レシオメトリック蛍光顕微鏡によってファゴソームのpHを測定します

サマリー

ファゴソームのpHは、ファゴソームの成熟、酸化剤の生成、ファゴソームの死滅、抗原の提示に影響を与えます。ここでは、蛍光顕微鏡法を使用して、生きた食細胞の個々のファゴソームの時間経過とエンドポイントのpH変化を測定するためのレシオメトリック法について説明します。

要約

食作用は、先天性免疫細胞が死滅させるかまたは中和摂取材料を、または抗原として​​それを提示し、適応免疫応答を開始するために、細菌、アポ​​トーシス細胞または他の異物を飲み込み、それを通して基本的な過程です。ファゴソームのpHは、内膜およびタンパク質分解酵素の活性化、食作用性空胞が分解オルガネラに成熟することを可能にするイベントと核分裂や核融合を制御する重要なパラメータです。加えて、H ⁺との転座は、他の宿主組織への効率的な殺傷及びシグナリングのために必須である活性酸素種（ROS）の高レベルの産生のために必要とされます。多くの細胞内病原体は、フ​​ァゴソームの生物学におけるpHの重要性を強調し、ファゴソーム酸性化を制限することにより、食細胞死滅を覆します。ここでは、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）を使用して、好中球にファゴソームのpHを測定するためのレシオメトリック法は貪食TARGとしてザイモサンを標識説明しますETS、ライブセルイメージング。アッセイは、単一色素の蛍光よりもむしろ絶対的なpH依存性比の定量を、可能にする、440 nmで励起した場合、490nmで励起した場合、酸性pHによりクエンチされないが、FITCの蛍光特性に基づいています。 インサイチュ染料較正及び実際のpH値との比の変換を行うための詳細なプロトコルも提供されます。彼らは、このような漂白などの摂動に対する感度が低いなどの単一染料レシオメトリック法は、一般的に測定された信号を歪ま変化、レーザーの変動、および不均一なラベルを、集中、単一の波長またはデュアル色素擬似レシオメトリックのプロトコルよりも優れて考えられています。この方法は、容易に他の食細胞タイプのpHを測定するために変更することができ、及びザイモサンは、不活性ビーズからの生きた微生物を、任意の他のアミン含有粒子で置き換えることができます。最後に、この方法は、異なるpH範囲に感受性の他の蛍光プローブまたは他のphagosomを利用するように適合させることができますアル活動は、それファゴソームの機能イメージングのための一般的なプロトコルとなっています。

概要

食作用は、自然免疫細胞が大きな粒子を飲み込むプロセスで、単細胞生物の摂食メカニズムから進化したもので、標的に結合し、膜で包み込み、膜をつまんでファゴソームと呼ばれる細胞質内に液胞を形成することを含みます。ファゴソーム膜は原形質膜に由来しますが、活性タンパク質と脂質の選別、およびファゴソーム形成中の膜内膜との融合により、ファゴソームは細胞内で明確なオルガネラに変換され、分解特性により、摂取された物質の殺傷、中和、および分解が可能になります^1-3.このプロセスは、ファゴソーム成熟と呼ばれ、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸(NADPH)オキシダーゼを含む多くのタンパク質分解酵素および微殺酵素の送達に依存しており、電子をファゴソームに伝達して強力な酸化剤O₂^-およびその誘導体活性酸素種(ROS)^{を生成します2,4}。

