ヒト末梢血からの血液伸長内皮細胞の生成と文化

最近までは、新しい血管の出生後の発生は、既存の血管の内皮細胞からの新しい血管の出芽のように定義される、血管新生と呼ばれるプロセスを介して排他的に起こると考えられていた^。1このプロセスは、脈管形成の対比、または胚発生の間に排他的に起こると考えられていた血管内皮前駆細胞からの血管のデノボ形成²が、より最近の研究では、同定され、成人の末梢血中の内皮前駆細胞（EPC）を循環する単離しました。これらの細胞は、培養中で成熟内皮細胞に分化する能力を有し、出生後の血管に関与すると考えられている^。3,4

これらのEPCの単離および拡張のためのプロトコールは、典型的にはvascul含む内皮増殖因子を含む培地で、末梢血単核細胞（PBMNCs）の培地を含みますAR内皮増殖因子（VEGF）および線維芽細胞増殖因子-2 ^5-8 EPC培養は劇的に異なる細胞型の多様性を生み出します。初期の文化（<7日）は、「初期」のEPCとして文献で知られている単球細胞の種類によって支配されています。その名前にもかかわらず、これらの細胞は、単球マーカーCD14を発現し、前駆細胞マーカーCD34について陰性であると古典内皮マーカーCD31およびVEGF受容体2（VEGFR2）の最小限のレベルで発現する^。5継続文化は、細胞の二次集団に生じます後半伸長のEPCまたは内皮様細胞のように控えめなコロニーを出現する血液伸長内皮細胞（BOECs）、として知られています。単球の早期のEPCとは異なり、また、内皮コロニー形成細胞（ECFCs）、伸長内皮細胞または後期成長内皮細胞と呼ばれているBOECsは、内皮細胞単層の典型的なものである敷石状の形態を示し、表面マーカーに非常に似ています5遺伝子発現^{9は、内皮}細胞に成熟します。

末梢血からの内皮様細胞の生成は、特に、肺動脈性肺高血圧症^（PAH）10またはフォンヴィレブランド病などの血管障害に関連した内皮細胞の機能不全の研究のために、いくつかの利点を提供しています^。11前BOECsの可用性に、内皮細胞は死だけや臓器移植の際に外植臓器由来、または出生時の臍帯静脈から単離することができました。この減少可用性は、内皮、心臓血管疾患の患者由来の細胞、ならびに内皮細胞および血液細胞または壁細胞のいずれかの間の相互作用の生物学の理解に重大な制限を表します。また、これらのソースからの内皮細胞の純粋な集団を単離し、培養して技術的に困難であり、これらの方法によって誘導された細胞のみが限られを示しますD増殖能力。 BOECsは、したがって、患者由来の初代内皮細胞の単離および培養のための貴重な代理を提供しています。

それらのインビトロ用途に加えて、BOECsは、自家細胞移植療法においても有用である可能性があります。これらのアプリケーションは、内皮細胞の血管新生を促進するための移植^（12およびその中の参考文献を参照のこと）、ならびに人工多能性幹細胞（iPS細胞）の発生の両方を含む^。13 BOEC由来のiPS細胞は、疾患のモデリングのために使用され、出発物質として巨大な可能性を提供することができ自家細胞治療用材料。 BOECsは、より速く、皮膚線維芽細胞よりも高い効率で再プログラム。さらに、BOECsも翻訳アプリケーションに適して任意の技術の本質的な特徴である、核型異常のないiPS細胞の生成を可能にします。患者の血液サンプルAからiPS細胞を生成する能力LSOは、それによって創傷治癒障害を有する患者からの細胞の発生を促進する、皮膚生検および皮膚線維芽細胞の生成のための必要性を排除する、または非常に若いです。

以下に詳述するプロトコル、によって承認され、国家研究倫理サービス委員会（東イングランド）のガイドラインに沿って行われ、比較的小容量から90％以上の効率でBOECsの生成のための、シンプルで信頼性の高い方法を提供する（60 ml）の末梢血。これらの細胞は、高度に増殖性であり、単一の血液サンプルからの細胞の数百万の生成を可能にする、繰り返し継代することができます。

