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方法論記事

無細胞アッセイは、有糸分裂の終了時クロマチン脱凝縮を勉強します

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⸱

DOI:

10.3791/53407

⸱

2015年12月19日

 ,  ,  , 
1Friedrich Miescher Laboratory, Max Planck Society, 2Nencki Institute of Experimental Biology, Polish Academy of Sciences

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

高度に圧縮された有糸分裂クロマチンの脱凝縮の分子メカニズムは明確に定義されていません。HeLa細胞から単離された有糸分裂クロマチンクラスターとXenopus laevis卵抽出物に基づく無細胞アッセイを提示します。

要約

脊椎動物の細胞周期中、クロマチンは広範な構造的および機能的変化を受けます。有糸分裂が侵入すると、それは塊状に凝縮して棒状の染色体になり、それらは有糸分裂紡錘体装置によって個別に移動されます。有糸分裂クロマチン凝縮は、間期と同様に50倍密度に圧縮された染色体をもたらします。有糸分裂からの出口の間に、染色体は、核膜で囲まれ、複製と転写に適任な機能的な間期状態を再確立する必要があります。縮合の過程は形態学的にはよく説明されていますが、分子用語ではあまり理解されていません:私たちは、根底にある分子イベントについての知識が不足しており、大部分は関与する要因とその調節についての知識が不足しています。ここでは、同期HeLa細胞とX. laevis卵抽出物から精製した有糸分裂クロマチンクラスターに基づいて、in vitroでクロマチン縮合を忠実に再現する無細胞システムについて説明します。当社の無細胞システムは、クロマチン縮合のさらなる分子特性評価と、核膜や細孔複合体の再集合など、有糸分裂出口中に同時に発生するプロセスとの調整のための重要なツールを提供します。

概要

アフリカツメガエルの卵抽出物は、無細胞アッセイのシンプルで複雑 ​​な細胞事象を研究するための強力かつ広く適用するツールです。 Lohka＆増井1によるそれらの最初の記述以来、彼らは広く、このようなクロマチン凝縮2、スピンドルアセンブリ3、核膜崩壊4だけでなく、核-細胞質間輸送5またはDNA複製6などの有糸分裂のプロセスを研究するために使用されています。例えば、核エンベロープ改革と核膜孔複合体の再構築などinterphasic核の改革のために必要な有糸分裂の終わりで行われているイベントは、はるかに少ない初期の有糸分裂のイベントに比べて理解されているが、同様にアフリカツメガエルの卵抽出物7を使用して研究することができます。我々は最近、有糸分裂8の最後にクロマチン脱凝縮を研究するためにアフリカツメガエルの卵抽出物に基づくアッセイを確立した、アンダー調べプロセスは、私が待っています詳細な特徴づけをtsで。

後生動物では、クロマチンは高度に遺伝物質の忠実な分離を行うために、有糸分裂のエントリに集光されます。クロマチンは、間期中の遺伝子発現およびDNA複製のためにアクセス可能であることを保証するために、それは、有糸分裂の終了時に脱圧縮される必要があります。脊椎動物では、クロマチンは 、Sにおける有糸分裂圧縮は通常はるかに低い酵母、 例えば、2つだけ倍とは対照的に、相間9に比べて有糸分裂の間に複数の圧縮された50倍までですセレビシエ 10。脊椎動物クロマチン脱凝縮は、主に卵の受精後の精子DNAの再編との関連で検討されています。分子機構は、どのヌ、豊富な卵母細胞のタンパク質で、卵に保存されたヒストンH2AとH2Bに精子固有のプロタミンを交換します。このプロセスはまた、 アフリカツメガエル卵抽出物11、12を用いて解明されました。しかし、表現ヌの卵母細胞13と、有糸分裂クロマチンに限定されているこれらの精子固有のプロタミンが含まれていません。したがって、有糸分裂の最後に脱凝縮クロマチンは、8つの独立したヌクレオです。

インビトロ脱凝縮反応のために我々は同期のHeLa細胞から単離された活性化したアフリカツメガエル の卵とクロマチンクラスターから生成されたエキスを使用しています。カルシウムイオノフォアと卵の治療は、受精時の精子のエントリによって生成された卵母細胞へのカルシウム放出を模倣。カルシウム波は最初相間14に進行し、減数分裂の第二中期で逮捕され、細胞周期の再開と卵をトリガします。そのため、フォームアクティブに卵準備卵抽出物は、有糸分裂終了/相間状態を表し、クロマチン脱凝縮、核膜などの有糸分裂終了のための特定のイベントを誘導する能力があると複雑な改革を細孔。有糸分裂CHの単離のためにクラスタromatin我々は、染色体のクラスターが有糸分裂に同期したHeLa細胞からの溶解により放出され、勾配遠心分離によってバッファを含むポリアミンで単離されるガッサー＆レムリ15、によって公開されたプロトコルを少し変更したバージョンを使用していました。