ファゴソームの管腔pHは、ファゴソームの機能に必要ないくつかの事象に深い影響を与えます。まず、膜貫通型輸送調節因子のpH依存性コンフォメーション変化は、Arfs、Rabs、小胞性コートタンパク質などの輸送決定因子の動員を変化させ、その結果、どの小胞がファゴソームと融合するかを定義するため、pHは一般に内膜の輸送に影響を与えます^5-8。第二に、ファゴソーム内腔のイオン組成もファゴソームが成熟するにつれて変化し、食細胞機能を促進するNa⁺/H⁺交換体やClCファミリーCl^-/H⁺アンチポーターなどの一部のイオントランスポーターは、H⁺転座に依存している^9,10。同様に、ROS産生はファゴソームのpHと密接に関連しています。ROSとその有毒な酸化副産物は、好中球^4,11,12のファゴソーム死滅に重要であると長い間認識されており、マクロファージ、樹状細胞(DC)、アメーバ^13-16などの他のファゴサイトでも重要な役割を果たすことが示されています。NADPHオキシダーゼは、NADPHが消費されるとサイトゾルでH ⁺を放出する電気起源酵素であり、輸送された電子と一緒にファゴソーム内腔に輸送された電子と一緒にコンパニオンHVCN1チャネルを介してH ⁺を同時に移動させる必要があります^酵素17-21の自己阻害につながる大規模な脱分極を緩和するために.最後に、いくつかのタンパク質分解酵素は異なるpHで最適な活性を持つため、時間依存的なファゴソームpHの変化は、どの酵素がいつ活性になるかに影響を与える可能性があります。ファゴソームpHの重要性は、結核菌、フランシスセラ・トゥラレンシス、サルモネラ・チフェリウムなどの生物によって強調されています。これらの生物は、ファゴソームのpH^を22-24に変化させることにより、少なくとも部分的には食作用の殺傷を抑制します。

哺乳動物では、主な食細胞は好中球、マクロファージ、樹状細胞であり、細胞の種類によって、時間依存的なファゴソームのpH変化は大きく異なり、異なる役割を果たしているように見えます。マクロファージでは、ATP依存性プロトンポンプ液胞ATPアーゼ(V-ATPase)によって媒介される強力で急速な酸性化が、殺傷を媒介する主要な要因の1つであり^25-27、食作用を摂食メカニズムとして使用するアメーバに存在するメカニズムに似ている²⁸。これらの細胞では、酸性プロテアーゼの活性化が重要な役割を果たすと考えられています。対照的に、好中球の死滅は、ミエロペルオキシダーゼ(MPO)¹¹によって生成されるHOClだけでなくROSにも依存しており、pHは最初の30分間は中性またはアルカリ性のままで、後で酸性化します^29,30。中性pHは、特定のカテプシンなどの酸化的プロテアーゼの活性を促進することが示唆されています。DCでは、ファゴソームのpHは物議を醸しており、酸性化を報告するものもあれば、中性またはアルカリ性のpH^{を報告するものもあります31,32}が、ROSとpHは、これらの細胞がT細胞に抗原を提示する能力に深く影響を与える可能性があります。これらは、それらの主な機能の1つです³³。

重要なことに、ホルモン、ケモカイン、サイトカインは、成熟と食細胞の行動の変化を誘発し、ひいてはファゴソームの^pH34,35に影響を与えるシグナル伝達イベントを生成する可能性があります。同様に、抗マラリア薬のクロロキン(例えば、抗がん剤療法³⁶)も、ファゴソームのpH、ひいては免疫転帰に影響を及ぼし得る。したがって、さまざまな細胞生物学者、免疫学者、微生物学者、および医薬品開発者は、特定の遺伝的混乱、生理活性化合物、または微生物が自然免疫応答および適応免疫応答に及ぼす影響の根底にあるメカニズムを理解しようとするときに、ファゴソームpHの測定に関心を持つ可能性があります。

ここでは、好中球のファゴソームpHを測定する方法について説明し、これにより、好中球のファゴソーム^pH19を調節するHVCN1チャネルの重要性を示すことができました。この方法は、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)のレシオメトリック特性に基づいており、その535 nmでの蛍光発光は、490 nmで励起されたときにpHに敏感ですが、440 nmでは励起されませんでした³⁷。この色素が標的(この場合はザイモサン)に化学的に結合している場合、広視野蛍光顕微鏡を使用して追跡でき、細胞が食作用を発する様子を画像化し、ファゴソームが成熟するにつれてファゴソームのpH変化をリアルタイムで測定します。次に、食作用した細胞をイオノフォアニゲリシンとモネンシンを含む異なるpHの溶液にさらすキャリブレーション実験を行うことにより、実際のpHを収集します。これにより、ファゴソーム内のpHと外部溶液との迅速な平衡化が可能になります。次に、比値を溶液の既知のpHと比較し、非線形回帰によって検量線を作成し、得られた式を使用して比値からpHを計算します。