BOEC生成プロトコルの概略図を図1に示されています。

1.採血や密度勾配遠心

1. 各ドナーのために、2つの50mlコニカル遠心管のそれぞれにクエン酸ナトリウムを3mlを加えます。静脈穿刺によって血液の60ミリリットルを収集し、各チューブに30ミリリットルを追加します。混合する優しく2〜3回反転します。それに応じて調整クエンボリュームで、プロトコルで血液のわずか40ミリリットルを使用してください。
   注：血液サンプルを採取後2時間以内に処理されることが不可欠です。成長コロニー収率の著しい減少で血液結果の処理を遅延。
2. まず混合するボトルを数回反転させて密度勾配遠心分離媒体を含む新しいコニカルチューブを準備します。無菌フードでは、50mlコニカルチューブ（血液のすべての10ミリリットルのための1チューブ、ドナーあたり6チューブ）あたりの密度勾配遠心分離培地の15ミリリットルを追加します。
3. ダルベッコのリン酸を1：1に希釈血液-Buffered生理食塩水（DPBS）。作業面と20°の角度に密度勾配遠心分離媒体を含むチューブを傾け。ピペットエイドおよび25 mlの血清学的ピペットを使用して、ゆっくりと徐々に傾斜管の壁ダウン血液を添加することにより、媒体上に希釈された血液を21 mlのレイヤ。
   注：これを行うと、密度勾配層と血液の混合を最小限に抑えることができますし、より厳しいバフィーコートだけでなく、強化された収量を生成します。
4. アクセルとブレーキをオフにして室温で35分間、400×gで遠心分離し、サンプル。
5. 2.4 - この遠心分離期間中、ステップ2.1で詳述コラーゲンコーティングを開始します。これらの手順は、3.1のステップに進む前に完了していることを確認します。

T-75フラスコおよび培養培地の調製の2コラーゲンコーティング

注：細胞培養​​フードで次の手順を実行します。

1. 在庫のTyを希釈して50μg/ mlのコラーゲン溶液を準備します私は0.02M酢酸10mlにコラーゲンPE 例：コラーゲン在庫について4.05 mg / mlの、0.02 M酢酸10 mlにコラーゲンの123.5μLを加えるの濃度で。滅菌フィルターコラーゲン懸濁液を使用前。
2. 血清学的ピペットを使用して、T 75、細胞培養フラスコへのコラーゲン溶液の7.5 mLを加え。このボリュームは、5μgのコラーゲン/ ^cm 2の（または375μgの/フラスコ）を与えます。 RTで1時間コートフラスコ。
3. メーカーが提供する成長因子サプリメントと内皮基礎培地を補充することによってBOEC生成に使用される血管内皮増殖培地を準備します。すべてのサプリメントを追加するが、血清を追加しないでください。 BOEC生成培地15mlのを準備するために、成長因子サプリメントを含有する内皮増殖培地の12.5 mlに定義されたウシ胎児血清（FBS）を2.5mlを加えます。
4. 、1時間のコーティング期間の後第3節で説明したステップに進んでコラーゲン溶液を吸引し、ピペッティングにより残留酢酸を洗い流します10ミリリットルのDPBSインチDPBSを吸引除去し、もう一度この洗浄ステップを繰り返します。ステップ3.3の間に得られた細胞懸濁液は、この時点でめっきする準備ができていない場合は、乾燥アウトからコラーゲンコーティングを維持するためにフラスコにBOEC世代媒体5mLのを追加します。

3.収集とPBMNCsのめっき

1. ステップ1.4において概説密度勾配遠心分離後、注意深く滅菌プラスチック製トランスファーピペットを用いて、軟膜層を収集します。軟膜の収集は、各チューブからの細胞懸濁液とプラズマの約20ミリリットルが得られるはずです。密度勾配媒体を移送避けます。
2. 単核細胞懸濁液1を希釈：DPBS中1と混合するために反転します。最大でブレーキとアクセルで300×gで20分間、室温で遠心分離します。
3. 遠心分離した後、ダウンを繰り返し、各ペレットにBOEC世代培地1mlを添加し、ピペッティングにより上清および再懸濁細胞を吸引します。プール細胞は、懸濁液残りの培地で10mlにDトップアップ総容量。
4. 総細胞数、細胞懸濁液のサンプルを10μlの推定を取得し、赤血球を溶解しますチュルク液490μLで50倍に希釈します。血球計数器を用いて希釈細胞懸濁液の10μlのサンプルをカウントします。
   注：血液の60mLのがめっきに約100〜150×10 ⁶の白血球細胞が得られるはずです。
5. シングル、コラーゲンコートT-75フラスコにプレート全体の細胞懸濁液_、5％CO 2を含む加湿雰囲気中で37℃で15mLの/フラスコと文化にトップアップ中量。この時点で播種した細胞は、継代0を表します。
   注：これは、後で、またはBOECsを生成することができる別の研究所にPBMNCsを輸送するためにBOECsを導出するために前のBOEC分離に孤立PBMNCsを凍結することが可能です。しかし、凍結PBMNCsはBOEC分離の効率を低下させることができることに留意することが重要です。 S方法については、以下のEE部8。

