急性および慢性病変後に損傷した脊髄に大きな組織ギャップを埋めるための実験的戦略

サマリー

重度の脊髄損傷はしばしば組織の欠陥を引き起こします。このようなギャップをうまく埋めて、急性損傷後および完全な脊髄離断術の 5 週間後に機械的マイクロコネクタ システムを移植することにより、ラットの組織適応、再生応答、および機能改善を促進するための 2 つの可能性が説明されています。

要約

軸索再生を阻害病変コアにおける脊髄損傷（SCI）瘢痕形ました。外傷性の事故に起因する脊髄腫瘍切除、または組織欠損への侮辱後に損傷部位を埋めることは、一般的な組織の修復だけでなく、患部を 超え に神経線維の回生成長を促進するのを助けることができます。後に切断された脊髄組織の切り株を再適応するための急性および完全に離断胸部ラットの脊髄への新たなマイクロコネクタ装置の（1）移植、および慢性病変ラットでのSCIサイトの（2）のポリエチレングリコール充填：二つの実験的治療戦略が提示されています瘢痕切除。このモデルにおける慢性脊髄損傷は、5週間の治療の前に負わ​​せた完全な脊髄離断です。どちらの方法は、最近、有益な細胞浸潤と機能改善を非常に有望な成果を達成し、軸索の再成長を推進してきました脊髄損傷の齧歯類モデルです。

機械的なマイクロコネクタ・システム（MMS）は、MMSに負圧を印加する出口配管系とポリメチルメタクリレート（PMMA）からなるマルチチャネルシステムである内腔こうしてハニカム構造穴に脊髄断端を引っ張ります。 、1mmの組織ギャップ内への移植後の組織は、デバイス内に吸引されます。また、MMSの内壁は、より良好な組織接着のためにミクロされています。

慢性脊髄損傷のアプローチの場合には、脊髄組織 - 瘢痕が充填された病変領域を含む - は、長さ4mmの領域にわたって切除されています。顕微瘢痕切除後、得られた空洞は、細胞浸潤、血管再生、軸索再生およびインビボでもコンパクトな再ミエリン化のための優れた基質を提供することが見出されたポリエチレングリコール（PEG 600）で満たされています。

概要

脊髄への外傷だけでなく、任意の回生応答を妨げる組織欠損における軸索が、それはさらに、結果の損失につながる（レビューのために^1,2を参照^してください）。脊髄組織は、多くの場合、病変領域とその周辺の嚢胞形成または穴に通じる二次変性によって失われます。ほとんどの実験的な治療的介入は、健康な組織の残りのリムとの部分的な離断、クラッシュまたは挫傷の傷害のような不完全な脊髄損傷に焦点を当てます。腫瘍切除などの外傷事故や外科的介入に起因する総離断、のような完全な傷害については、ごく限られた治療の選択肢は、今日^3,4用意されています。完全に切断した後、脊髄断端後退における組織結果のメカニック張力は、脊髄の小さなギャップを残します。ほとんどの戦略は、組織、細胞または行列^5,6と、このギャップを埋めるに焦点を当てます。

ここでは、異なる戦略新規マイクロコネクタ装置^7を用いて分離切り株のすなわち再適応を提示されています。 2切り株を再適応させるために、機械的な力は、これを達成するためにわずかな負圧（ 図1）のように適用されなければなりません。機械的なマイクロコネクタ・システム（MMS）は、出口配管系を備えたハニカム形状の穴（ 図1A）とを有するポリメチルメタクリレート（PMMA）のマルチチャネルシステムです。これは、ラット（ 図1C）で完全な脊髄切断から生じる組織ギャップに注入されます。一つのチューブは、MMS（ 図1D）に負圧を適用する真空ポンプに接続することができます。圧力は、圧力が（ 図1B）がリリースされたときに所定の位置に組織を保持するために微細構造壁を持っているMMSのハニカム状の穴、中に切断された脊髄の切り株を引っ張ります。チューブは、手術後に無傷のまま、順番に浸透圧ミニポンプに付着させることができます病変のコア（ 図1E-F）に物質を注入します。