プロトコル

倫理の声明：すべての動物の操作は、ジュネーブ大学の動物実験委員会のガイドラインに厳密に従って行きました。

貪食ターゲットの作製

1. 10 mlの滅菌リン酸緩衝食塩水（PBS）で乾燥したザイモサン20mgを加えます。 10分間沸騰水浴中で渦と熱。クールで5分間2,000×gで遠心します。
2. 水浴ソニケーターで、上清を除去し1mlのPBS中に再懸濁し、10分間超音波処理。 2 1.5ミリリットルチューブに500μlのを転送します。 5分間11,000×gで遠心分離します。
3. 500μlのPBSで洗浄を繰り返します。煮沸ザイモサンは、等分凍結し、-20℃で保存することができます。
4. たて、0.1M _の Na 2 CO _3、（ステップ1.2）上記のようにpHが9.3を用意し500μlの二回ザイモサンを洗ってください。
5. 最終洗浄後490μlの再懸濁。ジメチルsulfoxidに溶解し10 mg / mlのFITCの10μLを追加E（DMSO）、ボルテックス、ホイルで覆い、そして室温で4時間撹拌しながらインキュベートします。
6. 最初の0.5ミリリットルのDMSO +300μlのPBS、その後、0.5ミリリットルのDMSO +450μlのPBS、その後、PBSのみで、その後+150μlのPBS 0.5ミリリットルのDMSOで、上記のように（ステップ1.2）洗浄し、結合していない色素を除去するために。
7. 血球計数器を使用してザイモサンを数えます。それは中央のグリッド上に配置されたカバースリップを満たしている血球計数器室の端に10μlを添加、ボルテックス、500μlのPBSにザイモサンの1μlを添加します。 20Xの対物レンズを搭載した明視野顕微鏡で血球計数器を取り付けます。
8. 16正方形を含む左上隅に焦点を当て、手の数取器を使用して、このエリア内のすべてのザイモサン粒子をカウントします。右下の隅に繰り返します。 =ザイモサン濃度/ 2×500×10 ⁴ザイモサン/ mlのカウント：以下の式を使用してザイモサン濃度を計算します。標識ザイモサンは、等分凍結し、-20℃で保存することができます。
9. ラベルされたザイモサンのwiをオプソニン化1：100希釈でウサギ抗ザイモサン抗体番目。ボルテックスおよび37℃の水浴中で1時間インキュベートします。 （ステップ1.2）上記のように500μlのPBSで洗浄します。
   注意：ザイモサン後で解析をより困難にすることができ塊を形成する傾向があるとして、超音波処理は非常に、特にオプソニン化した後に、推奨されます。 65％（v / v）のラットまたはヒト血清でオプソニン化は、代替として使用することができます。
10. ステップ1.7から1.8に記載されているように血球計数器を使用してザイモサンをカウントし、100×10 ⁶粒子/ mlに希釈します。補体、または全くオプソニンのような他の食細胞刺激剤とのオプソニン化は、代わりに実行することができます。

2.ライブビデオ顕微鏡

1. 他の場所³⁸で詳細に説明するように、一次マウスの好中球を分離します。
   1. また、任意の食細胞タイプを使用します。 （RPMI）ロズウェルパーク記念研究所で氷の上での好中球を保ち、5％ウシ胎児血清を補充した1640（V / V）、200 Uペニシリン/ streptomycinは、10×10 ⁶細胞/ mlの濃度で使用直前まで。他の細胞型は、1〜4日前に播種することができます。
2. 50μlの培地を追加することで、ドロップを広げ、細胞を接着させるために37℃で5分間インキュベートし、35mmのガラスボトムディッシュの中心に好中球の2×10 ^5（20μl）を追加します。
3. ハンクス平衡塩溶液（HBSS）1mlを特定のMPO阻害剤、4-アミノ安息香酸ヒドラジド（4- ABH、10μM）を含む37℃に温め加えます。このようなアジ化ナトリウムのような非特異的なMPO阻害剤、（5 mM）を、使用してもよいが、近年pHを³⁹に追加の非特異的効果を発揮することが示唆されています。
4. 37℃の加熱システムと40X油目的を搭載した広視野蛍光顕微鏡の料理をマウントします。細胞や機器を平衡化することを可能にするために10分間イメージングせずに細胞をインキュベートします。
5. 明視野透過画像を取得する顕微鏡の設定を調整する[PHASEまたは440 nm以下490nmの励起および535nm放射ごとに30秒で使用可能な場合は微分干渉コントラスト（DIC）]。
6. あまりにも多くの光退色や光毒性を回避するために、顕微鏡システムに応じてと頼まれて、実験の質問に応じて露光時間と取得頻度を調整します。画像取得を開始します。
7. 2分後、10×10 ^6（50μl）を追加皿の中央にFITC-ザイモサンをオプソニン化。使用食細胞とターゲットの種類に応じて細胞比：ターゲットを調整します。
8. 30分間撮影を続けます。 30分後、タイムラプス取得を停止し、タイマーを開始します。ステージを移動し、すべての5分以内に、画像その他のファゴソームに異なる視野で10以上のスナップショットをキャプチャします。