4.長期細胞培養

1. 新鮮BOEC生成培地15mlを加えることによって、培地を2日毎に変更（5：内皮細胞増殖培地の1：1混合物およびFBSを定義）。週末のために、培地の変更は、3日ごとに遅延させることができます。
   注：伸長コロニーを培養7日および14日の間に表示されます。
2. 成長コロニーの出現のために日7月14日にBOEC培養フラスコを監視します。古典的な内皮石畳の形態を示す細胞の円形グループなどのコロニーを識別します。
3. コロニーまたは複数のコロニーをフラスコ内で識別されると、メディアの変更を続行し、コロニーが継代前にコロニー当たり約1000〜2000個の細胞まで成長することができます。ラフ視覚推定を通じてコロニーあたりの細胞数を決定します。
   注：ガイドとして、それは一週間最初の成長コロニーの同定後の経過初期の成長コロニーのが通例です。
<LI> DPBS 10mlで二回フラスコをすすぐことによって継代細胞。 1Xトリプシン-EDTAの5 mlを加え、5分間37℃のインキュベーターでインキュベートします。 5分後、培地（FBSを含有する）を10 mlのトリプシンを中和し、ピペット操作を繰り返すと、懸濁液中に細胞をもたらします。
4. 遠心5分間300×gでサスペンション、新鮮BOEC世代培地15ml中に再懸濁し、（継代1、P1を表す）は、新しいT-75フラスコに、全細胞懸濁液をプレート。いいえコラーゲンコーティングは必要ありません。
5. 細胞がコンフルエント（フラスコ当たりおよそ3〜5×10 ^{6個の細胞} ）になるまで上記のように培地交換を続けます。コンフルエント後、継代細胞、ステップ4.3に記載のように。
   注：以降通路2から、細胞はもはやBOEC生成培地を必要とせず、内皮細胞増殖培地と10％の標準的な熱不活性化FBSで培養することができます。コラーゲンの存在がBOEC proliferを高めることができることを示唆する証拠があるので、コラーゲンコーティングは、今後の任意のステップとして使用することができエーション率。
6. 継続継代のために、などの低細胞密度がBOECsが増殖を停止させることができ、T-75フラスコあたり75万細胞よりも少ないプレートなし。

5.凍結融解BOEC文化

1. 5分間300×gで4.3節と遠心分離機で説明したように細胞をトリプシン処理。培地10mlに再懸濁上清を吸引除去します。これは、内皮細胞増殖培地を必要としません。 10％標準FBSを含むDMEMで十分です。血球計数器を使用して、手動細胞数を実行するように細胞懸濁液の10μlのサンプルを収集します。
2. 氷のように冷たい凍結保存培地（50％FBSおよび10％DMSOを40％のDMEM）で2×10 ⁶細胞/ mlで再遠心し、再懸濁します。液体窒素に転送する前に少なくとも2時間、-80℃の冷凍庫で氷冷イソプロパノール凍結保存容器と場所に場所バイアルを、各バイアルに0.5ミリリットル（10 ^6細胞 ）を追加します。以上24時間-80℃で細胞に放置しないでください。 セルを解凍するには、15ミリリットルコニカル遠心チューブに予め温めた培地10mlを追加します。
   注：継代1細胞を解凍する場合、解凍後の最初の2日間のFBSを定義して20％を補充した内皮細胞増殖培地中に解凍します。これは、今後、より安定した細胞の単離につながります。
3. わずかな氷の結晶がバイアル内に残されるまで、穏やかに攪拌しながら37℃の水浴中で液体窒素と融解から細胞を取り出します。コニカル遠心チューブにバイアル滴下の内容を追加し、5分間300×gでスピンダウン。
4. 10ミリリットルEGM-2MV + 10％FBS中で上清を吸引および再懸濁細胞ペレット。 T-75フラスコとトップまで15ミリリットルの培地に追加します。