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プロトコル

HeLa細胞由来の有糸分裂クロマチンクラスターの単離

1.準備

  1. 細胞培養ソリューション
    1. DMEM、10％ウシ胎仔血清、100単位/ mlペニシリン、100μg/ mlのストレプトマイシンおよび2mMグルタミンを添加することにより、完全ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）を準備します。脱イオン水中に2.7 mMのKClを含むリン酸緩衝生理食塩水（PBS）、137mMの塩化ナトリウム、10mMののNa 2 HPO 4 2H 2 Oおよび2mM KH 2 PO 4を調製し、10 N NaOHでpHを7.4に調整します。
      注：PBSを室温で経時10倍ストック溶液として維持することができます。使用前に1倍を脱イオン水で希釈します。それは、細胞培養で使用される場合、再度1X溶液を濾過します。
    2. DMEM培地中のチミジン溶液（適切な細胞培養）の40 mMストックを準備します。 DMEM培地の90ミリリットルで0.97グラムチミジンを溶かします。 100ミリリットルへの最終的な音量を調整します。 -20℃で保存原液C.は、DMSO中5 mg / mlのストック溶液にノコダゾール（ 注意！、化学フードの下で働く手袋と口の保護具を着用してください）に溶解します。
  2. 有糸分裂クラスタ分離ソリューション
    注：1.2に記載されているすべてのソリューションは、全実験を通して準備/解凍後に氷上に保持する必要があります。
    1. 121℃で105分間オートクレーブ脱イオン水。 200mMの（69.6 mg / mlで）の最終濃度になるようにオートクレーブ処理し、脱イオン水中のスペルミン四塩酸塩を溶解します。 -20℃で保存原液。 200mMの（50.8 mg / mlで）の最終濃度になるようにオートクレーブ処理し、脱イオン水でスペルミジン三塩酸塩を溶解します。 -20℃で保存原液。
    2. 熱い脱イオン水（手袋と口の保護具を着用してください、！注意化学フードの下で働く）5％（w / v）のジギトニンを準備します。 -20℃でのフィルターや店舗のアリコート。アンクルフッ化フェニルメチルスルホニル（PMSF）（ 注意！仕事を溶かしますR化学フード、100％エタノール中の200mMた（35mg / ml）の最終濃度まで）、手袋及び口の保護具を着用。 -20℃で保存原液。
    3. （ 注意！手袋を着用し、化学フードの下で働く）、1M（154 mg / mlの）の最終濃度になるように脱イオン水でジチオスレイトール（DTT）を溶解します。フィルター、-20℃で保存原液。
    4. （ - ） - 4-（2- Aminoethly benzensulfonylfluoride）10 mg / mlのAEBSFを溶解させることによって（！手袋を着用し、 注意化学フードの下で働く）100倍プロテアーゼ阻害剤ミックスを調製、0.2 mg / mlのロイペプチン、0.1 mg / mlのペプスタチン脱イオン水および0.2 mgの/ mlのアプロチニン。 -20℃で保存原液。
    5. バッファの10倍のストック溶液を調製し、150mMのトリス-Cl（pHは7.4）、800 mMの塩化カリウム、20mMのEDTA-KOH（pH7.4）に、2mMのスペルミン四塩酸塩及び5mMのスペルミジン三塩酸塩を含みます。添加されるべきであるスペルミン四塩酸塩及びスペルミジン三塩酸塩なしで4℃で保存バッファーA、たての直前に使用します。
      注：EDTAは唯一の高濃度のEDTA-KOHストック溶液を調製し、したがって、8よりも高いpHで溶解する（0.5 M推奨）、それを溶解するだけで8以上のpHに5 N KOHを追加します。その後pHを7.4にまで滴定します。
    6. 100mMのトリス-HCl（pH7.4）、400mMのKClを、400mMのEDTA-KOH（pHは7.4）および5 mMのスペルミジン三塩酸塩を含む、バッファの20×ストック溶液を準備します。緩衝液Aと同様の条件で保存することができるように、バッファ
      注：ちょうど分離前たての私は、IVに（次の手順で参照）作業溶液、グリセロール勾配と非透析ポリビニルピロリドン（PVP）で被覆されたシリカ粒子（15〜30 nmの直径）を含むコロイダルシリカ粒子溶液を調製します手順（PMSFは水溶液中で不安定であり、ジギトニンは氷の上で長期保存時に沈殿する傾向として、PMSFおよびジギトニンは、使用前に直接追加する必要があります）。
    7. 、0.5倍の緩衝液Aを添加することによって溶液100ml Iを調製1mMのDTT、1：オートクレーブ処理し、脱イオン水にプロテアーゼ阻害剤混合物および0.1mMのPMSF、100。 1×緩衝液Aを添加することにより、（細胞溶解のための）溶液IIを50mlを調製し、1mMのDTT、1：プロテアーゼ阻害剤混合物の100、0.1mMのPMSF、オートクレーブ処理し、脱イオン水に0.1％のジギトニン及び10％グリセロール。
    8. プロテアーゼ阻害剤ミックスの100、オートクレーブし、脱イオン水で0.1mMのPMSFおよび0.05％ジギトニン：0.25×バッファーA、1mMのDTT、1を含む溶液IIIの200ミリリットルを準備します。オートクレーブ処理し、脱イオン水中のプロテアーゼ阻害剤ミックス100、0.1mMのPMSF、0.1％ジギトニン：1mMのDTT、1としては、1×緩衝液を含む溶液IV 40mlのを準備します。
    9. 溶液Iに25％グリセロールおよび0.1％ジギトニンを加えることによって、グリセロール勾配溶液120mlのを準備
    10. 非透析ポリビニルピロリドン（PVP）で被覆したシリカ粒子（15〜30ナノメートルの直径）、15％グリセロール、2mMのSを含有する懸濁液の60％v / vの（体積当たりの体積）を含有するコ​​ロイダルシリカ粒子の溶液150mlを調製permidine三塩酸溶液IVに0.8 mMのスペルミン四塩酸塩。
    11. 250mMのスクロースを含むクラスタ記憶バッファを準備し、15mMのヘペス（pH7.4）中、0.5mMのスペルミジン三塩酸塩、0.2mMのスペルミン四塩酸塩、1：プロテアーゼ阻害剤混合物100、0.3％BSAおよび30％グリセロール。クラスタ記憶バッファは、-20℃で保存することができます。
    12. 10％ホルムアルデヒド（ 注意！、化学フードの下で働く手袋を着用）、50％グリセロール、二重のマークの改変リンゲルバッファー（MMRが4.5を参照してください。）0.2 / mlのDAPIを（ 注意！手袋を着用）を含むスカッシュ定着液を調製します。光保護された反応管中で4℃で保管してください。実験はこのスカッシュ修正レシピを使用することは重要ではない、代替レシピも動作します。

