミリメートルの動脈の真ん中に縦切開を行います。
  4. リンスヘパリン溶液[100 IU / mlの]と動脈血管が血液の透明になるまで。
  5. 必要に応じて幅を血管クランプ[1.1ミリメートル]を一致させるために切開の長さを測定し、調整します。

静脈の6.ライゲーション

  1. 近位にすでに準備静脈の血管クランプを適用し、静脈の周りに縫合糸を配置します。
  2. 以前に配置した10.0縫合糸を使用して、できるだけ遠位静脈を縫合糸上に配置され、ライゲートされた止血を使用して静脈に優しい尾トラクションを適用します。
  3. ライゲーションにちょうど近位にはさみを使用して静脈をカットします。
  4. 血管鉗子を使用して、静かに静脈の内腔を開き、ヘパリン溶液[100 IU / mlの]でそれをすすいでください。

吻合パート1の7の作成

  1. 6 O 'で縫合糸に続く12時の位置に2平方ノットを使用して結節縫合（10.0）と動脈に静脈を接続しますクロック位置。それは自身の軸の周りに回転させることなく動脈に静脈を接続してください。外科的露出を改善するために動物を回転させます。
  2. 静脈の周りに縫合糸を配置し、止血を使用して穏やかな横方向のトラクションを適用します。
  3. 同じ結節縫合を使用して、吻合の可視腹側で約3-4追加の縫合糸を配置することによって、吻合を完了します。

8.ヘパリン投与

  1. 加熱ブランケット180度回転し、左上肢に顕微鏡の焦点を合わせます。
  2. 上肢の内側部に縦方向に実行され、皮膚を通して見ることができる血管構造を探して、大腿静脈/動脈/神経束を特定します。直接、長手方法で大腿静脈上記の約1cmのマイクロハサミで切開を行います。
  3. 慎重に大腿静脈の血管周囲の組織を解剖し、線量Oでヘパリンを注入大腿静脈で0.2 IU /グラムの体重F。

吻合パート2の9創出

  1. 首のエリアに戻り、静脈の周囲に配置された縫合糸を除去します。
  2. その後、静脈の上にして、再度頸動脈の下、頸動脈の下を通る縫合糸（6.0）を配置します。 （ 図1L）
  3. 静脈血管クランプを取り外します。
  4. 次に、同時にねじることによって時計回りに頸動脈の軸に沿って180°動静脈瘻を完了半分の両方の血管クランプをねじると、縫合糸の端部に内側トラクションを適用します。
  5. ステップ7.2で説明されているのと同じやり方で吻合を完了します。

10.血管クランプの取り外し

  1. 縫合糸を外し、血管が180°反時計回りにクランプ回転させます。
  2. 近位血管クランプ続い遠位血管クランプを取り外します。
    3. <李>は優しく、血管鉗子で静脈流出路を閉塞することにより、吻合の開存性を評価します。特許吻合の場合は、事前に閉塞静脈セクションでは、脈動的に拡大していきます。鉗子を使用して、元の解剖学的位置に右の唾液腺を再配置します。

11.皮膚閉鎖と術後ケア

  1. 中断のない縫合糸（6.0）と上肢の皮膚を閉じます。
  2. 中断のない縫合糸（6.0）と首の皮膚を閉じます。
  3. 加熱ブランケットから動物を削除し、0.5ミリリットルのNaClを0.9％を皮下に注入します。
  4. 加熱ランプで加熱して暗くケージに動物を置き、それが完全に回復しましょう​​。動物が完全に回復しない場合には、それが原因で手術領域の出血に血行動態ショックを受けないことを確認してください。このような腫れ首や血液の漏れなどの兆候を探してください。
  5. buprの最初の注射後約6時間後enorphine、さらに72時間、十分な鎮痛を提供するために、製造業者によって推奨される用量におけるブプレノルフィン皮下の徐放性製剤の単回投与を注入。

12.組織の収穫

  1. メデトミジン（0.5ミリグラム/キログラム）とフェンタニル（0.​​05ミリグラム/ kg）を腹腔内投与し、麻酔薬の混合物を含有ミダゾラム（5mg / kg）で動物を麻酔。
  2. 非加熱シリコンマットにその足や頬を通して針を挿入することにより、仰臥位で動物を固定。
  3. マイクロはさみで首に傷跡の上に約1.5〜2.0センチメートルの切開を行います。
  4. AVFを分析し、簡単に識別proximal-、遠位動脈と静脈流出路の周りに縫合糸（6.0）を配置。
  5. プロトコルのセクション10.3に記載されているようにAVFの開通性を評価します。
  6. 内側開腹のuを実行することにより、腹膜腔を開きますマイクロシザーを歌います。
    1. 鎖骨中央線に尾側開始ハサミを使用して、左右の腹側胸郭を切断。マイクロはさみを使用して、腹側胸郭の中央部に取り付けられ、その後、ピンセットを用いて頭蓋このセクションを変位されるダイヤフラムを横断。
    2. 下大静脈を見つけ、マイクロはさみでそれを横断します。
  7. 左心室に針23ゲージ針を挿入し、血管内の流体がほぼ透明になるまで約100 mmHgでの圧力で、PBSで灌流。
  8. 針を除去することなく、今は約100 mmHgの圧力で10分間、4％ホルマリンで灌流。
  9. マイクロハサミで動脈と静脈の両方を横断することにより、AVFを切除し、4％ホルマリン溶液O / Nでそれを沈めます。

