細胞特異的にLINC複合体を破壊するマウスモデルの検証

Summary

核膜タンパク質は、多くの基本的な生物学的プロセスにおいて中心的な役割を果たしており、さまざまなヒトの病気に関与しています。 このプロトコルは、LINC複合体の破壊の時空間制御を可能にする新しいCre/Loxベースのマウスモデルを記述しています。

Abstract

発達組織および成体組織内での核移動と定着は、核骨格および細胞骨格(LINC複合体)のリンカーと呼ばれる大きな高分子タンパク質集合体に大きく依存しています。 これらのタンパク質スキャフォールドは核膜にまたがり、核の内部を周囲の細胞質細胞骨格の構成要素に接続します。 LINC複合体は、Sunタンパク質とネスプリンという2つの進化的に保存されたタンパク質ファミリーからなり、それぞれSUNドメインとKASHドメインと呼ばれるC末端分子シグネチャーモチーフを宿しています。 SUNタンパク質は、N末端の核質ドメインが核ラミナと相互作用し、C末端のSUNドメインが核周囲空間に突き出てネスプリンスのKASHドメインと相互作用する、内核膜の膜貫通タンパク質です。 標準的なネスプリンアイソフォームは、細胞質に突出し、細胞骨格の成分と相互作用する可変サイズのN末端を持っています。 このプロトコルは、細胞型特異的な方法で内因性のSUN/KASH相互作用を破壊するドミナントネガティブトランスジェニックマウス戦略の検証を説明しています。 私たちのアプローチは、LINC複合体の不活性化の生殖細胞モデルに関連する周産期致死率や細胞非自律的な表現型などの多くの欠点を回避するCre/Loxシステムに基づいています。 このため、このモデルは、さまざまな組織におけるLINC複合体の発生および恒常性におけるLINC複合体の役割を理解するための有用なツールを提供します。

Introduction

核膜（NE）は、細胞質から核質を分離します。これは、核膜孔に接続し、内側と外側核膜（INMとそれぞれONM）で構成されています。両方の膜で区切らルーメンは核周辺領域（PNS）と呼ばれています。 ONMは、粗面小胞体（ER）を拡張したものであり、INMは核ラミナ、核A-で表さタイプ-Vの中間フィラメントおよびB型ラミン^1,2の網目構造に準拠しています。細胞核の骨格と細胞骨格（LINC）複合体のリンカーは、物理的に細胞骨格フィラメントと分子モーター（ 図1A）に核の内部を接続するための全体の核エンベロープにまたがる高分子集合体です。日（SAD1 / Unc84）タンパク質とNesprins（核膜SPectRINS）：彼らは、NEの一体型膜貫通型タンパク質の2家族を特徴づける進化的に保存されたモチーフ間の相互作用で構成されています。哺乳類では、Sun1とSun2 ARN末端 ​​核質地域INMの電子の膜貫通タンパク質は、A及びB型ラミン^3-5と直接対話します。 INMの反対側には、PNS内、日タンパク質は、〜150のC末端アミノ酸の進化的に保存されたストレッチを抱い日ドメインと呼ばれます。日ドメインは、進化的に保存さKASH（Klarsicht / ANC-1、あれから相同性）ドメイン、Nesprinsの分子署名と直接対話。 KASHドメインは、膜貫通ドメイン⁶に続いて、PNS内に突出〜30のC末端アミノ酸のストレッチで構成されています。少なくとも4つの異なるNesprin遺伝子（Nesprin1-4）は、NE ⁷に局在KASH含有タンパク質をコードします。サイズ〜50kDa（Nesprin4）から驚くほどの千キロダルトン（Nesprin1巨人）に変わるNesprins、の細胞質領域は、複数のスペクトリンは、アクチン、プレクチンと分子モーター⁸のような細胞骨格成分との相互作用を可能にするだけでなく、特定のモチーフを繰り返し含ま^13。