細胞の2同期

  1. 日1：5 75cm 2の（250 mL）中の種子HeLa細胞を培地でフラスコおよび5％Cで37°CでそれをインキュベートO 2。
    注：これは、クロマチンクラスタ分離の日に約18×10 6個の細胞を中で得られます。
  2. （表面のほぼ半分が細胞によって覆われており、細胞が成長する余地がまだある）細胞は、少なくとも50％コンフルエントである場合には、のために最終的な2ミリ（チミジンブロック）の濃度及び培養細胞にチミジンを追加します。2日目5％CO 2中で37℃で24時間。
    注：これは、G1 / S期の境界で細胞を停止します。
  3. 3日目：培地を吸引チミジンを含有し、滅菌PBSを追加します。滅菌PBSで繊細なすすぎによって細胞を洗浄。吸引し、PBS、ゆっくりとは、G1 / S期ブロックからそれらを解放するために、5％CO 2中、37℃で3〜4時間、新鮮な、暖かい完全DMEM培地と文化の細胞15〜20 mLを加え。
  4. 3日目（続き）で：G1 / S期ブロックから細胞を解放した後、100ng / mlの最終濃度にノコダゾール加えます。 98ストック溶液（5mg / ml）を2μlを加えることによって希釈しノコダゾール新鮮なDMEM培地のμL、および細胞培養の各1ml当たり希釈ノコダゾールの1μlを添加します。 5％のCO 2中で37℃で約12時間培養細胞。これは、有糸分裂中の細胞をブロックします。

