方法論記事

マルチチャンネルデュアル電界マイクロ流体チップを用いて、肺癌細胞の走電性の研究

DOI：

10.3791/53340

⸱

2015年12月29日

 ,  , 
1Research Center for Applied Sciences, Academia Sinica, 2Institute of Biophotonics, National Yang-Ming University, 3Biophotonics & Molecular Imaging Research Center (BMIRC), National Yang-Ming University, 4Department of Mechanical and Mechatronic Engineering, National Taiwan Ocean University, 5Ph.D. Program in Microbial Genomics, National Chung Hsing University

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

多くのマイクロ流体デバイスは、エレクトロタキシスの研究で使用するために開発されています。しかし、これらのチップのいずれも、細胞に対する化学的および電界(EF)の影響を同時に効率的に研究することはできません。私たちは、エレクトロタクシス研究で使用するために、より適切に制御された共存するEFおよび化学刺激を提供するポリメチルメタクリレートベースのデバイスを開発しました。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

直流電界（DCEF）の下方向の細胞遊走の挙動は走電性と呼ばれます。胚発生の間の細胞移動、細胞分化、および創傷治癒を誘導する生理的DCEFの重要な役割が多くの研究で実証されています。走電性アッセイにマイクロ流体チップを適用することによって、調査プロセスが短縮され、実験誤差が最小化されます。近年では、マイクロ流体デバイスは、ポリマー物質（例えば、ポリメチルメタクリレート、PMMA又はアクリル）またはポリジメチルシロキサン（PDMS）が広く、電気刺激に対する細胞の応答を研究に使用されてきたから成ります。しかし、PDMSデバイスを製造するために必要な多数の工程とは異なり、uidicチップFLアクリルミクロの簡単かつ迅速な構築は、デバイスの試作と生産の両方に適しています。しかし、報告されたデバイスのいずれも、同時化学とDCEの効率的な研究を促進していません細胞上のFの影響。本稿では、私たちのデザインと肺癌細胞の化学的および電気刺激の同時効果を調査するアクリル系マルチチャンネルデュアル電界（MDF）チップの製造を説明します。 MDFチップは、単一のテストでは、電気的/化学的刺激の8の組み合わせを提供します。チップを大幅に必要な実験時間を短縮するだけでなく、走電性の研究の精度を向上させるだけではなく。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

直流電界（DCEF）の下で陽極または陰極に向かって移動し、接着細胞の挙動は、走電性と呼ばれます。細胞のelectrotactic挙動は、胚形成、神経再生、および創傷治癒において重要な役割を果たしている。そのようなラット前立腺癌細胞、2乳癌細胞、3および肺腺癌細胞を4-8として1腫瘍細胞を適用DCEF下electrotactic動きを示しています。生理学的EFは、腺組織において測定された。9,10走電性はまた、腺に関連する腫瘍細胞において報告されている。2,3まとめると、癌細胞の走電性は、転移因子であると考えられている。 図11は、電気的なガイダンスを制御しますDCEF下の癌細胞は、癌の将来の治療のための潜在的なアプローチであり得ます。しかし、今日、走電性の詳細な分子メカニズムは依然として議論の余地があります。したがって、INFの調査癌細胞遊走に対する電気刺激のluenceは、癌治療のための戦略の開発を容易にすることができます。

最近、バイオマイクロ流体デバイスは 、インビトロで、12化学勾配、13および電気刺激4にせん断力を流す細胞応答を研究するために作製されています。 （また、アクリル系として知られているPMMA）、ポリジメチルシロキサン（PDMS）またはポリメチルメタクリレートを使用して、バイオマイクロ流体デバイスの製造に成功し、そのような実験の失敗率が低下しています。さらに、生物学的対象を調査するためのプロトタイプとしてアクリル系のマイクロ流体デバイスを使用して、PDMSチップを使用するよりも簡単です。アクリルベースの​​デバイスで様々な機能が走電性研究のために開発されてきました。しかし、以前の設計のいずれも、同時に走電性研究のための細胞の種々の化学的条件や電界の影響をテストすることができません。したがって、我々は、マイクロ流体デバイスを開発したムーデュアル電界（MDF）チップ含有4つの独立した培養チャネルと1つのチップで8つの異なる実験条件をltichannel。