13.組織の埋め込みとセクショニング

  1. 製造者のprotocoに従ってパラフィンために組織を処理リットル。適用されるプロトコルは、以下のとおりであります。
    1. RTで1時間、エタノール70％に浸します。 2回繰り返します。
    2. RTで1時間、エタノール96％に浸します。 2回繰り返します。
    3. RTで1時間エタノール99.5％に浸します。一回繰り返します。
    4. RTで1.5時間、エタノール99.5％に浸します。
    5. RTで1時間キシレン中に100％を浸します。一回繰り返します。
    6. 62℃で1時間、パラフィンに浸し。 2回繰り返します。
  2. 静脈流出路は、包埋カセットに垂直に配向されるように、パラフィンにAVFを埋め込みます。
  3. ミクロトームを用いて、それぞれが5ミクロンの厚さで30のセクションからなる12連続切片を作成します。そして、各シリアルセクションの、吻合部に​​近い領域で始まる整然と12までの位置1から始まる単一のマウントガラス上の1つのセクションを配置します。

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結果

吻合（ 図1）を作成した後、開存はまもなく血管鉗子で静脈流出路を閉塞することによって評価されるべきです。吻合は、特許である場合には、閉塞に対する血管管の近位は明らかに拍動の方法で展開する必要があります。さらに、開通性を効果的に血管造影（ 図2）として機能する近赤外蛍光透視法（NIRF）を使用して確認されます。 （図2）に示されているように外科手術の失敗は、吻合部の閉塞をもたらすことができます。この障害は狭すぎる吻合領域、血管のねじれ、不十分なヘパリン投与量または裏側に吻合の正面側を接続する偶発的縫合糸の配置によって引き起こされる場合があります。

組織学的レベルでは、AVFにおける血管リモデリングのプロセスはエレガントなこのモデルを用いて調べることができます。 AVFにおける血管リモデリングはの結果として起こります血流および圧力の増加。マウスでは、この応答は、手術後最初の2週間での管腔面積の増大をもたらす（例えば、外側に改造）円周の増加によって特徴...

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ディスカッション

AVFは、血液透析治療でアキレス腱であると考えられます。残念ながら、AVFはまだ失敗8-10の高い数に苦しんでいます。根底にあるメカニズムに関する広範な研究にもかかわらず、正確な病態生理は不明のまま。 AVFの故障のための多数のマウスモデルは、既に文献2,3,11,12に記載されています。しかし、これらのモデルはいずれも、ほとんどの臨床状況で使用されている動脈側吻合構成に静脈末端を組み込むません。得られた血行力学的プロファイルは、血管リモデリングにおいて重要な役割を果たしているので、これは非常に適切です。また、モデルのいくつかは、臨床現場で使用されていない動脈と静脈2,11の間の接続のための合成カフを使用していました。

臨床的関連性を改善するために、我々は、したがって、動脈側吻合部への一方的な静脈端がjuguの枝の間に作成されたマウスモデルを開発しましたLAR静脈および結節縫合6と共通の頸動脈。このモデルでは重要な組織形態学的変化は、外側に、最終的にAVFの故障につながる、内膜肥厚を改造し、プ...

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開示事項

著者らは、開示することは何もありません。

謝辞

この研究は、オランダ腎臓財団（KJPB 08.0003）からの助成金によって支援されました。

Carolien Rothuizenは、彼女の研究への貢献が認められています。ホアン・ファムは、病理学の精密検査への支援で認められています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
解剖microsocpeライカM80
鉗子Medicon07.61.25
血管鉗子S&TJFL-3D.2
血管鉗子S&TD-5a.2
鉗子RobozSS/45
マイクロハサミ 5mm刃ファインサイエンスツール15000-08
マイクロハサミ 2mm刃ファインサイエンスツール15000-03
ハサメディコン05.12.21
クリップアプライヤー 1S&TCAF-4
血管クランプ 1S&TB-1V
クリップ アプライヤー 2BBraunFE572K
血管クランプ 2BBraunFE740K
止血鉗子BBraunBH110
10.0 縫合糸BBraunG1117041
6.0 縫合糸BBraun768464
焼灼器ファイン サイエンス ツール18010-00
ニードルホルダーMedicon11.82.18
眼軟膏Pharmachemie41821101
クロルヘキシジンチンキ剤 0,5%ライデン大学医療センターNA
ヘパリンレオ ファーマ012866-08
ブプレノルフィンRB ファーマシューティカルズ 
イソフルランPharmachemie45,112,110
麻酔マスクマーストリヒト大学カスタムメイド
ミダゾラムActavisAAAC6877
デクスメデトミジンオリオン141-267
フェンタニルビファーマ15923002
連続麻酔薬導入チャンバーVet-techソリューションAN010R
ミ 283732

参考文献

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