3.分裂クラスターの単離

  1. 4日目：有糸分裂のクラスタを分離します。細胞の大部分が分裂している場合は明視野顕微鏡を使用して、確認してください。細胞の50％未満は、より多くの細胞が有糸分裂に達するまで待って分裂している場合。フラスコの側で激しくタップして有糸分裂細胞を収集（または優しくピペットを噴霧することにより）、これは、残りの有糸分裂細胞を剥離します。 50mlコニカル遠心管に細胞懸濁液を転送します。
    注：有糸分裂細胞は円形となり、容易に平坦で強固フラスコに取り付けられている他の細胞周期段階での細胞とは異なり、（ちょうどトリプシン処理後の細胞のような）をフラスコの底部から取り外すことができます。
  2. 10分間1500×gでチューブを回転することにより収穫有糸分裂細胞（476; CまたはRT）し、その後、上清を除去します。 1 50mlコニカル遠心管に8 mlのPBS、プール内の細胞ペレットを再懸濁し、PBSで完全にチューブを満たし、1,500 X gで10分間、再度スピン。合計では、この洗浄操作を3回繰り返します。
  3. 今から冷たいソリューションを氷の上のすべての手順を実行します。精力的に冷溶液IIの37ミリリットルでペレットを再懸濁。有糸分裂クラスターは細胞質材料の自由になるまでタイト乳棒でdouncingにより氷上で25ミリリットルピペットと溶解細胞を用いて、冷たい40ミリリットルガラス - ガラスホモジナイザーにサスペンションを転送します。ストローク数は、ジギトニン株価に大きく依存しており、3〜20倍まで変化することができます。
    注：均質化は、かなり積極的なことができますが、ほとんど全ての有糸分裂細胞が溶解され、クラスタが（3.4参照）、細胞質材料がないと見られているときに完了したとみなされるべきです。
  4. トリパンブルーで2とMICRによって確認してください。ストロークのカップルは、細胞懸濁液1の5〜10μLを混合した後、ノイバウアー室でoscopy。細胞が溶解されるとクロマチンは青色に染色し、細胞膜の自由される（注：可能な細胞質の残党ブルー染色クロマチンの周りに蓄積され、区別しやすいだろう）。
    注：有糸分裂細胞はinterphasic細胞の前に溶解させるが、それでもinterphasic核とマングルクロマチンの混入を避けるために、均質化をやりすぎないように注意してくださいます。
  5. すぐにそれが推奨される5ポリカーボネート遠心分離管（28.8 X 107.0ミリメートル、中（グリセロール勾配液19.5 mlずつを重ね下部の60％コロイダルシリカ粒子溶液5mlと、）冷たいステップ勾配の上に全細胞溶解液をレイヤー10ミリリットルピペットを用いて）、それらを冷却する前に、氷の上にチューブを置きます。長い時間のための溶液IIで細胞を保管しないでください、このようにそれは（洗浄工程の間に、例えば ）あらかじめチューブと勾配を準備することをお勧めします。
  6. 30マイルのための勾配を遠心固定角ローターで4℃で千×gでのn。
    注：核、未溶解細胞およびクラスターは、グリセロールのインターフェイスとコロイダルシリカ粒子層で一緒に回収されます。
  7. ピペットを用いて、相間上記液体を取り除き、冷たいホモジナイザーに残りの部分を転送します。 3-15ストロークによる再ホモジナイズ混合凝集体を除去すると、クラスターから細胞骨格繊維を除去するために、タイト乳棒で（再びジギトニン株式に応じて）。ストロークのすべてのカップルの後、均質化の効率をチェックしてください。 DAPIで補充スカッシュフィックスの1μlのサンプルを1μLを混合し、蛍光顕微鏡で調べます。
    注：ストロークの数が非常に重要である、クラスターの存在は、マングルされたクロマチンと核破片が均質化が強すぎたことを示しながら、ストローク数は、不足していると、手段を集約します。
  8. 4新しいポリカーボネート遠心分離管の中でソリューションを配布します（28.8 X107.0ミリメートル）（チューブあたり約10 mlの溶液）と（約30 mlの60％コロイド状シリカ粒子溶液で完全にチューブあたりコロイダルシリカ粒子溶液を、それらを埋めます）。
    注：グラデーションでも多くの細胞質の破片がある場合は、クラスタを簡単にトラップすることができるので、コロイダルシリカ粒子勾配の過負荷を避けてください。
  9. 固定角ローターで4℃で45440×gで30分間、続いて3000×gで5分間スピン、。
    注：（均質化は、あまりにも頻繁に行われていなかった場合、細胞質の破片から核を放出する）前と同様に、interphasic核は勾配に入るから維持されますが、クラスタは、多くの場合、ルーズボールのように、チューブの底から約1.5センチ蓄積されます。
  10. ピペットを使用してクラスタ上に液体を外し、1チューブに残りの部分をプールし、十分に再懸濁し、2枚のポリカーボネート遠心分離管（28.8 X 107.0ミリメートル）に再配布します。各チューブ内の溶液IIIで4を、よく混ぜる：クラスタサスペンション1を希釈します。マーク番目Eサイトは、ペレットがあることと、固定角ローターで4℃で15分間1000×gでスピンしますました。
  11. 1 50mlコニカル遠心チューブに溶液III、プール内のペレットを再懸濁し、溶液IIIでいっぱい。約10分間のみ300×gで遠心分離します。高い速度で遠心しないでください - それは、クラスタの不可逆的な凝集を引き起こす可能性があります。
  12. 1.5または2ミリリットル反応チューブ内の溶液IIIで再び洗浄し（ペレットを再懸濁し、完全にチューブ記入）300×gで遠心分離を。ピペットで注意深く上清を取り除きます。慎重に250μlのクラスタストレージのバッファで再懸濁ペレット（あなたはいくつかのペレットが一緒にすべてのために250μLを使用し、それらをプールしている場合）。トリパンブルーで2とノイバウアー室でカウント：1サンプルの5〜10μLを希釈します。該当希薄はより/μlの500クラスターのおよその濃度を取得する場合。
  13. クラスタ凝集を削除することを確認するために、100μmのセルストレーナーを通してサスペンションを押してください不適切な再懸濁から生じる秒。クラスタは、-80℃で数ヶ月保存することができます。複数の再凍結を回避するために、適切なアリコートを行い、液体窒素で凍結スナップ。

Interphasic アフリカツメガエルの卵抽出物用のバッファの4準備

注： アフリカツメガエルは、カエルは、実験や他の目的に使用する脊椎動物の保護（EUは1998年に批准）とに関係するドイツの法律に欧州評議会の条約によって定められたガイドラインおよび規制に準拠して維持され、処理されるアフリカツメガエル研究における脊椎動物の使用。