最初の侯らによって報告されたアクリル系MDFチップ、。、8は電気刺激し、いくつかの化学的に分離されたチャネルを統合しています。これらの化学的に単離されたチャネルは、1つの実験において培養する細胞の種類を使用することができます。チャンネル内DCEFは、電力供給によって生成されます。二つの独立した電場の印加電界強度（EFS）を有するものと0 EFSとは別の、それぞれの化学的に単離されたチャネルで行われます。このように、チップは、より良い制御の共存EFおよび化学的刺激を提供します。また、MDFチップ内部の化学拡散の数値シミュレーションの結果は、交差汚染は、24時間の実験期間の後にチャネル間で発生していないことを示している。8

デビと比較するとLiらによって報告されCE。、14 MDFチップを電気的に刺激された細胞のさらなる生化学的分析を可能にするより大きな培養面積を提供します。また、MDFチップの大きな観察領域に、より多くの細胞が、試験で観察することができるので、電気的に刺激された細胞の移動速度やdirectednessの分析はより正確です。 Huangらにより報告された以前の研究の単一チャネルチップ設計4、ツァイら 15細胞または化学物質の一種類のみを試験することを可能にします。ただし、MDFチップは走電性に様々な化学物質の影響、ならびに細胞の異なるタイプの電気刺激の効果を調査するために使用することができます。つまり、MDFチップは、化学線量依存性を効率的に研究することができます。

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プロトコル

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1.設計とMDFチップの作製

  1. AutoCADなどの市販のソフトウェアを使用して、個々のアクリル層パターンを描画し、パターンを保存します。
    1. 図1Aの 4層アクリル板パターンの設計を見直し、層間接続を確認してください。
  2. CO 2レーザースクライバー（ 図1B、 図2A、 および図2B）を用いたレーザアブレーションによってすべてのアクリルシートと両面テープを製造する。16
    1. レーザースクライバーをオンにして制御するラップトップにマシンを接続します。
    2. 商用ソフトウェアを実行し、クリックすることで、ステップ1.1で設計されたパターンを開く」設計パターンファイルを。」
    3. レーザースクライバーのXYZステージ上の空白のアクリル板や両面テープ片を置きます。
    4. 自動alignmenアクリルシート又は両面テープの表面上にレーザービームの焦点を設定しますレーザースクライバーの製造元から提供されているTスティック。
    5. アクリルシートや両面テープを直接加工用レーザースクライバーに設計されたパターンを送信します。
  3. ピンセットを用いてアクリルシートの保護紙を取り外し、窒素ガスで清浄な表面を吹きます。
  4. アクリルシートを積層し、110で45分間熱ボンダーで2キロ/ cm 2の圧力下で一緒に結合 フロー/電気刺激チャネル組立体を形成する°C。
  5. チップ内の細胞培養基質として顕微鏡カバーガラスを準備します。
    1. 染色ジャーにカバーガラスを入れ、材料リストに記載されている洗剤の10倍希釈で瓶を埋めます。
    2. 超音波steri用洗剤にカバーガラスや染色ジャーを入れ、15分間カバーガラスを清掃してください。
    3. 染色ジャーの外に希釈した洗剤を注ぎ、蒸留水で瓶を再充填し、ステップ1.5を繰り返します。2〜3回。
    4. 両面テープに接着する前に、窒素ガスと一緒に吹き付けて清掃カバーガラスを乾燥させます。
  6. ステップ1.2でパターニング両面テープと流れ/電気刺激チャネルアセンブリに洗浄カバーガラスを接着。
  7. スーパー接着剤でMDFチップアセンブリのレイヤ1の個々の開口部にアクリルアダプタの13枚を接着。 MDFチップアセンブリは、完全な（ 図2D）です。
  8. 使用前にUV照射の30分で完全なMDFチップアセンブリを滅菌します。

