miRNAの脳特異的ノックダウンのための定位注射への単純な代替

サマリー

MicroRNAは脳内で重要な役割を果たしており、神経変性をモデル化するための潜在的な標的です。しかし、miRNAの長さが短く、脳組織にアクセスできないため、miRNAのレベルを乱すことは困難です。このビデオでは、マウスの神経ペプチドを使用したアンタゴミールの設計と脳特異的送達の方法を紹介します。

要約

マイクロRNA(miRNA)は、遺伝子発現の主要な調節因子です。 脳では、神経発達や神経機能などの重要なプロセスがマイクロRNAの正しい発現に依存しています。脳内のマイクロRNAの摂動は、ニューロン細胞死を調節することにより、神経変性疾患をモデル化するために使用できます。現在、定位注射は、miRNAノックダウン剤を脳内の特定の場所に送達するために使用されています。 ここでは、ロックヌクレオチド修飾(LNA)を持つmiRNAに対するアンタゴミールを設計する戦略について説明します。続いて、脳の異なる領域間で一様にアンタゴミールを脳特異的に送達する方法を説明します。 この方法は、手術、関連する損傷、および定位注射における局所送達の制限を克服するため、シンプルで広く適用できます。私たちは、miRNA-29に対するアンタゴミールを含む神経向性細胞透過性ペプチド狂犬病ウイルス糖タンパク質(RVG)の複合体を調製し、尾静脈を介して注射して、脳に特異的に送達しました。アンタゴミールの設計には、miRNAの特異的な標的化とペプチドとの非共有結合性複合体の形成を可能にする機能が組み込まれていました。ニューロン細胞におけるmiRNAのノックダウンは、アポトーシス細胞死とそれに伴う行動障害をもたらしました。 したがって、この方法は、miRNAの摂動による神経変性の急性モデルに使用できます。

概要

マイクロRNAは、遺伝子発現と疾患への関与のための直接的な証拠の調節におけるそれらの普遍的役割に起因する新規治療ターゲットとして浮上しています。薬は^{1,2をターゲット}として、miRNAは、積極的に自分の可能性について検討されています。さらに、miRNA発現の変化は、いくつかの疾患および³ miRNA発現の人工的な摂動により、これらの変化のシミュレーションが疾患症状に関与する細胞経路を研究するために使用することが可能に関連付けられています。 miRNAを標的とする薬剤の組織特異的送達は、現在のmiRNAベースの薬剤開発のための大きな課題です。アンタゴとのmiRNA模倣体は、miRNAレベル^4-6を摂動するための有望な薬剤です。しかし、それらの特異性および有効性を高める特殊な特徴は、それらがmiRNA発現のインビボでの摂動のために使用することができる前に、アンタゴの設計に組み込まれなければなりません。

マイクロRNAは、特に関連しています現在不治の神経変性および神経発達疾患における標的として。血液脳関門は、脳内のアンタゴの配信に制限を課します。定位注射は広く脳⁷内の特定の位置に分子を送達するためのげっ歯類モデルで使用されています。それは、スキル、計測および時間の大規模な投資を必要とします。定位注射は侵襲的であり、手術を伴う、少なくとも軽傷を引き起こし、ローカル配信に制限されます。ニューロンを標的化するための嗜好を有するペプチドを貫通する細胞の使用は、それらがトランス血管経路を介して送達することができるので、これらの制限に対抗するが、血液脳関門を破ることができます。狂犬病ウイルス糖タンパク質（RVG）に由来するようなペプチドは、以前にマウス⁸で日本脳炎ウイルスに対するsiRNAを送達するために使用されました。私たちは、アンタゴmir配信のためにペプチドを使用して、miRNAが効果的にマウス脳⁹にノックダウンできることを見出しました。

ontent "> miRNAの第二の主要課題は、ノックダウンは、miRNAの小さなサイズから生じると密接に関連した配列の存在は、私たちは3の密接に関連したアイソフォームで構成されてMMU-のmiR-29ファミリー、のmiR-29aの例を取る。アイソフォームa、bおよびc。アンタゴはまた、一般的にその安定性を向上させ、ヌクレアーゼによる攻撃にそれらが耐性をレンダリングするために骨格に沿って変更されます。ロックされた核酸（LNAのは）彼らは熱安定性を向上させるというさらなる利点を提供し、さらにオーバー以降劣化をターゲットにつながります立体障害^10。すべての骨格に沿って修正を導入することは有効であるが高価になることができます。私たちは、以前の最適な数を超えた修正は、さらに有効性を増強ない可能性があることを見てきました。アンタゴの設計は、したがって、アンタゴの最適な変更を伴います。