3.キャリブレーションとコントロール実験

1. 実験の日に（レシピは表1に記載されている）は、従来のpH校正ソリューションを準備し、10mlのアリコートで凍結します。37℃の水浴中に較正溶液と暖かいを解凍します。 pHメーターでpHをチェックして、ソリューションの実際のpHを記録します。
2. 前の画像取得にガラスボトムディッシュの蠕動ポンプをマウントして、上記のようにライブビデオ顕微鏡を行う（セクション2）。
3. 30分の取得期間の終わりに、ディッシュ内の溶液を除去第1の較正溶液1mlを加え、ポンプを停止する上でポンプの電源を入れます。
4. 信号は、通常は5分を安定するまで待ちます。各校正液で繰り返します。
   1. 実験日ごとに少なくとも1つのキャリブレーションを実行して、最高のpHで始まり、最低に順次作業だけでなく、最低のpHから出発して、最高に向けて順次作業を調整します。
5. 対照として、ガラスボトムディッシュで900μlのHBSS中の細胞にHBSS中で希釈し、100μMNADPHオキシダーゼ阻害剤ジフェニルpropioniumヨウ化（DPI）の100μlを添加し、10分間インキュベートします。
6. 取得を開始して（ステップ2.7）上記のようにザイモサンを追加します。食作用の15分後、HBSS中で希釈した（コンカ）コンカナマイシン、10μMのV-ATPaseの阻害剤の10μlを添加し、さらに15分間撮影を続けます。