脊髄の急性横断脊髄腫瘍の外科的除去、またはこれまでにMMSによって克服することができない数ミリの大きな組織のギャップにつながる固体慢性病変の傷跡からの完全な病変の結果、別のタイプのほかに。脊髄損傷を有する患者の大多数は、慢性外傷に苦しみます。これらの患者では、十分に発達した傷跡は、病変のコアを占めています。病変の瘢痕の外科的除去は、現在実験SCI ^8,9の後に検討されている治 ​​療のための概念です。切除手順自体はかなりの付加的な損傷を与えることなく行うことができるが、得られる組織ギャップが脊髄損傷の特定の場合に、可能にし、組織の再生を促進し、適切なマトリックス、神経線維の再生に架橋される必要があります運動機能を維持し、促進します。そうだった低分子量ポリエチレングリコール（PEG 600）がこの目的に非常に適した材料であることを見出しました。その免疫原性の欠如、非常に低粘度は、周囲の組織へのスムーズな統合を可能にします。非常に重要なこと- -降順でコンパクトミエリン⁸によって線維路並びにそれらensheathmentを昇順の軸索の再生と伸び生体高分子の挿入だけでは内皮細胞、末梢シュワン細胞、およびアストロサイトなど、有益な細胞の浸潤を促進します。これらの再生応答は、長持ち機能向上を伴うことが見出されました。瘢痕組織の切除およびPEG 600のその後の移植の組み合わせはかなりの脊髄組織欠損をブリッジの安全かつシンプルでありながら非常に効率的な手段を提供します。

プロトコル

動物の安全性と快適性のための制度ガイドラインはに付着し、すべての外科的介入と前と手術後の動物のケアは、ドイツ動物保護法の遵守（ステートオフィス、環境・北Rhine-ヴェストファーレン州の消費者保護、LANUV NRWで提供されていました）。