フローサイトメトリーによるBOECsの6キャラクタリゼーション

1. 染色緩衝液1ml当たり10 ⁶細胞の濃度でセクション4.4および再懸濁で説明したように第4節で説明BOECコロニーは、トリプシン処理細胞を拡大することが許可されたら（DPBSウィットH 2％FBSおよび2mM EDTA）。
2. CD45、CD14、CD34、CD31（一時20希釈ですべてを使用）またはVEGFR2（1:10希釈）（詳細については表1を参照）に対する蛍光標識抗体を用いて10 ^{5個の細胞}を結合します。暗所で4℃で30分間インキュベートします。
3. 5分間300×gで1ミリリットル染色緩衝液および遠心分離で細胞を洗浄します。上清を吸引し、分析のために400μlの染色緩衝液中に再懸濁します。 4℃で細胞を維持し、分析前に、光から保護。
4. アッセイで使用する蛍光標識抗体を検出するために装備サイトメーター上のサイトメトリー分析を実行します。
5. 前方調整および側方散乱電圧だけでなく、FITCおよびAPCのチャネルの電圧によってサイトメーターで細胞集団を識別するために染色されていないBOECサンプルを使用してください。
6. 各蛍光色素のためのアイソタイプ染色された細胞を使用してしきい値をゲートするかを決定します。 presencに基づいて、各細胞表面マーカーの陽性を評価蛍光色素のためのアイソタイプコントロールに対する蛍光強度のピークシフトのeが分析されています。

免疫蛍光顕微鏡によるBOECsの7キャラクタリゼーション

1. プレートBOECs内皮細胞増殖培地500μl中5×10 ^{4個の細胞}ウェル当たり+ 10％熱不活性化FBSの密度でカバースリップなしの24ウェル、平底組織培養プレート中で、37に付着して成長するままにC°、5％CO ₂の細胞がウェル（光microsope下で目視検査によって推定コンフルエントに）それぞれの面積の少なくとも70〜80％をカバーするまで。
2. DPBS 1mlで5分間、各ウェル中の細胞を洗浄します。
3. DPBS中の4％パラホルムアルデヒド溶液500μlを用いて4℃で細胞O / Nを修正。
4. ウェルあたりのDPBS 1mlで3×5分間、細胞を洗浄します。それぞれ、ピペットと吸引器を使用して、DPBSを追加し、削除します。
5. DPBS中0.2％のポリソルベート20で3×10分間、細胞を透過性。 DPBS中に10％FBSを含有するブロッキング緩衝液中で室温で1時間、細胞をインキュベートします。
6. またはvWFを（1：250）：CD34（10 / mlの）、CD144（300 1）に対する一次抗体を含む抗体希釈緩衝液（DPBS中の0.1％ウシ血清アルブミン）300μlの中で4°CO / Nで染色細胞。詳細については表1 を参照してください。
7. DPBSで5×10分間の未結合の一次抗体を洗い流します。
8. （1：200ですべての） 表1に詳述するように、適切な蛍光標識二次抗体と室温で1時間、細胞をインキュベートします。
9. DPBSで5×10分間、非結合二次抗体を洗い流します。
10. RTで10分間、DPBS中1μg/ mlの4 '、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）で細胞をインキュベートします。
11. さらに3×5分間DPBSで細胞を洗浄。
12. アタッチ用いた蛍光励起用の外部光源を備えた倒立顕微鏡を用いて100倍の倍率で画像セル、キャプチャ画像その後の分析をオフラインでのEDデジタルカメラ。

8.凍結融解PBMNCs

1. ステージ3.2の終了時に、遠心分離後、培地を吸引し、手動で繰り返しピペッティングを上にして、およびP1000のピペットチップを使用したダウン細胞ペレットを崩壊させます。細胞懸濁液を生成するために穏やかに混合することを確認し、凍結培地、90％血清、10％DMSO中の1ミリリットルを追加します。第5節で説明したようにクライオバイアルと凍結融解に細胞懸濁液を転送します。

血液を60mlのバフィーコート単核細胞の単離は、典型的には6 100-150x10総白血球をもたらします。単一のT-75フラスコにプレーティングしたとき、未溶解細胞懸濁液中の細胞の大多数は、それが困難な明視野顕微鏡を使用して、個々の接着細胞を解決することができます。繰り返し中の変更は、非接着細胞のクリアランスをもたらし、「初期」のEPC単球の接着性の人口の可視化を可能にします。 7日目に、T-75は、約7×10 6これらの細長い接着細胞のが含まれています。 7〜14日から、BOECsのコロニーをフラスコ（ 図2A）内に表示されます。コロニーは、最初の3〜5に隣接するセルとして表示されます。伸長コロニー数は、血液の60 mlのあたり1から10個のコロニーから変えることができます。一般的には、（ すなわち 、20〜25歳）の若いドナーはまた、以前の文化の中で表示される成長コロニー、より多くの数を生成する傾向があります。BOECsは、数百の細胞からなる円形のコロニーを形成する細胞のこの中央のグループから増殖します。これらのコロニー内の細胞は、古典的な内皮石畳の形態を示します。