4.分析

1. タイムラプス映画やファゴソームスナップショットの分析。
   注意：以下の手順は、ImageJのに特異的です。ステップバイステップの手順は、使用するソフトウェアの依存して広く変化し得るが、この節で説明する関数は、ほとんどのプロの画像解析ソフトで利用できます。
   1. プロの画像解析ソフトウェアで画像を開きます。何の細胞が存在しない領域に四角ポリゴン選択ツールを使用して、小さな正方形のROIを描画し、ROIからプラグイン> BGの減算をクリックすることで、490チャンネルのバックグラウンドを減算します。次に>選択>選択と繰り返しを復元し、[編集]をクリックすることで、440チャンネルで同じROIをアップロードします。
   2. その後、[操作]ドロップダウンメニューで「分割」を選択、...プロセス>画像電卓をクリック画像1と画像2のドロップダウンメニューで、適切な画像を選択することにより、440チャンネルで割った490チャンネルの32ビットの比画像を作ります、および32ビット（フロート）結果チェック・ボックスをチェック。
   3. >レインボーRGBの画像>ルックアップテーブルをクリックすることで、比と互換性の色分けにカラーコーディングルックアップテーブルを変更します。画像をクリックして、0と無限大のピクセルを排除するための閾値比画像は、>>しきい値を...調整します。 NaNのチェックボックスに設定した背景ピクセルが選択されていることを確認すること、そのザイモサンは赤で表示されるようにスクロールバーを調整し、[適用]をクリックします。
   4. 画像をクリックすることで、マルチチャンネルコンポジットに明視野チャンネルとこの比スタックを組み合わせ>カラー>チャンネルをマージし、灰色のチャネルのドロップダウンメニューで、明視野像と緑のチャネルのドロップダウンメニューで、比画像を選択し、選択しますチェックボックスをソース画像を保管してください。タイムラプスムービーやファゴソームが分析されるかを決定するためにスナップショットをスキャンします。明視野チャンネルは、この場合に便利です。
   5. 追加>ファゴソームの周りに楕円形、多角形選択ツールを使用して、関心領域（ROI）を描画し、分析]> [ツール]> [ROIマネージャ]をクリックして、ROIマネージャーに追加します。詳細>マルチ測定デスライス選択]チェックボックスごとに1つの行をクリックすることで、彼らのザイモサン強度比を測定します。
   6. タイムラプスムービーでは、トラックは、各時点を測定するには、Ctrl + Mを入力し、ROIを描画し、時間をかけて強度値を追跡するために必要な場合に、ROIを移動させることにより、一度に一つのファゴソーム。表計算ソフトに結果ウィンドウからの測定値をコピーします。
      注：15（実験X 3当たり5時間のコース）の独立した実験の分析は理想的ですが、多かれ少なかれ観察変動に応じて必要となる場合があります。 ROIを保存すると、常に推奨されます。一部のソフトウェアパッケージでは、画像レジを許可ストレーションおよびROIの動的更新、分析のこの部分を容易にします。
2. 蛍光のpH値への変換
   1. 4.1節で説明したように、キャリブレーションタイムラプスムービーでファゴソームのための440分の490の比率を測定します。
   2. スプレッドシートでは、時間をかけて比の​​値をプロットし、各pH校正に対応する期間の中央内5の時点から（5-20​​の間、通常は）視野内の全てのファゴソームから平均の比の値を計算します溶液。 （ 図5Aにも赤いボックスを参照してください。）
   3. 実際に測定されたpH値に対してこれらの平均440分の490比の値をプロットします。一つのグラフに、少なくとも3つの独立したキャリブレーションを結合します。通常シグモイド方程式に、非線形回帰（ベストフィット曲線）を実行するために、統計や数値ソフトウェアパッケージを使用してください。
      注：例えば、 図5（b）で使用される式は、ボルツマンシグモイド[Y =ボトム+（（上下）でした/（1 + EXP（（V50-X）/スロープ））Yの値が440分の490比である]、Xは、pHの値であり、上、下、V50及び傾斜パラメータは、ソフトウェアによって計算されます。
   4. pHに比の値を変換するために取得した式を使用します。
      注：例えば、 図5（b）にアジ化ナトリウムの存在下での検量線について得られた方程式は440分の490率で= 1.103 + [（2.89から1.103）/（1 + EXP（（6.993-PH）/0.9291）] 。pHを解くことは、以下の式が得られます。pH値= 6.993から0.9291 * [LN（（1.178 /（比-1.103）） - 1））]。

結果

^{/ - -}以下は、初代マウス好中球のファゴソームpHは野生型またはHvcn1の骨髄から分離された実験の代表的な結果であります マウスを比較しました。成功した実験では、それは後の画像解析の際にセグメントに、より困難になりますあまりにも多くのファゴソームを回避しながら、タイムラプスムービーの全期間中に視野内に十分なファゴソームを得ることが重要である。1に示す図良い面と悪い集密度の例。時間依存とスナップショットは、分析のために、外部のザイモサン粒子はファゴソームと区別し、分析から除外されなければならない。2は、明視野像は、ファゴソームから外部ザイモサン粒子を区別しやすくするためにどのように活用できるかを示しています。 図3は、典型的なファゴソームの例を示していますHvcn1と比較して、野生型のpHタイムコース^{- / -} 図4は、酸性化を逆転V-ATPaseの阻害剤コンカを加え...