  1. DTTおよび1.2.3と1.2.4に応じて100倍プロテアーゼ阻害剤ミックスを調製します。 -20℃での最終DMSO中10mg / mlの濃度、アリコート（10または20μlを推奨）、およびストアにサイトカラシンBを溶解します。
  2. エタノール中の20mg / mlの最終濃度にシクロヘキシミドを溶解し、アリコート（500μL推奨）、および-20℃で保存。 -20℃でエタノール、アリコートとストア内の2mg / mlの最終濃度にカルシウムイオノフォアA23187を溶かします。
    注：PI、DTT、サイトカラシンB、シクロヘキシミドおよびA23187を繰り返し凍結し、解凍することができます。
  3. 2 MのNaCl、40mMの塩化カリウム、20mMのMgCl 2を、40mMのCaCl 2を、2mMのEDTA及び100mMのHepes、5 N KOHでpHを8.0に調整を含む20倍マルコ修正リンゲルバッファー（MMR）を準備します。
    注：20X MMRを室温で長時間維持することができます。 1×注入カエルあたりMMRと洗浄工程のためにさらに5〜10リットルinterphasic卵抽出物1 Lの1つの製剤のために、卵の量に応じてが必要です。 5 N KOHで8.0に1X MMRのpHを再調整します。 MMRは、Oでカエルを維持するために準備/ N×1 1倍は、室温であるべきです。それが使用されるまで抽出物調製のために準備1X MMRは、しかし、それが1X MMRは本当に寒いですことが実験のために重要ではない、寒さに保つ必要があります。
  4. SUCの1 Lを用意250mMのスクロース、50mMの塩化カリウム、2.5のMgCl 2、10mMのヘペスpHが7.5を含むバッファーの増加となりました。スクロース緩衝液は、滅菌水を使用する前の日に調製されるべきであり、4℃に保たれるべきです。
  5. 0.25×MMR中の2％のL-システインを溶解することにより、実験の朝にたてdejellying溶液を調製します。 5 N KOHでpHを7.8に調整します。それが使用されるまで4℃で保管してください。

5. Protocolfor Interphasic Xenopu のツメガエルの卵抽出物

  1. 3-10日間実験前各カエルの背側リンパ嚢（5ミリリットル注射器、27 G¾ ''針）に120 IE妊娠馬の血清ゴナドトロピン（PMSG）を注入します。
    注：この注入は排卵を誘発します。 1カエルが産む卵の量が多くのことを異なります。よく敷設カエルが粗抽出物の最大3.5ミリリットルに相当する脱jellynatedされた後、最大7 mlの容量を占有している卵を産む可能性があります。しかし、いくつかのカエルは、ラ置くか、しません可能性があることを考慮Y悪い卵。
  2. 実験（5ミリリットル注射器、27G¾ ''針）前の晩カエルあたり500 IEのヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（hCG）を注入します。これは卵の放出を誘導します。 1.2リットル1X MMR（pHは8）を含む、個々のタンクで18℃で13〜17時間、カエルにしてください。
  3. 600-1,000 mlのガラスビーカーにそれらを注ぐことによって、卵を収集します。
    注：同様のサイズと明らかに暗いと明るい色の半分で着色個別に配置されている卵の唯一の良いバッチを取ります。文字列やその表情ふっくらと白を形成卵を取ってはいけません。これらは、プラスチック製パスツールピペットを用いて、手順全体を通して選別する必要があります。悪い卵対良いの詳細についてはガレスピーらを参照してください 。6
  4. 卵が落ち着いてきた上清をデカントし、その後、新鮮な緩衝液を入れたビーカーを補充することにより、集中1X MMRで約4倍に、卵を洗います。
    注：それらはdejellynatedされ、洗浄緩衝液を直接卵に適用する前に卵が安定しています。
  5. 2％のシステイン溶液中でインキュベートすることによって卵をDejellynate。バッファーをデカントし、慎重に新鮮な緩衝液を入れたビーカーを充填することによって、一度2-4分後にバッファを変更してください。卵の量が大幅に減少した場合、完全なConsiderdejellyingと卵は、より密に詰まっになります。
    注：dejellyingは約5-7分を必要としたときに見えるが、最新の10分後に停止する必要があります。
  6. デカンテーションおよびバッファ上清を補充することにより1X MMRで洗浄卵は約4倍。
    注：卵はdejellynatedされた後に、より脆弱であり、従って、洗浄工程は、より慎重に行う必要があります。 MMRはむしろ卵の上に直接ではなく、ビーカーの壁にすすぐべきです。
  7. カルシウムイオノフォア（エタノール中の2mg / ml）を8μLを追加することで、100ミリリットルの1X MMRで卵をアクティブにします。アニマルキャップ収縮があることときにアクティベーションを停止します可視光または10分後に来ます。
    注：アニマルキャップの収縮は、卵の黒半分の圧縮によって同定することができます。
  8. デカンテーションおよびバッファ上清を補充することにより、1×MMRで慎重に4回洗浄します。
  9. RTで1×MMRで20分間卵をインキュベートします。
  10. インキュベーション時間の間、遠心分離管を準備します。場所50μlのショ糖バッファー、50μlの100倍プロテアーゼ阻害剤ミックス、5μlの1 M DTT、12.5μlのシクロヘキシミド及び2.5μlのサイトカラシンB（特にサイクリンBの、翻訳を防止するために）（へ5ミリリットル遠心チューブ（13×51ミリメートル）でアクチン重合）を防止します。代替的に、卵の30以上mlのために、14 mlチューブ（14×95 mm）は2.4倍に、こ​​の場合の増加体積で、使用することができます。
  11. （ガラスビーカー中でデカントし、リフィルバッファ）の冷ショ糖緩衝液で2回卵を洗浄し、広い開口（狭い方の端をカットオフ）を有するプラスチックパスツールピペットを用いて、遠心分離チューブに移します。
  12. パック130×gで1分間スピンすることによって卵。 （それぞれ、50mlコニカル遠心チューブに14ミリリットルチューブを入れて）、この目的のために15ミリリットルコニカル遠心チューブ内チューブを入れてください。目標は、抽出物の希釈を防ぐためにできるだけバッファを除去することです。遠心分離した後、プラスチック製パスツールピペットを用いて、緩衝液の過剰分を除去し、最終的には上に複数の卵を埋めます。
  13. 6×5ミリリットルのスピンは、4℃で21,000×gで20分間、ローターを回転させます。
  14. 底部の上に黄色の卵黄と暗い壊れた卵の残骸の間、16 G 1½ ''針で5 mlシリンジを用いて、低速エキスを削除します。この目的のために、ちょうど底に壊れた卵の破片の層の上に遠心管の壁を通って注射針を押してください。針で押すと抵抗に抗してチューブを握り。
    注：満たされた5ミリリットルの遠心分離チューブは、抽出物のミリリットル1.8から2.5の間を提供します。
  15. 抽出液の1ミリリットルあたり10μlの100倍プロテアーゼ阻害剤ミックスを追加し、1μL1 M DTT、2.5μlのシクロヘキシミドた（20mg / ml）及び0.5μlのサイトカラシンB（10mg / ml）を。氷の上に抽出してください。
    注：抽出物は実験のために直接使用するか、または、等分することも、数ヶ月のために凍結し、液体窒素中に保存スナップ。抽出液を凍結することは、その活性を減少させます。免疫枯渇のような繊細な実験のために、それは非常にすぐに新鮮な抽出液を使用することをお勧めします。

