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方法論記事

Cortex-、Hippocampus-、Thalamus-、Hypothalamus-、横中隔Nucleus-と線条体固有

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DOI:

10.3791/53303

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2016年1月18日

 , 
1TARC (Translational Animal Research Center), University Medical Center, JGU Mainz

この記事について

サマリー

このプロトコルは、子宮内エレクトロポレーションを介してC57BL/6中枢神経系の異なる領域を特異的にトランスフェクションする方法を詳細に説明しています。このプロトコルには、皮質、海馬、視床、視床下部、外側中隔核、線条体に発達する領域のトランスフェクションに関する詳細な指示が含まれています。

要約

子宮内エレクトロポレーションは、げっ歯類の中枢神経系の様々な遺伝子を迅速かつ効率的に時空間的に操作するために広く使用されている技術です。目的の遺伝子の過剰発現は、shRNAを介した機能喪失研究と同様に可能です。したがって、幅広いアプリケーションを提供します。異なる領域の特定の細胞を標的とする実現可能性は、この非常に有用な方法の潜在的な適用範囲をさらに拡大します。特定の領域を効率的にターゲットにするには、胚期、印加する電圧、そして最も重要な電極の位置など、微妙な点に関する知識が不可欠です。

ここでは、C57BL/6マウスの中枢神経系のいくつかの領域の特異的かつ効率的な子宮内エレクトロポレーションを可能にする詳細なプロトコルを提供します。特に、脾臓後皮質、運動皮質、体性感覚皮質、梨状皮質、角アンモニス1-3、歯状回、線条体、外側中隔核、視床、視床下部に発達する領域をどのようにトランスフェクションするかが示されています。適切な胚期に関するこの情報のために、対応する胚期の適切な電圧が提供される。最も重要なのは、正極の適切な位置を示す角度マップが描かれていることです。この標準化されたプロトコルは、効率的な子宮内エレクトロポレーションを促進するのに役立ち、動物の数を減らすことにもつながる可能性があります。

概要

3独立したグループ1-3により2001年に最初の記述以来I N 子宮内エレクトロポレーションは、齧歯動物の中枢神経系における遺伝子発現を分析するために広く使用されている標準的なツールとなっています。継続的に技術、まだ時間とお金がかかり、そのシンプルさに起因する子宮内エレクトロポレーションのアピールを改善するにもかかわらず、であるノックアウトマウスの作製に比べ。だから、 子宮内エレクトロポレーションは、高速かつ効率的gain-や機能喪失研究4を可能にします 。

脳の領域をトランスフェクトするために、負に帯電したプラスミドを含有する溶液を脳室に注入されます。電気パルスの間に、負に荷電したDNAは、正極に向かって移動するので、トランスフェクトされた領域は、正極の位置を変更することによって簡単に選択することができます。これは、頻繁に、中枢神経系の多数の領域がTAであることが示されています3,5-8を rgeted。例えば、最近の研究では、海馬、梨状皮質や線条体9-11の具体的なトランスフェクションを示します。しかし、適切な位置についての情報は、多くの場合のみ、ほとんど標準化されず、常に異なるマウス系統に転送することは容易ではありません。

特定胚の段階のトランスフェクションは、些細なほど遠いです。 子宮内エレクトロポレーションの特定のためのセットアップを選択する際に多くの影響を与える要因を考慮する必要があります。まず、最適にそれぞれの胚の段階をトランスフェクトするために、適切な電圧についての知識が必要とされています。低電圧は、トランスフェクション効率2,3,12を減らす一方、高電圧は、生存率を低下させます。また、電極パドルのサイズが減少した特異性には大きすぎる結果であるか、心臓の鼓動4,12,13の影響に起因する死亡を引き起こす可能性があり、電極パドルを使用するため、重要な役割を果たしています。適用されました電圧と大きさと電極パドルの位置が考慮すべき最も重要な機能であるが、DNA-液の塗布量のように、エレクトロポレーションの結果に影響を与えるさらなる要因もあります。

