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方法論記事

高スループット

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DOI:

10.3791/53297

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2016年1月27日

 , 
1Department of Molecular Physiology and Biophysics, Vanderbilt University Medical Center, 2School of Animal and Comparative Biomedical Sciences, University of Arizona

この記事について

サマリー

ゼブラフィッシュは、エネルギー恒常性の研究にとって重要なモデル生物です。 NADH2感受性酸化還元インジケーターであるalamar Blueを利用することで、ゼブラフィッシュの幼生の代謝率を96ウェルプレート形式で測定するアッセイを開発し、薬物や遺伝子の発見に適用することができます。

要約

ゼブラフィッシュは、ゼブラフィッシュエネルギー恒常性と肥満の研究に広く適用モデルにする可能性を持っている固有の利点と重要なモデル生物です。ゼブラフィッシュの小さなサイズは、96または384ウェルプレート形式で実施される胚でのアッセイを可能にする、モルホリノ及びCRISPRベースの技術は、バス・アプリケーションによって遺伝子操作の容易性、および薬物治療を促進する実行可能です。また、ゼブラフィッシュは、新規遺伝子の発見を可能にし、前方の遺伝子スクリーニングに最適です。肥満のモデルとしてゼブラフィッシュの相対的新規性を考えると、それは完全にこれらの利点を活用するツールを開発することが必要です。ここで、我々は同時に、胚ゼブラフィッシュの数千にエネルギー消費を測定するための方法が記載されています。我々は個々の魚を隔離するために96ウェルプレートを使用した全動物のマイクロプレートプラットフォームを開発していると我々は、市販の細胞培養の生存率の再を使用して、累積NADH 2産生を評価しますエージェントアラマーブルー。 poikilothermsでNADH 2生産とエネルギー消費の関係が緊密にリンクされています。このエネルギー消費アッセイは急速に直接エネルギー消費を変更するか、適用された薬剤（例えば、インスリン増感剤）に対する応答を変化させる薬理学的または遺伝子操作をスクリーニングする可能性が作成されます。

概要

マウスは現在、肥満研究のための主要なモデルです。ショート発生間隔とマウスで利用可能な遺伝子ツールは、これまでに比類のないされています。しかし、ゼブラフィッシュも短く発生間隔があり（3から4ヶ月）と遺伝子操作1,2の容易さであっても、マウスを凌駕しています。これまでの遺伝子と薬剤スクリーニング3で使用するための子孫と潜在的な数でマウスを越えるとゼブラフィッシュは、哺乳動物遺伝子の約90％を維持しています。

肥満研究のためのゼブラフィッシュモデルの可能性をタップするには、アッセイは、エネルギー消費を含む体重調節に影響を与える要因を調査するために開発されなければなりません。代謝産物は、β酸化によって処理され、トリカルボン酸サイクルの酸素が ​​消費され、NADH 2が生成されます。このように、NADH 2は、代謝経路（代謝物の酸化）を介して、代謝物のフラックスの直接的な指標です。 poikilで恒温動物4に比べて5倍低い- otherms、H + ATP合成からNADH 2酸化を脱共役ミトコンドリア内膜、漏れるは、4です。したがって、2ゼブラフィッシュNADHには非常にしっかりと酸化的リン酸化を介してATP産生にリンクされています。ここで、我々は、エネルギー消費5のプロキシとして幼虫のゼブラフィッシュにおけるNADH 2産生を測定するアッセイを説明します。

酸素消費量は、エネルギー消費を測定するためのゴールドスタンダードです。しかし、最高のゼブラフィッシュの高スループットの可能性を活用するために、エネルギー消費のアッセイは、ハイスループットに従順でなければなりません。密閉チャンバー循環系に依存酸素消費システムは、利用可能なチャンバ6の数でスループットが制限されます。外気O 2消費量/ CO 2産生のアッセイはまた、ゼブラフィッシュ5,7に適用されています。これらのオープンエアの96ウェルプレートベースDシステムは、ハイスループットに適しています。残念ながら、環境とのガス交換は、これらのアッセイの感度を制限します。我々は最近、酸化還元指示薬アラマーブルー5を使用して、NADH 2をモニターするアッセイのアプリケーションを発表しました。このアッセイは、スループットおよびゼブラフィッシュにおける酸素消費量の分析に共通の感度の限界を克服します。