MDFチップの塩橋ネットワークの2セットアップ

  1. 使用前に、121で15分間の保持時間を設定することにより、 図3Bに示されるすべてのプラスチックチューブ、指締めナット、およびマイクロ遠心チューブを滅菌 オートクレーブ中のCを°。
  2. 媒体入口を経由してMDFチップアセンブリにフッ素樹脂チューブ（ 図3B-i）を接続します出口アダプタは、 図1Aに示します。
  3. 媒体入口のルアーテーパーを接続し、3ウェイコックに図3B-iの中にプラスチックチューブ出口。
  4. 3 mlシリンジを用いてCO 2 -equilibratedリン酸緩衝生理食塩水（PBS）を2.5mlを取り、入口プラスチック管の3方コックに注射器を接続します。出口プラスチック管の3方活栓に、空の3 mlシリンジを接続します。 2つのシリンジは、このようにMDFチップを介して接続されています。
    注：37にPBSをインキュベート C 5％-CO 2細胞培養インキュベータO / N°CO 2 を得るために PBSを-equilibrated。
  5. 白色固体指締めナット（ 図3B-III）で、レイヤ1 PMMAシート上に青と緑のアダプタ（ 図1A）の開口部をシール。
  6. CO 2で塩橋チャネルおよび培養チャンバーを記入し、セットアップ手順2.4で説明したシリンジにPBSを-equilibrated。避ける気泡の形成。
  7. 次に、CO 2を入れはO / Nインキュベーション37℃5％-CO 2細胞培養インキュベーター中でPBS含有MDFチップ-equilibrated。これは、両面テープの溶存空気が室内に気泡を形成することができます。
  8. 2つのシリンジを使用してチャネルの急速なPBSの流れによってチャネル内の気泡を洗い流します。必要に応じて前後にPBSをポンプ。
  9. 媒体出口管に接続された3方活栓を介しチャンネルにPBSを排出します。
  10. 新しい3-mlの注射器を使用して、CO 2の2.5ミリリットルを取るダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）を（ステップ3.5を参照）-equilibratedと、新しいものと入口に接続注射器を交換してください。媒体とのチャネルを補充。
  11. 塩橋ネットワークの調製。
    1. 時間的に（> 70℃）、アガロース塩BRIに緑アダプタ（ 図1A）上（ 図3B-III）固体のナットを取り外して、3％のホット注入グリーンアダプタ（ 図1A）の開口部を通ってDGEチャンネル。
      注：ホットアガロースの調製：PBS 50ml中のアガロースの粉末1.5グラムを溶解します。オートクレーブ中で121℃で20分の保持時間を設定することにより滅菌します。
    2. 液体は塩橋のチャネルの長さの四分の三を埋める際にアガロースを注入停止します。
    3. アガロース注射後（ 図3B-III）固体ナットをねじ込むことによって緑アダプタ（ 図1A）に気孔をシール。
    4. 半透明の筒状の指締めナット（ 図 3B）と青アダプタ（ 図1A）の固体ナットを交換してください。
    5. 筒状のナット（ 図 3B-IV）にアガロース予備加熱し、3％をロードします。
    6. 前筒状のナット（ 図3B-IV）中のAg / AgCl電極（ 図 3B-V）を埋め込 ​​みますアガロースの凝固。
  12. 塩橋ネットワークのセットアップが完了した後、培養室に一つずつ室CL1-5肺癌細胞を注射します。

3.癌細胞の調製とElectrotactic実験用に設定

  1. 肺癌細胞株CL1-5の正規培養。
    1. 37で75T細胞培養フラスコ中の完全培地中で教授パンChyrヤン、17から得られた培養CL1-5肺癌細胞、 5％CO 2雰囲気下でC°。完全培地は、DMEM、10％ウシ胎児血清（FBS）で構成されています。サブカルチャー細胞ごとに3〜4日。走電性実験を行うために使用される細胞は、元のソースからの25未満の通路です。
  2. 指数関数的に増殖CL1-5細胞に0.25％トリプシン緩衝液2 mlを加え、37で2分間インキュベート 細胞detachmenため℃、5％-CO 2細胞培養インキュベータートン。
  3. 10％FBS DMEM 6 mlの脱離プロセスを終了し、室温で5分間300グラムで細胞を遠心します。その後、培地を廃棄し、PBS 5mlで細胞ペレットを懸濁します。
  4. PBS中の細胞数をカウントします。その後、室温で5分間、300gで1×10 6個の細胞と遠心分離機を取ります。
  5. PBSを捨てます。予め温めておいたCO 2 -equilibrated DMEMで細胞を懸濁し、1×10 6細胞/ mlであることが細胞密度を調整します。
    注：37に完全培地をインキュベート C 5％-CO 2細胞培養インキュベータO / N°CO 2 を得た DMEMを-equilibrated。