我々は、C57BL / 6 マウス 12の様々な脳の領域の迅速かつ効率的なトランスフェクションを可能にする詳細なプロトコルを開発しました。このプロトコルでの電圧についての詳細な情報を使用する、強化特異用電極パドルのサイズが提供されます。さらに、心室についての情報は、プラスミド溶液の量についての勧告に沿って満たされると、電極の位置が供給されています。マップ内の詳細な位置情報の表示、これらの位置のさらなる可視化は、脳梁膨大後部皮質の子宮内エレクトロポレーション、運動皮質、体性感覚皮質、梨状皮質、トンで簡単な特定かつ効率的に可能彼は1-3、歯状回、線条体、横中隔核、視床および視床下部ammonisコルニュ。

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プロトコル

倫理声明：マウスの​​取り扱いおよび実験手順は、動物のケアのためのヨーロッパ、国および施設のガイドラインに従って行いました。

1. 子宮内エレクトロポレーション

注意： 子宮内エレクトロポレーションでは 、以前に公開12,14のように行きました。したがって、この方法は、以下の（ 図1）に簡単に説明します。

  1. 準備
    1. 以前に12を説明したように（1,5のpCAGGSを含む）ファストグリーン色のエンドトキシンを含まない高度なトランスフェクショングレードのプラスミド溶液を調製します。
    2. 注射用（35°の角度）ホウケイ酸ガラスキャピラリー（0.8から0.9直径）を引いて、挽きます。
    3. 楽器を滅菌します。
  2. 手術
    1. 手術を開始する前に、鎮痛薬（カルプロフェン、4ミリグラム/ kg体重、皮下、24時間デポ）は、少なくとも30分を管理します。
    2. の長さにしてください35〜45分（ - Guedel 15に記載の外科手術用麻酔の段階-最大25〜30分ステージIII）の最大値に麻酔。
    3. イソフルラン（：2.8％、マスクを介した手術：2.5％チャンバー内の誘導）と時限妊娠マウスを麻酔。つま先ピンチに無反応によって麻酔を確認してください。
    4. 麻酔中目の乾燥を防ぐために、眼軟膏を適用します。
    5. 7.5％ - イオジン溶液を用いて手術領域を滅菌し、露出しただけ手術領域を持つ（0.9％ベンジルアルコール食塩水で湿った）、滅菌ガーゼでマウスをカバーしています。
    6. （：1.5〜2センチメートル、筋肉の切開：1〜1.5センチの皮膚切開）メスで腹腔を開きカット。
    7. 獣医スタッフや委員会の指示通りに温め、0.9％ベンジルアルコール食塩水または他の滅菌等張溶液で湿らせ乾燥から開か腹腔を保持します。
    8. リングピンセットを用いて（子宮角を慎重に抽出し、指で子宮に手を触れないでください秒）。
  3. DNA及びエレクトロポレーションの注入。注：特定の領域を標的とするための正確な詳細は、セクション2に示されています。
    1. 準備されたホウケイ酸毛細血管を経由して、図1および2節で示したようにゆっくりと心室に着色されたDNA溶液を注入します。
    2. 特殊な鉗子型白金電極を経由して対応する胚期（E14用例えば、36〜38 V）（インターバル周期長50ミリ秒、間隔休止950ミリ秒）のために適切な電圧を適用します。子宮壁の損傷を最小にするために、電圧の印加中にエレクトロポレーションパドルパルス。
  4. ポストエレクトロポレーション/術後ケア
    1. 慎重に腹腔内に子宮角を交換してください。
    2. 別々に筋肉と皮膚切開を縫合。
    3. 回復のための熱支持装置上でマウスの残りをしましょう​​。
    4. リカバリ中にマウスを監督（行動、フィード、水の消費量）、手術後4時間、24時間および48時間。必要に応じて、さらに2日間追加の鎮痛薬（カルプロフェン、4ミリグラム/ kg体重、24時間デポ）を適用。

特定の脳領域の2トランスフェクション

注：正極の位置は、DNA溶液（右または第三脳室）と正極の位置で満たされた心室を通る垂直中心線との間の角度として示されています。左心室を充填するときの位置がミラー反転されています。 図4に耳原始の位置が重要な基準点を提供する、示されています。