（ - 250グラム220）女性のウィスターラットの胸部脊髄の1.完全離断

1. 脊髄の調製
   1. カルプロフェンのボーラス注射（皮下[SC] 5ミリグラム/キログラム）： - （2 1の比率でO ₂ / NO ₂でイソフルラン3％2）イソフルラン吸入麻酔を使用してください。カルプロフェンおよびオピオイドブプレノルフィン（0.02ミリグラム/ kg皮下）の組み合わせが推奨されます。綿棒と足引っ込め反射と軽いタッチの時眼瞼反射鉗子で刺激をつまんに手術を開始しますが、もはや観察されません。
   2. 本体temperatuを維持するために37℃に加熱ブランケット上に動物を置きます手術中の再麻酔下ながら乾燥を避けるために、目に眼軟膏を置きます。
   3. 動物の背中を剃ると皮膚の消毒剤で皮膚を準備します。
   4. 手術用ブレード4 CMの胸椎に沿って正中線の皮膚を切り取って、それを開きます。上のこの段階から、すべての手順（オートクレーブ処理または浸漬滅菌）滅菌手術器具を使用しています。
   5. 小さな筋肉のクランプを使用して胸椎上記の筋肉を撤回。
   6. 椎骨が平らになるまで慎重に骨の小片をクリッピングすることにより、骨鉗子で胸部レベル8（TH8）で棘突起を外し、TH9。
   7. 棘突起TH7で脊柱を持ち上げ、椎弓切除術がTH8とTH9で実行されるまで、吻側に尾側から椎骨の小片をクリップする骨鉗子を使用するために、解剖学的鉗子を使用してください。慎重に一度椎骨の数だけ、非常に小さな部分を除去することによって、それを損傷することなく硬膜を公開します。
   8. 棘突起TH7とTH10で2安定化クランプによってバックボーンをクランプ、椎骨から呼吸の動きを切り離すために動物を持ち上げます。
2. 胸部レベル8/9で脊髄離断を完了
   1. 細かい鉗子で硬膜を持ち上げ、横方向に微細な目のハサミで硬膜をカット。
   2. 細かい鉗子で硬膜の横方向の切断端を持ち、硬膜とくも膜の間subarachnoidic空間に脊椎フックを挿入します。鉗子または脊髄フックのいずれかと軟膜または硬膜にチクチクしないことにより、髄膜の損傷を避けます。
   3. ゆっくりと（PIAが無傷のままである）硬膜に刺すないように注意しながら、脊髄組織に沿ってすべてを配置するフックを回転させます。
   4. ギャップが脊髄組織と硬膜の間の腹側で見られるまで、上向きに2ミリメートル - 約1用の脊髄を持ち上げます。
   5. スペースbetweeに細かい目のはさみを挿入nは硬膜と軟膜と脊椎フックが所定の位置に残されている間、脊髄を切りました。
   6. 2鉗子で脊髄の2切り株を持ち上げて、視覚的に完全な離断を確保。
   7. 慢性傷害と対照-病変動物と動物のために、モノフィラメント非吸着性9.0スレッドと結節縫合によって硬膜を閉じます。
   8. 慢性病変のために一部1.6に従ってください。
3. MMSの移植
   1. 椎骨の各横側にある2つのチューブとの損傷部位の上にMMSを置き、病変空洞内にそれを下げます。
   2. MMSの安定化を確保するための非吸収性4-0糸で椎骨の側の筋肉に縫合チューブ。このステップの間に鉗子を使用してMMSの固定を確認してください。
   3. 細かいハサミで切断することにより、MMSのコネクタピンを外します。
   4. MMSの上に硬膜を閉じて、9.0のスレッドでそれを縫合。
   5. 真空ポンプに1チューブを取り付け、シールクランプして他。
   6. MMSの内腔への脊髄の切り株を吸って、オープン管を介して真空ポンプでMMSに優しい負圧を適用します。 （10分間、最大で）数分間の負圧を適用し、センサによって監視（250から350ミリバール）。
   7. MMSに近いチューブをカットし、チューブを外します。ステップ1.6に進みます。
4. 最初の損傷後の5週目での慢性病斑傷跡を含む脊髄組織の切除
   1. 1.1.5 - 手順を1.1.1に従ってください。
   2. 脊髄の上に黄褐色の外観と硬い組織によって瘢痕組織を識別します。優しく細かい鉗子で保持し、細かいハサミで切断することにより、瘢痕組織の表面層を除去します。この方法では、脊髄損傷の領域を含む組織を露出させる椎弓切除部位を再度開きます。硬膜縫合糸が視覚的に識別されたときの準備を停止します。
   3. スピンで2安定化クランプによってバックボーンをクランプその後のOUプロセスTH7とTH10、および椎骨から呼吸の動きを切り離すために動物を高めます。
   4. 小さな板紙定規で切除される脊髄領域（長さ：4ミリメートル）を測定し、組織のその後の除去を可能にするために横切開でこれそれぞれの組織領域のエッジをマーク。
   5. 切断および吸引の組み合わせを介して、瘢痕組織を削除します。横切開で脊髄から分離された組織を取り出します。組織の除去を可能にするのに十分であるときはいつでも穏やかな吸引を使用してください。また、瘢痕組織のたびに硬い質感は、この組織を切断し、除去するために、細かいハサミを使用して、組織の吸引があまりにも困難になります。
   6. 補助金を出血するまで、組織ギャップに止血ゼラチンスポンジの片（約5ミリメートル×5ミリメートル×5ミリメートルの立方体）を挿入します。ゼラチンスポンジはすぐにそれが液体で浸漬されるようにサイズに縮小します。
5. ImplaPEG 600のntation
   1. 37℃に加熱することによって、注射のために、純粋な未希釈のPEG 600の1ミリリットルを準備します。
   2. ゼラチンスポンジを取り外します。
   3. 10μlの注射器または10μlのピペットを用いて、ギャップにPEGの - （7μlの約5）十分な量を挿入します。
   4. 慎重にシール剤/硬膜置換の片（約5ミリメートル×4ミリメートル）との領域をカバー。
   5. 組織接着剤数滴の筋肉組織を周囲にシーラントを修正しました。 PEG-満たされた切除ギャップの上にシーラントを置きます。シーラントの滑りを防止するために、周囲の筋肉組織にシーラントの角を修正するために組織接着剤の小滴を使用します。注意：脊髄組織に組織接着剤の漏れを避けます！
6. 組織および術後ケアの閉会
   1. 編組吸着4-0スレッドと結節縫合を有する層のための縫合糸の筋肉と皮膚層
   2. 塩化ナトリウムの2×2.5ミリリットルを注入（塩化ナトリウム[0.9％]）手術後の再水和のために36℃のSCで。 5ミリリットルの塩化ナトリウムの単回注射は、動物の皮膚を伸ばすだろうし、動物に不必要な害をもたらす可能性があります。完全な意識が回復されるまで無人動物を放置しないでください。
   3. 手術後少なくとも2日間、毎日カルプロフェン（皮下5ミリグラム/キログラム）を注入します。 3 - その後2のグループの最初の2日間シングルケージ内のハウス動物、。
   4. 最初の手術後の週のための抗生物質治療（エンロフロキサシンの毎日の経口投与）を適用します。
   5. 優しく吻側から尾側への動物の腹の上になでることにより、1日に2〜3回に排尿マニュアル膀胱を実行してください。動物の脊柱を移動しないと尾で動物を持ち上げていないように注意してください。手動で全生存期間の間、毎日完全spinalized動物の膀胱を無効にします。ケアをすることなく、動物によって達することができる高さに食物ペレットと水のボトルを置くように注意しなければなりません彼らの後足の上に立って。後肢四半期の機能が損なわれているが、動物は手術直後に積極的にケージを移動して探ります。社交的なグループでラットを維持することが推奨されています。
   6. 慢性病変のために瘢痕切除術の前に5週間の動物の生存時間を残します。フォローは1.4を繰り返します。