4. Electrotactic実験用に設定

  1. MDFチップの出口から、チップへの細胞の0.3ミリリットル、1×10 6 / mlで、注入します。
  2. 細胞培養インキュベーター中で細胞を播種したMDFチップをインキュベート（37に設定 2-4時間、℃、5％CO 2）。
  3. MDFマイクロのセットアップ流体システム。
    1. 透明なインジウムスズ酸化物ガラス（ITO）、ヒーターの上にMDFマイクロ流体システムをインストールします。 MDFチップとITOガラスの間にクリップされたK型熱電対を持つMDFチップの温度を測定します。比例積分微分（PID）コントローラを用いてITOヒータを制御します。 37 MDFマイクロ流体システムのインキュベーション温度を設定します PIDコントローラとC°。
      注：ITOヒーターの製造および細胞培養加熱システムのセットアップは、以前の報告に記載されている18,19。
    2. 倒立顕微鏡にコンピュータ制御XYZ電動ステージ上の温度制御のMDFチップアセンブリをマウントします。電動ステージの使用は、ステップ5.1に記載されています。 4チャンネルシリンジポンプで注入口を介して培養室に完全培地をポンプ。
  4. 20マイクロリットル/ hrの流量でMDFチップに完全培地をポンプ。外からの培養廃棄物（ 図3Aの 「廃棄物」として示される）マイクロ遠心チューブに回収することができます。
  5. MDFチップに37℃でさらに16〜18時間、細胞をインキュベートします。
  6. 培地を交換するには、10分間、20μL/分の流速で各培養室に、それぞれ50、25、5、0μMキナーゼ阻害剤を含む培地ポンプ。
    注：10.6 mgのキナーゼ阻害剤を、滅菌水3mlを添加することにより、Rho関連プロテインキナーゼ阻害剤Y27632の1​​0mMストック溶液を調製します。 10％FBS DMEM培地を用いて、それぞれ、50、25、及び5μMに10mMのストック溶液を希釈します。
  7. 37℃でさらに60分間、キナーゼ阻害剤で細胞をインキュベートします。 / hrで20μlに培地流量​​を設定します。同じ培養温度を使用し、後のステップで上記の流量。
  8. チップ上のAg / AgCl電極を介してMDFチップに直流電源を接続する電気配線を使用します。
  9. 逐次電流計Iを接続n個の電気回路。 MDFチップの電流を監視するための電流計を使用してください。
  10. DC電源をオンにして、15〜19 Vに電源​​電圧を調整することにより、86.94μAの電流計電流を設定
    注：オームの法則を考えると、私はバルク材料に流れる電流、 すなわち 、electrotacticチャンバ内の培地で、E = I /（σAのEFF）、σ（= 1.38Ω-1 M - 1）であります培地の導電率（0.07ミリ×高さ3mmの幅のために= 0.21 平方ミリメートル）effは electrotactic室の有効断面積であり、電流（I）は、300 MV / MMを生成するために必要MDFチップ内のEFは86.94μAです。

5.細胞画像の取得と解析

  1. MATLABのGUIプログラムを使用して、電動ステージを制御します。 microscoに搭載されたMDFマイクロ流体システムでPEは、電動ステージを使用して観察領域にチップを移動します。
  2. デジタル一眼レフ（SLR）カメラを用いて記録する細胞画像は、顕微鏡に取り付けられました。
  3. 2時間15分の間隔で4倍の対物レンズを使用して顕微鏡画像を取ります。
  4. 細胞遊走分析。
    1. NIH ImageJの1.47 Vを実行します
    2. セルの重心の最終位置に初期からの距離を分析します。
    3. 「ファイル」→「インポート」→「イメージシーケンス」に移動し、細胞遊走の分析のための9つの画像をインポートします。最初のイメージは、ゼロ時間の結果であり、最後の画像は、120分の結果です。
    4. →「 測定の設定」し、次の「 重心」のボックスをチェックし、「 分析」に進みます
    5. 「 フリーハンド選択」アイコンをクリックします。
    6. 最初の画像で選択されたセルのエッジを示しています。
    7. 「編集」に進みます→ 「 選択」→「Manager への追加」
    8. 第九の画像に移動し、最初のイメージに選択された同じ細胞のエッジを示しています。セル位置は、第八の画像の2番目のを使用して追跡することができます。
    9. →「Managerへの追加」「編集」→「選択」に進みます
    10. 繰り返し、90〜100個の細胞からデータを収集するために5.4.9に5.4.5を繰り返します。
    11. 選択したセルの最初と最後の位置の結果を得るために→「分析」「測定」に進みます 。
      注：移動速度は、時間当たりの平均細胞運動の長さとして定義されます。 directednessは、（陽極から陰極へ）DCEFのベクターおよびその最終位置への細胞の出発点からのベクトルの間の角度である余弦として定義されます。 directednessは陰極に向かって移動する細胞のための陽極に向かって移動する細胞のための-1、+ 1です。ランダムマイルのグループの場合細胞格子、directednessは0.2です