  1. 皮質領域のトランスフェクション（ 図2A、表1）。
    1. 1.2節で説明したように手術を行います。皮質領域の子宮内エレクトロポレーションのためにE14の胚を使用しています。
    2. 右側脳室に4μgのDNAを含有する1.5〜2μlのDNA溶液を注入準備されたホウケイ酸毛細血管を経由して。
      1. 穿刺部位上の目に見える血管が存在しないように慎重にリングピンセットを使用して胚を置きます。
      2. ゆっくりとラムダ縫合から約0.75ミリメートル冠状と矢状縫合（ 図3）から0.5ミリメートル、横DNA溶液を注入します。挿入深さが1.2ミリメートル（子宮壁から測定E14）であることを確認してください。シャープな境界と青緑色の着色のために確認してください。
    3. 特殊な鉗子型白金電極（間隔周期長50ミリ秒、間隔休止950ミリ秒）を介して電圧を適用します。
      1. 3または5ミリの電極パドルを使用してください。
      2. 36-38 Vからまでの電圧を使用してください
      3. 電極耳原基のちょうど前方の中央に配置します。
      4. 、330から0°から脳梁膨大後部皮質の使用角度をトランスフェクトするために、運動野0-40°をトランスフェクトし、トランスフェクションするために、体性感覚皮質40〜95°をトランスフェクトします梨状皮質95-110°（ 図2A）。
    4. 1.4節で説明したように、ポストエレクトロポレーション/術後ケアを行います。マウスを生け贄に捧げるとセクション3で説明したように4日間エレクトロポレーション（E18）後の胚を分析します。
  2. 海馬（ 図2B、 表1）のトランスフェクション。
    1. 1.2節で説明したように手術を行います。海馬体の子宮内エレクトロポレーションのためにE15の胚を使用しています。
    2. 準備されたホウケイ酸毛細血管を経由して右側脳室に4μgのDNAを含有する2μlのDNA溶液を注入します。
    3. 特殊な鉗子型白金電極（間隔周期長50ミリ秒、間隔休止950ミリ秒）を介して電圧を適用します。
      1. 3または5ミリの電極パドルを使用してください。
      2. 38-40の範囲の電圧を使用してください。
      3. 負極耳原基のちょうど前方の中心と中心Oを配置耳の原基の途中で正極F​​。
      4. 歯状回はCA1 250〜275°（ 図2B）をトランスフェクトするために、CA2 230-250°をトランスフェクトするために、アンモン角（CA）3 210〜230°をトランスフェクトするために、190から210°の角度を使用してトランスフェクトします。
    4. 1.4節で説明したように、ポストエレクトロポレーション/術後ケアを行います。第3章で説明したように（出生後、P21）は、完全な海馬形成後に分析を実行します。
  3. 横中隔核および線条体のトランスフェクション（ 図2C、 表1）
    注意：角度は海馬をトランスフェクトするためのものと重複します。効果的に横中隔核と不要な海馬のトランスフェクション以前の胚の段階（E12）のない線条体をトランスフェクトするために使用されなければなりません。
    1. 1.2節で説明したように手術を行います。横中隔核とstriatの子宮内エレクトロポレーションのためにUM E12の胚を使用しています。
    2. 準備されたホウケイ酸毛細血管を経由して右側脳室に4μgのDNAを含む1μlのDNA溶液を注入します。
    3. 特殊な鉗子型白金電極（間隔周期長50ミリ秒、間隔休止950ミリ秒）を介して電圧を適用します。
      1. 0.5ミリメートルの電極を使用してください。
      2. 33 Vを使用します
      3. 耳の原基のレベルで電極の中心を配置します。
      4. 線条体170〜240°（ 図2C）をトランスフェクトするために、100〜170°の横中隔核使用角度をトランスフェクトします。
    4. 1.4節で説明したように、ポストエレクトロポレーション/術後ケアを行います。マウスを生け贄に捧げるとセクション3で説明したように6日、エレクトロポレーション（E18）後の胚を分析します。
  4. 視床と視床下部のトランスフェクション（ 図2D、 表1）
    1. 1.2節で説明したように手術を行います。 Uでの場合視床と視床下部利用E12-E13胚のTEROエレクトロ。
    2. 準備されたホウケイ酸毛細血管を経由して（左または右）側脳室に4μgのDNAを含有する1〜1.5μlのDNA溶液を注入します。解決策は、第三脳室中に拡散されるまで、2〜3分間待ちます。あるいは、直接第三脳室に注入。
      注意：これは、特異性を向上させますが減少し、生存率（損傷の危険性が高い）を引き起こす可能性があります。
    3. 特殊な鉗子型白金電極（間隔周期長50ミリ秒、間隔休止950ミリ秒）を介して電圧を適用します。
      1. 0.5または3mmの電極を使用してください。
      2. 33-35 Vからまでの電圧を使用してください
      3. ちょうど耳の原基を後方電極の中心を配置します。
      4. 視床下部90-180°（ 図2D）をトランスフェクトするために、25〜40°から視床の使用角度をトランスフェクトします。
    4. DESなどのポストエレクトロポレーション/術後のケアを行います1.4節でcribed。マウスを生け贄に捧げるとセクション3で説明したように6日、エレクトロポレーション（E18）後の胚を分析します。