クロマチン脱凝縮の in vitro再構成するためのバッファの6準備

  1. 25 mMのATP、25mMのGTP、127.5 mg / mlのクレアチンリン酸と250mMのスクロースを含む緩衝液中に2.5 mg / mlのクレアチンキナーゼ、1.2 mMのヘペス、5.9 mMのKCl及び0.3のMgCl 2を含むエネルギーミックスのストック溶液を調製します。 -80℃で小分けして保存。解凍後の新たに使用し、再冷凍しないでください。
  2. 脱イオン水中の0.2グラム/ mlのグリコーゲンを溶かします。 -20℃で保存してください。最終濃度に6 - ジメチルアミノプリン（DMAP）を溶解DMSO中の0.25 Mの。 -20℃で小分けして保存。解凍後の新たに使用し、再冷凍しないでください。
  3. 30％4℃でPBS、フィルタおよびストアで（w / v）のショ糖を準備します。 80 mMのパイプのpH 6.8を含む4％VikiFixの溶液を調製し、1mMのMgCl 2、150mMのスクロース、4％パラホルムアルデヒド（PFA）（ 注意！、化学フードの下で働く手袋と口の保護具を着用してください）。
    注：1リットルの場合はビッキー・修正の両方のホット（ほぼ沸騰）を脱イオン水に、別々のビーカーに24.2グラムパイプと40グラムPFAを溶解：PFAは、したがって、それは次のようにそれを行うことが推奨されて溶解させることは困難です。どちらも、10NのNaOHを添加して溶解するがあまり追加しないように注意してくださいます。 PFA溶液に51.4グラムのスクロースおよび1ミリリットルの1MのMgCl 2を追加します 。他のミックスにPIPESソリューションを追加します。 1リットルの最終体積に記入し、NaOHを加えることによって、pHを中性に調整します。
  4. 水（ 注意！手袋を着用）で10 mg / mlの4 '、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）を溶解します。で保管してください-20℃で暗いです。