結果

組織保存、軸索再成長および脊髄の急性完全離断後のMMS移植の機能的ベネフィット
MMSの急性注入が完全に離断脊髄切り株を安定化し、組織（B 対 図2A）の収縮を減少させたことが示されました。矢状切片でのトリクローム染色により可視化されるように、病変コアにおける線維性瘢痕の緑の結合組織染色は、MMS移植した動物（ 図2C）よりもコントロール病変動物（ 図2D）でずっと高密度でより顕著です。興味深いことに、対照病変動物対移植MMSでED-1に対する免疫組織染色により可視化病変部位におけるマクロファージ蓄積の長期生存時間で全く観察された差はなかった（図示せず）。

直ちに移植後、MMS腔における組織の欠如は、その後数日後に細胞および組織...

ディスカッション

ここでは、2つの異なる外科的アプローチは、（1）急性完全離断およびMMS注入、（2）慢性脊髄損傷及び線維性瘢痕の除去に加えてPEGマトリックス注入後の脊髄の組織ギャップを埋めるために提示されます。どちらの戦略は組織保存および軸索再生に同様に処理された動物の重要な運動機能改善につながります。 MMSは、手術後の会社硬膜縫合により脊髄内のMMSの適切な固定を移植するための重要な技術的なステップです。

MMSは原因などを介して病変コアに治療的に活性な液体の局所注入を可能にし、その実装内部のマイクロチャネルシステムにさらなる治療可能性を秘めています。、添付の浸透圧ミニポンプ^7。その意図された将来の臨床使用のために、MMS材料は、生体吸収性であるべきです。現在、ラクチドベースの材料からなるコネクタシステムの製造でありますテストされています。さらに、電子伝導体材料とMMSのコーティングは、損傷脊髄への治療電界を印加するために確立されます。

慢性脊髄損傷については、別の戦略は、数ミリの隙間が交差しな...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
PEG 600 Ph ユーロ	メルク/VWR	8,170,041,000
Gelastyptゼラチンスポンジ	サノフィアベンティス	PZN-8789582
ネスコフィルムシーラント	Roth	2569.1
Baytril	Bayer
Rimadyl (Carpofen)	Pfizer
Forene (Isoflurane)	Abbvie
Kodan (皮膚消毒剤)
Histoacryl (tissue glue)
Friedman-Pearson Rongeur, 1 mm cup, straight	ファインサイエンスツール	16020-14
インワンマイクロスパチュラ-12cm	ファインサイエンスツール	10091-12
デュモン#7鉗子 - イノックスメディカル	ファインサイエンスツール	11273-20
デュモン #5/45 鉗子 - イノックスメディカル	ファインサイエンスツール	11253-25
脊髄フック	ファインサイエンスツール	10162-12
はさみ	ファインサイエンスツール	14078-10
クランプ	Aesculap	EA016R
Ethicon Vicryl 4-0
Bepanthen Augen- und Nasensalbe	Bayer
解剖学的鉗子	ファインサイエンスツール	11000-13
自己保持型リトラクター	ファインサイエンスツール	17008-07
スキンクランプ	ファインサイエンスツール	13008-12
アルスプレー	セレクタベット

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