3.灌流固定

  1. 準備
    1. 37°Cまで暖かい4％パラホルムアルデヒド（PFA）。
    2. PBSで50mlの注射器（4℃）と温めPFAと第2のシリンジを埋めます。泡を避けてください。
    3. 三方活栓にシリンジを接続します。翼の輸液セット（蝶）の三番目の端を接続します。
    4. PBSで翼の輸液セットをフラッシュします。
  2. 灌流
    1. 深く皮下塩酸ケタミン（60mg / kg）を適用およびキシラジン（7.5 mgの/ kg）でマウス（妊娠中や出産後のトランスフェクト）を麻酔。
    2. つま先ピンチに無応答性により、外科的寛容の段階を確認してください。
    3. ちょうど胸郭の下に腹腔を開きます。
    4. 慎重に横隔膜をカット。
    5. 慎重電子のカットを経由して胸郭を開きます鎖骨までACHサイト。
    6. （心尖から開始）左心室に蝶の先端を挿入します。
    7. 左心耳をカットします。
    8. ゆっくりPBS（約10ml）でマウスを灌流。
    9. 三方活栓を切り替えます。
    10. 5〜10ミリリットルの4％PFAでマウスを灌流。
    11. はさみを使用して、マウスを刎ねると大後頭孔から始まる脳を解剖。以前に発表された16のように解剖を行います。
    12. 4％PFA中で2日間の脳をPostfixate。暗所で4℃で脳をしてください。

4.免疫組織化学

  1. （ビブラトームで例えば ）70μmのセクションを生成します。
  2. オプション：抗体染色と蛍光を強化します。
    1. RTで1時間切片をブロック（0.1から0.2％のTriton X-100、5％正常ヤギ血清）
    2. 適切な抗体（：1,000抗GFP、1）でO / Nインキュベート
    3. ウォッシュ30.1Mリン酸緩衝液で-5倍。
    4. 適切な蛍光結合二次抗体（：1,000アレクサフルオロ488標識抗ウサギIgGを-、1）で3-5時間インキュベートします。
    5. オプション：1分（0.1 Mリン酸緩衝液中でDAPI、0.2グラム/ミリリットル）4-6 - diaminodino -2-フェニルインドールで対比染色。
    6. 適切な蛍光顕微鏡で蛍光を分析します。

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結果

図2は 、脳梁膨大後部皮質に開発途上地域の子宮内エレクトロポレーション内の特定の例を示し、運動野、体性感覚皮質、梨状皮質、コルニュは1-3 ammonis、歯状回、線条体、側方中隔核、視床および視床下部。トランスフェクションの結果は、次の推奨される角度（ 図2）に示されています。 生体内での角度のより良い視覚化のための電極（0.5ミリメートル）の位置も（羊膜嚢で図5、 子宮内胚、胚、解剖胚）の胚に表示されます。概要表1を提供するために特定のトランスフェクションのための関連する事実をまとめました。

また、電極のサイズは特異性（ 図6）のために重要な役割を果たしていることが実証されました。電極パドルの大きなサイズは、ラにつながります典型的な図 6に示すようにrgerは、領域をトランスフェクトした。さらに、胚のあま...