ゼブラフィッシュは、全身のエネルギー恒常性の研究のためにますます重要なモデルとなってきています。一部では、ゼブラフィッシュため、前方の遺伝子スクリーニングおよび薬物スクリーニングでの使用に適しています。また、ノックダウンとノックインを含む遺伝子操作を、ターゲットに、迅速に適用することができます。我々は以前に、このアッセイは、化合物および代謝率5を変更する遺伝子を同定するためにバス薬物適用および遺伝子ノックダウンまたはノックアウトと組み合わせることができることを示しています。さらに、このアッセイは、ゼブラフィッシュに固有の高スループットの利点を活用するように設計されています。

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プロトコル

注：このプロトコルは、研究の責任ある行動のためのアリゾナ大学の事務所のガイドラインに従っており、施設内動物管理使用委員会によって承認されました

1.ゼブラフィッシュの繁殖や胚のメンテナンス

  1. E3胚媒体 8 を準備します。 60Xストック溶液を作るために、1.95 L ddiH 2 O中に34.8グラムのNaCl、1.6グラムのKCl、5.8グラムの塩化カルシウム2●2H 2 O、および9.78グラムのMgCl 2●6H 2 Oを溶解ddiH 2 Oを使用して、2リットルにボリュームを調節NaOHおよびHClを用いてpHを7.2に調整します
  2. 1倍のE3胚の培地を調製するために、1 L ddiH20に16.5ミリリットル60倍株式を希釈します。 100μlの1％のメチレンブルーを追加します。
  3. 育種
    1. ハウス男性と女性ひな株式（7 - 生後18ヶ月）を別々に繁殖力を最大限に高めることができます。
    2. 卵が所望される前日に前に2時間 - 1からライトをオンにします。 C言語で - セットアップ交配（2人の女性1男性と1）以前に9に記載されているようにケージをrossing。彼らは大人の魚は保持されたタンクインサートの穴あきベースを通過する卵が捕食を逃れるためにするための横断ケージができます。
    3. オプション：時限繁殖のために、（モルホリノ注入を含む研究のために必要とされるように）、透明なプラスチックの分周器によって、オスとメスの魚を分離し、卵と受精のタイミング敷設をもたらすことが午前中にこれを削除してください。モルホリノ研究のために、治療ごとに必要な魚の胚の数を評価するためにパワー計算を実行します。効果や変動の大きさの推定値がなければ、予備試験では、N = 8で実行することができます。
  4. （ - 150胚/ 10cmのペトリ皿100）ペトリ皿に交差ケージから卵を注ぎます。卵は皿の底に沈殿し、水を注ぎ出すようにします。先端の細い使い捨てのトランスファーピペットを用いて、残りの水を除去します。ステップ1.1で行われたE3の胚培地を追加し直します。
  5. AFを作ります将来卵や魚転送用のラメポリッシュ使い捨てピペット。はさみを使用して、0.25ミリリットルの卒業で卒業使い捨てトランスファーピペットをカット。ラフなエッジを削除するには、炎はブンゼンバーナーの上にカットチップを磨きます。
  6. ゼブラフィッシュのE3胚の培地中のペトリ皿28.5○Cで受精後10センチメートル中（DPF）4日に胚魚を維持1日2回、洗練された火炎を使用するすべての未受精卵または死ん胚（不透明な白い外観）を除去するために使い捨てのトランスファーピペットを卒業。 1日に1回、E3胚培地を交換してください。 E3の胚培地を捨て、先端の細い使い捨てのトランスファーピペットを使用して残りの液体を除去し、予め温めた（28.5○C）のE3胚培地を再度追加。