クロマチン脱凝縮の in vitroでの再構成のための7プロトコル

  1. 一定の角度で386,000×gで12分間、20×0.2ミリリットルを低速interphasicの抽出物をスピンまたは10×2.0ミリリットルローター355 000×gで。
  2. 静かに真空ポンプまたはピペットを用いて、上に脂質層を除去し、上清を取る（その後高速エキスと呼ばれる）底層からの膜汚染を回避し、ペレットを廃棄します。
    注：それは二回の抽出物をスピンするか、遠心分離の前に、スクロース緩衝液との体積の20％の抽出物を希釈することをお勧めします可能な膜汚染を減らすために。しかし、希釈及び追加の遠心分離工程は、抽出物の活性を低下させることができます。
  3. 1.5ミリリットルの反応チューブに高速エキスのピペット18μL、0.7μlの有糸分裂のクラスター（量がややクロマチンストック濃度に応じて変化させることができる）、0.5μlのグリコーゲン、0.5μlを添加しますエネルギーミックスと0.3μlのDMAP。クロマチンはdecondensingクロマチンのせん断を防止するために添加されるとすぐに反応を混合するために広い開口でのヒントを参考にしてください。
    注：反応は膜の存在下または非存在下で行うことができる（ 図3参照）。膜の存在下でクロマチンをdecondenseするには、Eisenhardt らによって記載されたプロトコルに従って調製浮いた膜の2μlを添加する。16
  4. 20℃で（脱凝縮プロセスの早い時点を研究するために以下）までの2時間、反応混合物をインキュベートします。
  5. 氷上で20〜30分間、0.5％グルタルアルデヒドおよび0.1 mg / mlのDAPIとのインキュベーションを含む0.5 mlのビッキーフィックス冷たい氷を追加することにより、サンプルを修正してください。
    注：サンプルは、さらに免疫蛍光のために処理される場合、これは、多くの場合、抗体染色を妨害するように、固定は、グルタルアルデヒドなしに行われるべきです。しかし、唯一のDAPI染色は、供給過剰の追加を分析する場合araldehydeはよりよいクロマチン構造を維持します。
  6. クロマチンにカバースリップの親和性を増加させるために、ポリ-L-リジン溶液で5分間、円形カバースリップ（直径12 mm）をインキュベートします。その後、ろ紙上のカバースリップを乾かします。
  7. 遠心分離管の底の一番上にコーティングされたサイトとカバーガラスを入れて平底遠心チューブ（6ミリリットル、55分の16 mm）を取り付けます。 30％ショ糖クッションの800μlを添加して、上部に固定されたサンプルをレイヤー。
  8. 4℃で2500×gで15分間スピン。
    注：平底の遠心分離管は15ミリリットルコニカル遠心チューブを採用ローターにフィット。
  9. その後、16 G 1½ ''注射針で慎重に遠心分離管の底を突くことにより、チューブからカバースリップを削除し、上清を除去。この目的のために、テープのための針の蓋とその底部で一緒に針自体と針が約3スティックように蓋の先端をカットミリメートルアウト。カバーガラスは、1つのサイトで針によって持ち上げられると、カバースリップを削除するには、ピンセットを使用しています。
  10. 脱イオン水に浸漬することで、すぐにカバースリップを洗浄し、ろ紙にその側面に触れて軽く乾燥させ、取り付けメディアのドロップの顕微鏡スライド上に置きます。乾燥、マニキュアとそれを密封し、暗所に保管してください。
    注：グルタルアルデヒド固定せずに試料を24ウェルプレートにPBS中に保存し、免疫蛍光染色のためにさらに使用することができます。数日間保存された場合は、細菌による汚染を避けるために、PBSに（ 注意！手袋を着用）、0.05％アジ化ナトリウムを加えます。
  11. DAPI信号の蛍光顕微鏡によってサンプルを分析（例えば、405 nmのレーザー共焦点顕微鏡を用いて）。

インビトロ再構成クロマチン脱凝縮試料の免疫蛍光染色用のバッファの8準備

  1. 1.1.1に従ってPBSを準備します。フィンにNH 4 ClでディゾルブPBS中の50mMのAl濃度。 4℃でこの溶液を保管してください。 PBS中5μg/ mlのDAPIを（新たに用意）に溶解します。 PBS、0.1％トリトンX-100を加えます。 4°Cで保管してください。 PBS + 0.1％トリトンX-100中の3％ウシ血清アルブミン（BSA）に希釈し、使用前に新たにブロッキング緩衝液調製。

インビトロ再構成クロマチン脱凝縮試料の免疫蛍光染色のため9.プロトコル

注：特に明記しない場合は、カバースリップの次のすべてのインキュベーションは、ウェル当たり少なくとも250μlの溶液を24ウェルプレートで作られてインビトロではクロマチンサンプルがソリューションを追加または削除するときに固定された細胞は、したがって、注意が必要以上に敏感である脱凝縮しました。これは、角切りプラスチックパスツールピペットを使用することをお勧めします。洗浄工程および二次抗体のインキュベーションのために数100rpm以上で高速に移動し、ロッキングまたはプラットフォームを回転させることで、室温でプレートを配置します。

  1. カバースリップをインキュベートすることによって、サンプルをクエンチ5分間、PBS中の1ミリリットルのNH 4 Clで秒。 1ミリリットルは、少なくとも30分間、ブロッキング緩衝液でそれらをインキュベートすることによりブロックサンプル。
  2. 一次抗体とのインキュベーションのために湿度室を組み立て：ウェットティッシュの上に逆さまに開閉可能なボックスの下部に、24ウェルプレートの蓋の上にウェットティッシュを入れてください。蓋にパラフィルムを配置し、パラフィルム上のサンプルあたりの抗体溶液70μlを添加します。抗体溶液は、抗血清またはアフィニティー精製抗体1を希釈：100をブロッキング緩衝液中で。
  3. 逆さまに抗体溶液の上にカバースリップを置き、1〜2時間のためにそれらをインキュベートします。試料側を上に向けて戻って24ウェルプレートにカバースリップを置き、PBSで1 mlの0.1％トリトンX-100で10分間サンプルを三回洗浄します。
  4. メーカーが推奨する濃度にブロッキング緩衝液中に希釈した250μlの二次蛍光タグ化抗体で室温で1時間、カバースリップをインキュベートします。光から保護します。ウォッシュTHR1 mlのPBS中0.1％トリトンX-100で10分間EE時間。
  5. 5μgの1mlの/ mlのDAPI PBS中で10分間サンプルをインキュベートします。 PBS中で1 mlの0.1％トリトンX-100で5分間3回洗浄します。
  6. 脱イオン水に浸漬することで、すぐにカバースリップを洗浄し、ろ紙にその側面に触れて軽く乾燥させ、取り付けメディアのドロップの上に顕微鏡スライド上に置きます。乾燥、マニキュアとそれを密封し、使用するまで、暗所で4℃で保ちます。蛍光顕微鏡でサンプルを分析します。