<脊椎動物と無脊椎動物のpクラス= "jove_content">研究は、ラミン/日/ Nesprin /分子モーターは、進化的に保存された「軸」の核移行と足場を制御を構成していることが示されています。 LINC複雑なコンポーネントのいくつかのノックアウト（KO）マウスモデルが記載され、哺乳類の発生^9,14,15中のNEで太陽とNesprinタンパク質の役割を理解するためのフレームワークを提供することに尽力したされています。最も顕著なのが、本これらのモデルには、いくつかの重大な欠点、：細胞非自律的効果による表現型の解釈に1）困難、KASHレスNesprinは^{16アイソフォーム}対KASH含有の表現型の貢献を区別するのに2）難易度、3）多数の細胞タイプで、NEで太陽とNesprinタンパク質の機能的冗長性は、両方のKASHドメインを欠損したマウス¹⁷内のすべてのSUN-KASH相互作用およびマウスの4）周産期致死性を不活性化するために、複雑な繁殖スキームが必要ですNesprins1と2は、大人の表現型¹⁸の分析を排除します。

このプロトコルは、このように上記で概説した欠点の多くをバイパスして、細胞自律的かつ発生的に調節方法で、 生体内でのすべてのSUN-KASH相互作用を破壊するように設計された新規マウスモデルを記述しています。これのCre / LOXベースのマウスモデルは、2つの重要な概念に依存している：1）任意の公知Nesprinタンパク質のKASHドメインが細胞培養系内のNEにEGFPを標的とし、2）SUNドメインがの過剰発現、従って、KASHドメインと無差別に相互作用するのに十分です任意のKASHドメインは、すべての内因性日ドメインを飽和させ、ドミナントネガティブな方法^17（ 図1B）にLINC複合体を不活性化します。このプロトコルは、小脳プルキンエ細胞内のすべてのSUN-KASHの相互作用の破壊を確認するために使用される組織の収穫と処理手順について説明します。

Protocol

倫理声明：動物を対象とする手順は、セントルイスにあるワシントン大学の施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって承認されました。

1.マウスの繁殖とジェノタイピング

1. ^（PCP2Cre CAG-EGFP / ^{KASH2）19,20}のTgを生成するためのTg（CAG-LacZを/ EGFP-KASH2）Tgを有するマウス（PCP2-CRE）マウスを飼育。注：このプロトコルの残りは小脳内のプルキンエ細胞にEGFP-KASH2発現を制限するためのTg（PCP2-CRE）マウス系統の使用に焦点を当てているが、同様の手順は、他のTg（CRE）マウスで追跡することができます（ 図2A）。
2. 以前に^19を説明したように、両方のEGFPとのCre導入遺伝子を保有する子犬を識別するために、遺伝子型判定を行います。

解剖および組織収集のための材料の作製

1. -20℃で30％のPBS中のスクロース（1×PBS、30gのスクロース/ 100ミリリットル）と店の100ミリリットルを準備します。組織Hの日transcardial灌流35 mlシリンジにarvesting、解凍およびショ糖液の負荷〜30〜35ミリリットル。
2. PBS中の4％PFA（10ミリリットル、16％パラホルムアルデヒド、30 mlのPBS）の40ミリリットルを準備します。 transcardial灌流35 mlシリンジにロード〜30〜35ミリリットルの4％PFA。
3. 組織切開のためにPBS 10mlで10cmの組織培養プレートを埋めます。
4. 16 mg / mlのケタミンおよび3 mg / mlのキシラジンから成るケタミン/キシラジンのカクテルを用意します。
5. 解剖のための70％エタノール溶液を調製します。