彼らは植民地あたり約1000個の細胞が含まれている場合には、通路初期コロニーに好適です。伸長コロニーは、通常7日文化の中で彼らの元の外観の後にこのサイズに達します。元のコロニーを新たなT-75フラスコに継代されると、それらは（ 図2B）、5日以内にコンフルエントな単層（フラスコ当たり3-5x10 6細胞 ）を形成するように増殖しなければなりません。アイソレーションの小さな割合（<10％）で、成長コロニーが表示されない、またはこの初期継代工程の後に、十分に増殖しません。彼らの最初の継代後の低増殖性を示すBOECsはほとんど安定BOECアイソレーションとなり、多くの場合、2〜3の通路内に増殖を停止するために行くん。単球のBOECの文化の中に含まれている初期のEPCは、非増殖性であり、典型的には1-2の通路内の培養液から消去されます。これらの初期の細胞のクリアランスは、継代を繰り返し継代と非増殖初期のEPCの希釈後に再付着する初期の細胞の故障細胞死に起因するものです。

継代1細胞を、培養中にさらに継代または後で使用するためにダウンして凍結することができます。安定した分離が生成されると、細胞が静止になる前に通路8または9までアップ3-5新しいT-75フラスコに1コンフルエントなフラスコの割合で継代することができます。ここでも、細胞密度は文化を通じて重要です。我々の経験では、ないより少ない75万よりも細胞は増殖停止を引き起こす可能性が低い細胞密度として、T-75フラスコ中に播種する必要があります。 BOECsの高い増殖能力にもかかわらず、細胞は、このような（フラスコ当たりすなわち 、> 5×10 6細胞 ）overconfluentになることを許されるべきではないCONVERSを引き起こす可能性があります非増殖性の表現型へのBOECsのイオン。

我々はBOECとして標識されている任意のセルは、内皮マーカーのための適切な細胞表面および細胞内染色を表示することを提案しています。 BOECsの特徴付けは、典型的な内皮細胞マーカーについて染色後、フローサイトメトリー（ 図3）または蛍光顕微鏡（ 図4）によって達成することができます。 BOECsは、内皮表面マーカーCD31とVEGFR2について陽性であると、単球マーカーCD14および汎白血球マーカーCD45について陰性です。 BOECsもヴァイベル - パラーデ体をposessため、ディスクリート、斑点状の細胞質染色としてフォンビルブランド因子（vWF）を発現します。例えば、肺動脈または大動脈内皮細胞などの他の成熟内皮細胞型とは異なり、BOECsは、それらの表面上に前駆細胞および活性化マーカーCD34を発現します。

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BOEC生成プロトコルの図1の概略図。末梢血単核細胞は、定義されたFBSを含む内皮細胞増殖培地中のコラーゲンコートしたプレート上での密度勾配遠心分離して培養することにより静脈血から単離されます。 BOECコロニーを培養の7〜14日以内に表示されます。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図代表BOEC文化の2明視野画像。（A）伸長コロニーは石畳の単分子層に配置され、中心点から放射状に増殖している内皮様細胞の集合体として存在日7と14のコロニーの間の文化に表示されます。周囲の成長コロニーは付着モノです初期の培養中の細胞の大部分を構成するcytic細胞。先に説明したように、これらの細胞は、「早期の」内皮前駆細胞は、紡錘状の形態を有しており、単球マーカーCD14を発現します。非増殖性単球細胞が死滅するか失敗のいずれかとして継代後（B）は、増殖性の高いBOECsは継代後に再接続するために、文化を引き継ぎます。スケールバー250μmの。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図フローサイトメトリーによるBOECsの3キャラ。BOECsをトリプシン処理し、特定の表面マーカー（赤線）に対する蛍光コンジュゲートアイソタイプコントロール抗体（満たされたピークを灰色）、または抗体で染色しました。サイトメトリー特性評価のための表面マーカー造血マーカーCD45およびCD14、内皮マーカーCD31とVEGFR2とprogentiorおよび内皮活性化マーカーCD34を含むこの図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

内皮細胞マーカーにBOECsの図4.免疫蛍光染色。BOECsの代表的な免疫蛍光画像は、内皮細胞表面マーカーCD144（VEカドヘリン、右上のパネル）およびフォンヴィレブランド因子（vWF、右下のパネル）糖タンパク血に対する抗体で免疫染色。核DAPI染色を示す対応するパネルが左側に表示されます。スケールバーは50μm。 CD144のため。 拡大表示はこちらをクリックしてくださいこの図のバージョン。

著者らは開示するものは何もない。