2.アッセイ溶液を調製

  1. 0.22μmのフィルターを使用して、表1の無菌フィルターアッセイ溶液によるアッセイ溶液を調製します。アッセイ開始前に、28.5○Cで滅菌アッセイ溶液を温めます水浴。
成分合計の％ 容量（μL/ 10ミリリットル）
60X E3胚培地 1.667 166.7
二重脱イオン（DDI）、H 2 O 96.233 9623.3
アラマーブルー 1 100
400mMのNaOHを 1 100
DMSO 0.1 10

表1アッセイ培地

3.アッセイを行います

  1. ゼブラフィッシュの胚を滅菌濾過したのE3胚培地で3回洗浄します。クラッチからのすべての実行可能なゼブラフィッシュの胚をビーカーに結合します。滅菌フィルタ75ミリリットルのE3胚培地。先端の細い使い捨てトランスファーピペット、再使用できるだけゼブラフィッシュ胚からのE3胚培地の多くを移動します。 20ミリリットルに戻って濾過滅菌のE3胚培地を追加します。削除およびE3胚培地を3回交換してください。
  2. 96ウェル黒色の93ウェルの各々にプレート1魚は明確な底板を両面。個別に炎の中に胚を捕捉することにより、プレートに胚魚を移し卒業プラスチック使い捨てトランスファーピペット（ステップ1.5）を研磨し、優しくウェルに放出します。 3ブランクウェルにすすぎ、魚の入ったビーカーから取り出したのE3胚培地を転送します。これは、ブランクウェルには魚が含まれている井戸とまったく同じ水にさらされていることを保証します。魚やブランクウェルを含める両方ウェルは、このステップの終了時（200μl）を1/2以上完全でなければなりません。
  3. ブランクウェルを含む96ウェル全てにおいて、アッセイ溶液でのE3胚培地を交換してください。このステップは、96ウェルプレート中12各列の時に1列を実行する必要があります。先端の細い使い捨てのトランスを使用しましたFERピペットは、プレートの1列（8ウエル）ですべてのウェルからのE3胚培地を除去します。ゼブラフィッシュの胚には手を触れないように注意してください。水を除去しただけでなく、そこからそれぞれにアッセイ溶液を300μlを追加します。プレートの全12列のためのアッセイ溶液でのE3胚培地と交換の除去を繰り返します。
  4. オプション：化合物に応答した代謝率の変更をテストするには、100倍（100X）所望の治療濃度で溶液を作製。注目すべきは、100X溶液は0.1％を超えないように、最終DMSO濃度を制限するために10％のDMSOを超えないことを保証します。治療の各ウェルに100倍液の3μLを追加します。
    注：処理ウェルの数を評価するために、電力の計算を実行します。しかし、応答または変動の大きさの推定値なしに、予備試験は8化合物で処理し、魚が含まれている8ビヒクル処置対照ウェルで実行することができます。
    1. （コントロールに何のDRUを車両制御の3μlを添加していませんグラム処理）魚が含まれている井戸。化合物に対する蛍光応答が魚内のアクションの結果であることを保証するために、96ウェルプレートに3ブランクウェルに薬物および車両の治療を適用します。
  5. 590 nmで530 nmでの励起波長および発光波長で蛍光プレートリーダー上の魚満たさプレートをお読みください。
  6. 28.5○C（アッセイ溶液の光退色を避けるために、アッセイ全体の暗闇の中でプレートを維持する）に設定加湿インキュベーターに置きプレート。アッセイは、1時間から24時間の範囲の時間の持続時間のために実行することができます。アッセイの持続時間は、研究の目的に依存します。短い期間が最も適切である短時間作用型非安定な化合物への応答をテストするため。しかし、安定した化合物の検査や遺伝的影響のテストのために、分析時間を最大にすることの累積信号に関連する利点を活用することが好ましいです。
  7. 所定の時間点で（タイミングを判断するためにステップ3.6参照）ステップ3.5と同じ設定で、再び魚で満たされたプレートの蛍光を読み取ります。