3.解剖と組織収集

1. 1mlシリンジを使用して、体重25グラムあたりのケタミン/キシラジンのカクテルの500μLを注入し、15分〜を待ちます。あるいは、目的の生物学的システムに適した別の制度承認鎮静メソッドを使用します。
2. 鎮静時に、そっとの背側と発泡スチロールのトレイ上のすべての足をピン、疼痛応答の欠如を確認するために、後部足を挟まマウスを下に向けて。
3. 70％エタノールで腹部をスプレーし、心臓へのアクセスを得るために胸郭の上に下腹部から切開を行います。
4. 心臓の右心房に小さな切開を行い、心臓の左心室に30％ショ糖溶液を含む注射器を挿入します。
5. 〜2〜5ミリリットルあたり分の速度で溶液を灌流。ときに空のシリンジを除去し、4％PFA溶液で繰り返します。
6. 発泡スチロールのトレイからマウスの固定を解除し、脳にアクセスするために首を切ります。
7. ピンセットやハサミを用いて動物の頭の周りの皮膚を削除します。針で頭蓋骨の後部の穴を突く、慎重にはさみや解剖鉗子で頭蓋骨を削除します。
8. 脳は明らかにアクセス可能になると、小脳を除去し、PBS中でそれを置くために鉗子を使用しています。メスで矢状面で小脳を二等分し、4℃で一晩、30％スクロース溶液に移します。注：準備へパラフィン切片は、組織が埋め込み、切片の前に4％PFA中で4℃で一晩小脳を修正しています。

4.組織処理とセクショニング

1. ドライアイスのスラリーと2-メチルブタンを準備します。浴の温度を5分間平衡化させます。
2. OCT化合物でcryomoldを記入し、金型に二分小脳の半分を置きます。
3. 解剖顕微鏡とピンセット位置のペア（小脳の正中線に近い）二等分面が上を向いているように、小脳を使用。
4. OCT化合物は、組織標本の周りの白色の固体マトリックスを形成されるまで5分間ドライアイススラリーにcryomoldを転送します。注：必要に応じて凍結標本は現在、-20℃で保存することができます。
5. 組織切片を収集するために前処理されたポリリジンスライドにラベルを付け、Cereの15ミクロン切片を収集するために、製造業者の指示に従ってクライオスタットを準備bellum。セクションを収集するには、慎重にスライドのポリリジンコーティングした側を10月セクションにお問い合わせください。セクションの向きを維持するために、このステップの間にスライドを回転させないでください。
6. -20℃で保存組織切片染色およびイメージングに進むまで。

5.染色および小脳切片のイメージング

1. 組織染色の前に、以下のソリューションを準備します。
   PBSの〜50ミリリットル
   〜PBS中の4％PFA 5〜10mlの
   〜PBS中0.5％トリトンX-100、10％ロバ血清の10-20 mlの
2. 小脳のセクションを解凍します。重要なことは、EGFPの退色を防止するために、連続した強い光の任意のソースへの露出を最小限に抑えることができます。
3. 疎水性バリアペンを使用して、組織切片の周囲に四角形を描画します。
4. 5分間、4％PFAでセクションをポスト修正。疎水性バリア（通常〜500μL）で区切ら領域全体をカバーするのに十分な液体を使用してください。真空またはピペットを使用して、再組織切片を乱さないように特に注意しながら固定液を移動します。
5. ピペットを用いて、やさしく組織切片を乱すことなく、スライド上のPBSを適用します。 5分後、慎重に液体を除去するために真空またはピペットを使用しています。 PBSを繰り返して合計3回すすいでください。
6. ピペットを使用して、慎重にPBS中0.5％トリトンX-100、10％ロバ血清中（溶液の900μLあたり3μlのカルビンジンおよび/またはNesprin2抗体）は、適切な一次抗体の希釈物を適用します。暗所で室温で1時間インキュベートします。
   注：EGFP-KASH2は、凍結切片上の直接蛍光顕微鏡によって見えるようになり、それは抗EGFP抗体を利用する必要はありません。パラフィン切片を調製している場合は、EGFP-KASH2のイメージングは​​、抗EGFP抗体を用いた免疫検出を必要とします。
7. 抗体溶液を除去し、PBSで3回すすいでください。
8. 、0.5％トリトンX-100でアレクサ・フルーア二次抗体の希釈液千：1を準備します10％ロバ血清、PBS中、暗所で保管してください。
9. 静かに最後のPBSリンスを削除し、暗所で1時間、二次抗体の希釈を適用します。
10. 二次抗体溶液を除去し、セクションを3回洗浄し、洗浄してください。必要であれば、最初のPBS適用中に、このようなDAPI​​などの核染色、（〜300nmの）を適用します。
11. 完全組織と組織切片上でメディアをマウントする場所〜5-7μlの周りからのPBS溶液を除去。組織切片の上にカバーガラスを置き、暗所で室温〜15〜30分間のために確保さ。
12. EGFPおよびステップ5.8 / 5.9で使用される二次抗体のための適切な任意の他の波長を可視化するために、適切なフィルターを備えた蛍光顕微鏡を使用してください。小脳切片では、EGFP-KASH2核リムを表示するには、20Xの対物レンズを使用しています。