向神経ペプチドと非共有結合的に複雑なアンタゴには、ノナアルギニン内線にヘプタ充電に使用されます。 D-アルギニン彼らは、プロテアーゼによる切断を受けないよう、より高い安定性を付与するため、残基が使用されています。ノナアルギニンストレッチにヘプタは、それらが細胞型特異性を付与しませんが、効率的細胞透過剤として作用します。共有結合ノナアルギニンリンカーにRVGペプチドをリンクすることにより、神経向性、細胞透過性ペプチドを生成しました。ペプチドの正に荷電した残基は、複合体を形成するために、負に帯電した核酸骨格と相互作用します。これらの複合体は、効果的に培養された細胞内および組織内へのインビボでの DNAまたはRNAをトランスフェクトするために使用することができます。

プロトコル

注意：動物被験体を含むすべての手順は、ゲノミクス研究所と統合生物学における制度的動物倫理委員会（IAEC）、ニューデリー（IGIB / AEC / 2013分の10）によって承認されています。このプロトコルは、具体的のmiR-29の脳とノックダウンでアンタゴ-29の標的化送達のために調整されています。

1.アンタゴデザイン戦略

1. miRBase ¹¹から成熟miRNA配列を取得する（http://www.mirbase.org/）。
2. miRBaseレコードに「遺伝子ファミリー」リンクを使用して、関連するmiRNAファミリーメンバーの配列を取得します。
   （http://www.mirbase.org/cgi-bin/mirna_summary.pl?fam=MIPF0000009）。
3. 逆シーケンスを補完：http://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.htmlはに便利なツールを提供します相補配列を逆にします。
4. 次のガイドラインを使用して、LNAによって変更される位置をマーク：
   1. LNAのピリミジンがプリン¹²よりも安定であるため、LNA修飾のために離れて3-4拠点を置いチミン残基を選択してください。
   2. 前の手順が5つ未満の変更を生成する場合3-4残基によって分離されたシトシン残基を選択してください。
   3. これはシード配列を回避するため、アンタゴの5 '末端に5変更に優先順位を付けます。

2.アンタゴ-神経ペプチド複合体の準備

注：これは、プロトコルの中で最も重要なステップであり、それは標準化が必要です。プロトコルを標準化するために、任意の蛍光標識されたオリゴヌクレオチド（FLO）は、アンタゴmir ⁹の代わりに使用することができます。ペプチドは、高純度であるべきである（HPLCグレード、98％純度）.Sequencesペプチドおよびアンタゴの電荷を表1に示します。

1. MOの数を決定しますレアンタゴのマウスのアンタゴ、その毒性と重量のモル電荷に基づいて注入されます。ペプチド：アンタゴmirのモル電荷比に基づいて注入されるペプチドのモル数を計算します。
   注：アンタゴのモル電荷比を標準化：毒性およびマウス脳における効果的な送達のためのペプチド。標準化のためのペプチド：蛍光標識オリゴヌクレオチドの異なるモル電荷比を使用してください。私たちは、アンタゴmir-29とコントロールがマウスの4microgram /グラムの体重では毒性の両方であることがわかりました。アンタゴmir-29および制御2microgram /グラム体重で使用したが、この効果的な濃度は、各マイクロRNAについて変化する可能性があります。
2. ステップ1で計算されるような所望の最終濃度に滅菌10％のD-グルコースとストック溶液とは別のマイクロチューブ中のペプチドとアンタゴを希釈します。
3. 適度なボルテックス速度で渦のペプチド溶液をマイクロチューブにしてください。
4. Aの^{1/3を追加します。}ペプチド溶液チューブにntagomirソリューション、ゆっくりと、それはボルテックスミキサーで完全に混合されている間、滴下。
5. 次の1分間ボルテックスで溶液の混合を続行した後、混合物を1分間放置します。
6. 同じマイクロチューブ中のペプチド溶液と残りのアンタゴ溶液を混合するために、ステップ4と5をさらに2回繰り返します。ゆっくりとした添加は、トランスフェクションに有効である単分散複合体の形成に重要です。急速な添加は、複合体とその降水量の凝集につながることができます。
7. ボルテックスすることなく、RTで30分間、複合体をインキュベートします。インキュベーションのこの時間の間に、注射が行われる研究室にマウスを慣らします。

アンタゴ-神経ペプチド複合体の3尾静脈注射

1. 動物を拘束するために、適切なサイズの拘束またはdecapiconeでマウスを置きます。
2. PR綿棒を使用して、尾部の表面を清掃してください温水（約40℃）で電子浸しました。これは、血管拡張を促進し、静脈の可視性を向上します。
3. 15〜20°の角度で - （1.0 CC 0.5）のインスリン注射器、小容量で尾アプローチ。シリンジ内に空気を導入しないように注意してください。尾の先端部で開始します。複合体を注入します。針を外して、任意の出血を止めるために注射部位（約5〜10秒）に直接消毒綿棒を適用します。
4. 濃縮としてトウモロコシの穂軸やティッシュペーパーで、3-5のグループ内の個別換気ケージにマウスを交換してください。同じケージに注射していないし、注射したマウスを保管しないでください。