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ディスカッション

このプロトコルは、C75BL/6マウスの脾後皮質、運動皮質、体性感覚皮質、梨状皮質、角アンモニス1〜3、歯状回、線条体、外側中隔核、視床および視床下部をトランスフェクトする方法を詳細に説明しています。提供されたすべての情報を使用して、これは最初のプロトコルであり、C57BL/6マウスでこれらの脳領域のトランスフェクションを簡単に再現するために必要なすべての情報を提供します。これまでの出版物は、ほとんどが少数の特定の地域のみに焦点を当てているため、特定のトランスフェクションに必要な詳細な情報はほとんど標準化されていません。

効果的かつ特異的なトランスフェクションのための重要なステップである電極の位置とサイズ、および対応する胚段階に印加される電圧が正確に記述されています。提供された角度マップは、特定のエレクトロポレーションのために電極の向きを決めるのに役立ちます。電極の位置は、子宮内の胚、羊膜嚢内の胚、および純粋な解剖胚にも示されます。これらはすべて、電極の正しい位置を特定するのに役立つことを目的としています。

適切な電圧の使...

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

技術サポート:メラニー・ファイファーとニコライ・シュマロフスキー(マインツ大学医療センター顕微鏡解剖学・神経生物学研究所)。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
EndoFree プラスミド マキシ キットQIAGEN12362
Fast GreenRoth0301.1
pCAGGSAddgene
ホウケイ酸ガラス キャピラリー (0.8-0.9 mm 直径)は、Precision Instrument Inc.1B100F-4
イソフルラン (フォレン)アボットPZN 4831850
カルプロフェン (リマジル)ファイザー GmbH承認番号: 400684.00.00
眼軟膏 (Bepanthen Augen und Nasensalbe)バイエル PZN 01578681
0.9% ベンジルアルコール 0.9% 生理食塩水Pharmacy
of the University Medical Center Mainz
ガーゼ (ES-Kompressen)Hartmann407835
滅菌済み 5-0 パーマハンド シルク縫合Ethicon Johnson &ジョンソンK890H
リング鉗子1/1.5 mmファインサイエンスツール11101-09
リング鉗子4.8 / 6 mmファインサイエンスツール11106-09
リング鉗子2.2 / 3 mmファインサイエンスツール11103-09
ソン鉗子-鋸歯状ストレート12 cmファインサイエンスツール1106-12
リスはさみ-デリケートストレート-シャープ/鈍い10センチメートルファインサイエンスツール14028-10
メイヨースティルはさみ-ストレート15センチファインサイエンスツール14012-15
デュモン#5鉗子-イノックスファインサイエンスツール11251-20
カストロビエホニードルホルダーロック付き-タングステンカーバイド14センチファインサイエンスツール12565-14
エレクトロレーターCUY21 SC ネパジーン(株)
FST 250 ホット ビーズ滅菌器ファイン サイエンス ツール18000-45
マイクログラインダー EG-44成重
P-97 マイクロピュラー プーラーサッター インスツルメントカンパニー P-97
プラチナ電極 650P 0.5 mmネパジェネCUY650P0.5
プラチナ電極 650P 3 mmネパジェネCUY650P3
プラチナ電極 650P 5 mmネパジェネCUY650P5
プラチナ電極 650P 10 mmネパジェネCUY650P10
麻酔システムRothacher-Medical GmbHCV-30511-3 蒸気 19.3
ヒーティングプレートRothacher-Medical GmbHHP-1M
温度コントローラ 220V ACRothacher-Medical GmbHTCAT-2LV
糸 アドアイメートルメートル

参考文献

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