Results

このプロトコルは、Tgは（PCP2-CRE）マウスを用いた小脳プルキンエ細胞にEGFP-KASH2発現を制限するためのTg（CAG-LacZを/ EGFP-KASH2）マウスモデルの有用性を示しています。 Tgは^（PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2）の子孫では、LacZを/ V5オープンリーディングフレームは、それによって特異的にプルキンエ細胞（ 図2A）を対象とし、EGFP-KASH2の発現を導くCreリコンビナーゼによってP6で切除されます。予想されたように核（ 図2B）を中心に観察EGFP陽性リム状のパターンによって示されるように、EGFP-KASH2は核膜を対象にしています。任意の生理学的な表現型を最大にするために、それは、EGFP-KASH2は、細胞特異的抗体マーカーで共染色されたEGFP-KASH2陽性細胞の割合を計算することにより、標的細胞の大部分で発現されることを保証することが重要です。この例では、EGFP-KASH2発現がカルビンジン陽性プルキンエ細胞（ 図2B）の70％以上で検出さ...

Discussion

正常のTg（CAG-のLacZ / EGFP-KASH2）モデルを用いてインビボで LINC複合体の役割を研究するための最も重要なステップは、適切なのCreマウス系統を同定することです。 Creが同様の経路に関与する他の細胞型で活性であれば確かに、それは結果の解釈を複雑にすることができます。小脳（ 図2B）の分子および顆粒細胞層にここに示されるように、したがって、それは、近隣の細胞を調べることが重要です。同様に、任意の生理学的に関連する表現型を最大化するためには、目的の細胞型を横切る広範Cre発現とのCre株を同定することが重要です。これは、目的のシステムの開発時にLINC複雑なコンポーネントの発現パターンの詳細な特性評価を行うことも重要です。実際、Tgは（CAG-LacZを/ EGFP-KASH2）マウスモデルの欠点の1つは、Sunタンパク質またはNesprins変異体は、生物学的システムに関与しているためにどのように任意の情報を提供しないということであるUファインダーの考慮。しかし、この問題は、両方の転写物およびタンパク質レベルでの厳密な特性評価を実施することによ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
スクロース	Sigma Aldrich	S0389
10x PBS	Gibco	14200-075
16% パラホルムアルデヒド溶液	電子顕微鏡 科学	15710
OCT 化合物	Tissue-Tek	4583
接着スライド	StatLab	M1000W
ドンキー 血清	Σ Aldrich	D9663
Triton X-100	Sigma Aldrich	T9284
ImmuEdge Pen	Vector Laboratories	H-4000
抗カルビンジン抗体	Sigma Aldrich	C9848
抗EGFP抗体	Abcam	ab13970
抗Nesprin2抗体			以前に文献21で説明した
マウントメディア	ダコ	S3023
2-メチルブタン	シグマアルドリッチ	O3551