4.行動アッセイ

注：注射後の回復を可能にするために注入し、行動アッセイの間に3〜4時間の時間間隔をおいてください。静かな部屋にマウスを持参してください。順化のこの期間中に、動物を邪魔しないでください。

1. にマウスを順応新しい部屋で30分間、その後、次の行動アッセイを開始します。それぞれの行動分析の間に10分の間隔をおいてください。
2. 後肢留め：
   注：このテストは、運動機能障害および神経学的障害を示しています。
   1. クリアなバックグラウンドで尾の近くにベースを保持して静かにマウスを持ち上げます。
   2. 10〜15秒間後肢位置を確認してください。運動失調マウス腹部に向かって時間の50％以上が^{13を停止し} 、一方または両方の後肢を引っ込める傾向にある一方で、野生型マウスは、腹部から離れた後肢をsplays。
   3. ケージにマウスを返します
3. レッジ試験：
   1. 尾を保持することによって静かにマウスを持ち上げて、ケージの棚に保管してください。
   2. ケージの隅で特異的にマウスを観察します。野生型マウスは、恐怖とバランスを失うことなく、容易にコーナーを渡すことができます。ケージ棚に沿ってコーナーに歩きながら運動失調マウスは、そのバランス、フリーズや揺れを失います。
4. マウスフットプリントアッセイ：
   注：このアッセイのために（〜5センチの高さの壁で〜5センチ幅の、〜70 cmの長。）狭い滑走路の床に、準備ができて吸収シートを保ちます
   1. 片手で静かにマウスを持って、ブラシで後肢にインクを適用します。
   2. 狭い滑走路の床に吸収シートを配置します。
   3. マウスはもう一方の端から滑走路に直線的に吸収シートを歩いたり、上で実行できるようにします。
   4. 新鮮な吸収シートを使用して、それぞれのマウスを使用してプロセスをさらに2回繰り返します。
   5. 前進中の2つの連続した​​ステップ間の距離を測定します。動物はちょうどそれぞれ、その実行を開始し、仕上げされた最初と最後の数足跡を含めないでください。

結果

ここに提示された手順を用いて、蛍光標識されたオリゴヌクレオチド50microgram（FLO）と〜1：15のモル電荷比の850microgramのRVGペプチドの複合体（FLO：ペプチド）を調製し、尾静脈を介して一回だけ注入しました。非神経向性狂犬病ウイルスのマトリックス（RVM）ペプチドおよびFLOの複合体は、配信対照として使用しました。翌日、マウスの脳および肝臓を単離し、単一細胞懸濁液を調製しました。細胞は緑色の蛍光を顕微鏡で観察しました。 FLO-RVG複合体が正常ではなくRVMペプチドは肝臓にはなく、脳細胞にFLOを配信しながら、肝臓（図2B、2D）における（脳細胞における緑色蛍光として一日の最短時間で配信され、検出されました図2A、2C）。

miR-29に対するマウス脳アンタゴにおけるmiR-29をノックダウンするには、5 LNA修飾と設計されました。アンタゴ-CONとして使用スクランブル、非miRNAを標的化配列トロール。 50microgramアンタゴ制御またはアン...

ディスカッション

ここでは、miRNA調節の効果を研究するための広くアクセス可能な方法論を実証します。 現在、miRNA機能の in vivo 特性評価の試みのほとんどは、ノックアウトマウスまたはmiRNAスポンジを発現するトランスジェニックの作成を伴います。 ほとんどのmiRNAは、細胞型に特異的なものであっても、複数の臓器で発現しています。 たとえば、当初は造血系に特異的であると考えられていたmiRNAは、ミクログリアの存在により、脳でも発現します。 したがって、細胞型特異的プロモーターの制御下でmiRNAに対するアンチセンス剤を発現する細胞型特異的ノックダウン戦略でさえ、多面性効果を生み出す可能性があります。 たとえば、miRNAのmiR-29ファミリーは、脳、血球、および体内の他のいくつかの部位で発現しています。 したがって、miRNAを調節するための遺伝的ツールは広く適用されていません。 また、医薬品開発や潜在的な治療戦略のテストにも適していません。

単純な尾静脈注射で貨物を配送できるため、この技術は広く利用できるようになります。 また、神経向性送達のためのレンチウイ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ボルテックス
拘束装置またはデカピコーン
ナロー滑走路			~70cm、幅~5cm、壁の高さ~5cm。
試薬
蛍光標識オリゴヌクレオチド(siGLO)	GE Healthcare Dharmacon INC	D0016300120
10% 無菌 D-グルコース
アンタゴミル-29	エクシコン	カスタム合成
アンタゴミア制御	エクシコン	カスタム合成
ニューロペプチド RVG	G.L.Biochem (上海)Ltd.	カスタム合成	>純度98%
神経ペプチドRVM	GLバイオケム(上海)株式会社	カスタム合成	>98%純度
、その他の
綿
、温水
、インスリン注射、
吸収性シート
、インク
ブラシ
、防腐剤