4.治療と蛍光関連の相対的変化を評価します

  1. 研究の結論での蛍光から時間0での蛍光を差し引くことにより、各ウェルの蛍光の変化を計算します。魚ないウェル（ブランク）はるかに魚が含まれているウェルからの値の下に、0に近い値を持つ必要があります。
    時間0での蛍光 - 終了時に蛍光=蛍光の変化
  2. 対照ウェルは、その後、コントロールウェルの蛍光の平均変化によって、各ウェルの蛍光の変化を分割するための蛍光の相対的変化を確認するために、蛍光の平均変化を計算します。注目すべきは、コントロールは、車両コントロールまたは遺伝的コントロールのどちらかである可能性があります。
    figure-protocol-1

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結果

アッセイ溶液は、胚魚（ 図1）の非存在下で蛍光を増加させません。しかし、このアッセイは、ウェル内の代謝率の小さな変化に非常に敏感です。ウェル内の単一の魚は1時間（P <0.0001）内のブランクウェルと著しく異なる信号を生成する。 図2は、インキュベーションの24時間後に胚魚によって生成された信号を視覚的に表現しています。この写真の目的のために明確な両面ウェルを用いました。しかし、黒側のウェルは、近くのウェルからの蛍光シグナルの浸出を防止するために、アッセイの性能のために好ましいです。

アラマーブルーのNADH 2誘導性の減少は非可逆的であるため、信号は時間とともに蓄積します。小さな変化が増幅されることを可能にします。差が蓄積​​し、従って時間と共に増加することを示すために、我々は、（2、1で1〜5の魚によって誘発される蛍光の相対的な変化を監視し、4時間図3）。魚/ウェルの蛍光の相対的変化の各​​番号にはかなりの時間（P <0.001）と増加しました。信号が時間とともに蓄積するので...

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ディスカッション

細菌や真菌の混入が大幅にこのアッセイの適用を制限します。 E3胚培地中でメチレンブルーは、真菌汚染の可能性を制限します。胚全体に飼育ケアは毎日二度死んだ胚を除去するために取られることが重要です。加えて、徹底的に分析開始の日に、無菌のE3胚培地で胚を洗浄することが不可欠です。これらの2つのステップは、胚の細菌汚染の可能性を制限します。ステップ3.2に記載のブランクウェルを含めることは、任意の細菌汚染の検出を可能にします。測定可能な信号を生成する細菌汚染は稀です。ブランクウェルには強いシグナルを示して行う場合は、アッセイは、胚の清浄度を維持するために注意しながら繰り返されるべきです。ユーザーは汚染が前胚コレクションに起因していることを想定している場合、胚は、先に説明した（p。22）10として漂白することができます。また、実験者はそれを疑う場合汚染は、ユーザーが4 DPF（P。23）10に後方にペニシリンおよびストレプトマイシンを胚をE2を使用することができ、コレクションの後に発生されます。

このアッセイは胚におけるアプリケーションの価値がある...

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開示事項

著者らには、開示すべき競合する金銭的利益はありません。

謝辞

著者は、以前に発表されたこのアッセイの適用を検証するための貢献に対して、Roger Cone博士とChao Zhang博士に感謝したいと思います。 本研究は NIH 1F32DK082167-01 (BJR) の支援を受けました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
AlamarBlueFisher Scientific10-230-103Thermo Scientific
Fine Tip DisposableTransfer PipetteFisher Scientific13-711-26Thermo Scientific
Fisherbrand製造 目盛り付き使い捨てトランスファーピペットFisher Scientific13-771-9AMThermo Scientific
ブラックサイドクリアボトム96ウェルプレートフィッシャーサイエンティフィック50-320-785E&製Kサイエンティフィックプロダクツ株式会社
製

参考文献

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