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結果

脱凝縮反応の時間依存性

図1は、脱凝縮アッセイの典型的な時間経過を示します。反応の開始時に目に見える染色体のクラスターがdecondenses、シングル、ラウンドと滑らかな核に合流。卵抽出物は、スクロースで置き換えられたときに染色体クラスタバッファ脱凝縮活性は卵抽出物中に存在することを示唆している、縮合したままです。

クロマチン脱凝縮は、エネルギー依存性のプロセスであります

インビトロ脱凝縮反応は、好都合には阻害剤を添加することにより、例えば操作することができます。 図2に示した実験では、非加水分解性ATPまたはGTP類似体、ATPγSまたはGTPγSを反応に添加しました。両方は、ATPとGTP依存、アクティブなプロセス（ 図2）であると、脱凝縮を示すを阻害します。

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ディスカッション

アフリカツメガエル卵抽出物を忠実にインビトロで細胞プロセスを再現するための非常に有用なツールであり、このシステムは正常細胞周期および細胞分裂事象2、3,5,6,17の特徴付けに使用したアフリカツメガエル 。原因卵形成中の卵に隔離核成分の大型店に、卵抽出物は、細胞成分の優れた供給源です。哺乳動物組織細胞株または遺伝子操作上のRNAiのような他のアプローチと比較すると、それはいくつかの利点があります。無細胞系は、細胞の生存率が他の方法で制限されるであろうで細胞プロセスを研究することができます。さらに複雑なプロセスの一つのステップは、単純なアッセイで分析することができます。ここで紹介する脱凝縮アッセイはそれぞれ、他の有糸分裂のイベントからの干渉なしで有糸分裂後の脱凝縮の分子メカニズムを研究することができます。 アフリカツメガエル卵抽出物は、特定のタンパク質の枯渇により操作が容易ですおよび阻害剤または変異タンパク質8を追加。例えば、 図2は、脱凝縮アッセイに非加水分解性AT...

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

AKSは1＆2が発達セル31（3）、Magalskaから転載されている図にこの作品は、ドイツの研究財団とERC（WAにAN377 / 3-2と309528はCHROMDECON）とベーリンガーインゲルハイムフォンの博士フェローシップによってサポートされていましたら 、有糸分裂、305から318まで、2014年の終わりにクロマチン脱凝縮で、RuvBのようなATPアーゼ機能、エルゼビアからの親切な許可を得て。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
スペルミン四塩酸塩フルカ分析85610-25G
スペルミジン三塩酸塩シグマ S2501-5G
高純度ジギトニンミリポア300410-1GM有毒
PMSFApplichemA0999,0100有毒
チミジンCalbiochem6060
ノコダゾールCalbiochem487928有毒
37% ホルムアルデヒド溶液Roth7398-1有毒
トリパンブルー溶液 (0.4%)シグマT8154毒性
1,4-ジチオスレイトール(DTT)ロス6908.2
AEBSF塩酸塩アプリケーションケムA1421,0001
プスタチンロス2936.1 / 2/3
ペプチンロスCN334
アプロチニンロスA162.3
パーコール(コロイダルシリカ粒子溶液)GE Healthcare17-0891-01
グルタミンGibco25030-024
ペニシリン-ストレプトマイシンGibco15140-122
75 cm² 組織培養フラスコGreiner Bio-one658175
熱不活化ウシ胎児血清 (FBS)Gibco10500-064
ホモジナイザー (40 ml ティッシュグラインダー)ウィートン357546
ノイバウアーチャンバーアシスト441/1
 オークリッジ遠心分離チューブ、ポリカーボネート(50 ml)Nalgene3118-0050
100 µm細胞ストレーナー、ナイロンBD、ファルコン、352360
サイトカラシン、B、Applichem、A7657,0010有毒
なシクロヘキシミド、ロス8682.3有毒
なL-システイン、メルク、1,028,381,000
hCG、OvogestMSDとして利用可能1431593
、PMSGはIntergonanMSD1431015
A23187 (カルシウム-マグネシウム-塩の混合)EnzoALX-450-002-M010有毒
な注射器の針 (1.20 x 40 mm、18 G x 1 1/2 インチ)Braun4665120
ATPServa10920.03
GTP、2 Na x 3 H20RothK056.1/2/3/4
クレアチン、リンファット、二ナトリウム塩Calbiochem2380
クレアチンホスホキナーゼΣC3755-35KU
DMAPシグマD2629-1G
DAPI Roche10236276001
PFASigmaP-6148TLA
100 用 毒性遠心分離チューブ (7 x 10 mm, 5/16 x 13/16 in.)ベックマン・コールター343775
"Cell-Saver" (先端は大口、1,000 & マイクロ;l)Biozym729065
50% グルタルアルデヒド溶液、グレード Iシグマ アルデリッヒG7651-10 ml毒性
0.1% (w/v) ポリ-L-リジン溶液シグマP8920-100 ml
平底チューブ (6 ml、16.0/55 mm)Greiner Bio-one145211
Vectashield 埋込剤ラボH1000
TLA120用チューブ(11 x 34 mm、7/16 x 1 3/8インチ)ベックマン・コールター343778
「セルセーバー」(開口部の広いチップ、200µl)Biozym729055
12 mm カバースリップThermo Scientific0784 #1
ペロイ、、として入手可能、 ベクター

参考文献

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