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結果

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MDF装置の製造および組み立て

アクリル系MDFチップの模式図は 、図1Aに示されています。四アクリルシート、1つのカバーガラス、13アクリルアダプタ、両面テープ片が完了MDFチップ（ 図2D）の組み立てに使用されました。 MDF装置で唯一4つの独立した文化チャンネルがあります。しかし、オンチップの塩橋ネットワークは、チップの8つのセグメントで8つの異なる実験条件を作成します。三つの塩橋（ 図1Aのレイヤ2における青チャンネル）、79、90、長さ80 mmのは、画像の観察を妨害することなくMDFチップの第二の層に結合させました。 0を持つ塩橋ネットワークと培養室との間に小さな孔（レイヤ3および図1Aの 4の青い直方体チャンネル）、.25 mm 2の断面積は、実験...

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ディスカッション

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私たちは、トリッキーなことをMDFチップのレイヤー1の上にアクリルアダプタを付着させる工程を発見しました。スーパー接着剤のわずか1〜2μLの適用はしっかりとMDFチップ上にアダプターを接着するのに十分です。接着剤より多量のは、スーパー接着剤と接着するための失敗の不完全な重合をもたらしました。アクリルアダプタがしっかりとMDFチップ上に付着させた後は、マイクロ流体システム内の液体の漏れはほとんど発生しませんでした。また、真空チャンバー内のO / Nインキュベーションは、両面テープ/カバーガラスや両面テープ/アクリルシート界面の間に閉じ込められた空気を除去するのに役立ちました。したがって、このプロセスは、MDFチップにおける培養室の安定性を高めます。

塩橋ネットワークの製造中3％アガロースの温度制御が重要です。アガロースの温度は注入時に十分に高くない場合には、アガロースはすぐに注射器の内側に固化し、できないでしょう塩橋ネットワークに注入されます。また、アガロース注入時には、塩橋ネットワーク内の任意の気泡形成を回避することが重要です。泡の外観は非常にネットワークの電気抵抗を増加させ、実験...

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開示事項

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著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

謝辞

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この作業は、台湾の科学技術部によって財政的に支援されています（契約番号MOST 103-2113-M-001 -003 -MY2)および台湾中央研究院のナノサイエンスおよびナノテクノロジーに関する研究プログラム。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Reagent
DMEM mediumGibco,Invitrogen, USA12800-017
Fetal Bovine SerumGibco,Invitrogen, USA16000-044
TrypsinGibco,Invitrogen, USA25200-072
PBSBasic LifeBL2651
Y-27632 (塩酸塩)ケイマンケミカル株式会社10005583
アガロースLONZO、アメリカSeaKem LE AGAROSE
シリンジテルモ3 ml ルアーテーパー
3 ウェイストップコックニプロルアーテーパー
PMMA (アクリル)HiShiRon Industries Co., Ltd, 台湾厚さ 1mm、2mm
アクリルアダプターKuanMin Technology Co., Ltd,台中、台湾1 / 4-28ポート、10x10x6 mmカスタマイズ
ナットThermo Fisher Scientific Inc.UPCHURCH:P-206x、P-200x、F120x、P-659、P-315x
顕微鏡カバーガラスDeckgläser, ドイツ24x60 mm
両面テープ3MPET 8018
瞬間接着剤3Mスコッチリキッド プラス 瞬間接着剤
TFD4 洗剤Franklab, FranceTFD4
超音波ステリクリーナーLEO ULTRASONIC CO., LTD., 台湾
サーモボンダーKuanMin Technology Co., Ltd, 台中, 台湾カスタマイズされた
CO2レーザースクライバーLTTグループ、台湾ISL-II
比例-積分-微分(PID)コントローラーJETECエレクトロニクス株式会社、日本TTM-J40-R-AB、
K型熱電対TECPELTPK-02A
4チャンネルシリンジポンプKdScientific、米国250P
DC電源GWInstek、台湾
X-Y-Z モーターステージTanLian, E-O Co. Ltd., 台湾カスタマイズ
倒立顕微鏡オリンパス, 日本CKX41
デジタル一眼レフカメラキヤノン, 日本60D
付き付き

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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