ディスカッション

ターゲットに接続されたpH感受性色素を用いた同様の戦略を採用するが、ファゴソームの集​​団の平均pH値を測定し、このような分光法およびFACSなどの代替の方法、より多くの時間がかかりますが、顕微鏡検査は、いくつかの利点を提供しています。最初に、内部および外部で結合したことであるが、内在化しない、粒子は容易にそれぞれ、外部粒子を急冷または標識するために、トリパンブルーまたは抗体など、他の化学物質を追加することなく、区別することができます。それは人口ベースの方法で見落とされてしまう可能性があるのに対し、第二に、リアルタイムで細胞を以下は、研究者が食作用のプ​​ロセスの複数の側面移行での同時ので、効果を観察することを可能にすることである粒子を検出し、結合が簡単に、ここで識別されることがあります。さらに、食作用の開始の同期は、多くの場合、コールドショック^40,41に他の人身売買のイベントを乱す可能性がある4℃、で細胞を配置することによって行われ、何もありません時間ゼロ、必要に応じてTを直接識別することができます。ライブ顕微鏡を実行するとき確かに、この4℃の同期技術は、客観イマージョンオイルと混合することができる温度シフト中...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ザイモサンA粉末	シグマ・アルドリッチ	Z4250	各種提供者存在
フルオレセイン・イソチオシアネート	シグマ・アルドリッチ	F7250	各種提供者存在
抗ザイモサン抗体(ザイモサンA生体粒子オプソニン化試薬)	ライフテクノロジー	ズZ2850	シグマ・アルドリッチO6637は同等の製品です。あるいは、25%血清をオプソナイジ試薬として使用することもできます。
4-アミノ安息香酸ヒドラジド(4-ABH)	サンタクルーズ	sc-204107	有毒、手袋を使用し、さまざまなプロバイダーが存在する
フェニレンヨードニウムクロリドニウム(DPI)	Sigma-Aldrich	D2926	有毒、手袋を使用し、さまざまなプロバイダーが存在する
コンカナマイシンA(ConcA)	Sigma-Aldrich	27689	、手袋を使用し、さまざまなプロバイダーが存在する
ゲリシン	Sigma-Aldrich	N7143	有毒、手袋を使用し、様々なプロバイダーが存在する
Monensin	Enzo	ALX-380-026-G001	有毒、手袋を使用し、様々なプロバイダーが存在する
リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)	ライフテクノロジー	ズ 14200-075	有毒、手袋を使用し、様々なプロバイダーが存在する
ハンクのバランス塩溶液	ライフテクノロジー	14025092	リンガーのバランス塩溶液または他の透明な生理学的緩衝液代用されます。
炭酸ナトリウム (Na2CO3)	Sigma-Aldrich	S7795	さまざまなプロバイダーが存在します
2-(N-モルフォリノ)エタンスルホン酸 (MES)	Sigma-Aldrich	M3671	さまざまなプロバイダーが存在します
4-(2-ヒドロキシエチル)ピペラジン-1-エタンスルホン酸(HEPES)	Sigma-Aldrich	H3375	さまざまなプロバイダーが存在します
N-メチル-D-グルカミン(NMDG)	Sigma-Aldrich	M2004	さまざまなプロバイダーが存在します
エチレングリコール-ビス(2-アミノエチルエーテル)-N,N,N′,N′-四酢酸(EGTA)	Sigma-Aldrich	3777	さまざまなプロバイダーが存在します
トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン(トリス)	Sigma-Aldrich	T1503	さまざまなプロバイダーが存在します
塩化カリウム (KCl)	Sigma-Aldrich	P9333	さまざまなプロバイダーが存在する
塩化ナトリウム (NaCl)	Sigma-Aldrich	S7653	さまざまなプロバイダーが存在する
塩化マグネシウム (MgCl2)	Sigma-Aldrich	M8266	さまざまなプロバイダーが存在する
無水エタノール (EtOH)	Sigma-Aldrich	2860	さまざまなプロバイダーが存在する
ガラス底35mmシャーレ(フルオロディッシュ)	ワールド精密機器	FD35-100	Ibidi µ-適切なイメージングチャンバーを備えたクリアディッシュまたはカバースリップを構成することができます
超音波処理ウォーターバス	O.クライナーAG		代わりに超音波処理器を使用することができ、さまざまな機器プロバイダーが存在する
Heamocytometer	Marienfeld GmbH		さまざまな機器プロバイダーが存在します
広視野ライブイメージング顕微鏡	カール・ツァイスAG		様々な機器プロバイダーが存在しますが、顕微鏡は440/535と490/535の励起/発光をそれぞれイメージングできなければなりません。明視野機能を備えたスピニングディスク共焦点セットアップで代用できる場合もありますが、ザイモサンは焦点が合わなくなることがよくあります。
蠕動ポンプ (Dynamax RP-1)	レイニン		各種機器プロバイダーあり
pHメーター	Schott Gerate GmbH		各種機器プロバイダーあり
マニュアル	カウンター Milian SA		各種機器プロバイダーあり