3Dの設定で侵略を評価するために、癌細胞スフェロイドアッセイ

サマリー

この方法は、スフェロイドから周囲の3Dマトリックスへの癌細胞の浸潤を評価します。 スフェロイドはハンギングドロップ培養法で作製し、基底膜材料とI型コラーゲンからなるマトリックスに包埋します。 その後、スフェロイドからの侵入が監視されます。

要約

癌細胞株の侵襲性は、その転移能力と相関していると考えられています。 しかし、従来のほとんどのアッセイでは、これらの侵襲的な特徴を3次元環境で調べることはなく、得られるデータは生物学的適用性が低下します。 ここでは、生理学的に関連性のある環境で細胞株の侵襲性を視覚化するアプローチが提示されます。 がん細胞スフェロイド浸潤アッセイは、まず重力を利用して、細胞培養皿の蓋からぶら下がっている培地の滴内にスフェロイドを生成します。 次に、これらのスフェロイドを、基底膜材料とI型コラーゲンの混合物からなる3Dマトリックスに埋め込みます。 次に、スフェロイドから周囲のマトリックスへのがん細胞の放出を経時的に監視します。 ここで説明する方法は、異なる細胞タイプの共培養、薬物/阻害剤の包含、または細胞外マトリックス(ECM)成分の変化後の浸潤を調べるように変更することができます。

概要

これは、癌細胞の運動性がこのような行為は、基底膜および循環系¹への参入を通じて侵入を促進することを考えると、転移の可能性を予測することが確立されています。運動に関するほとんどの研究は、それが広く、三次元（3D）マトリクスの細胞の動きがする実際にどのようにこれらの同じ細胞のより代表的であることが認識されてきているものの、細胞が、二次元（2D）の設定でどのように動作するかに焦点を当てています生体 ² で動作します。 3D培養システムは、ますます増殖動態および薬物感受性³に、細胞形態の範囲での細胞挙動を研究するために使用されます。 3D環境のコンテキスト内での癌細胞の浸潤をモニターするための欲求は、3Dの外に、これらのスフェロイドを埋め込 ​​む続いハンギングドロップ培養法⁴を介して3D細胞凝集体（スフェロイド）の生成を含む、以前に確立された技術の合成につながっています行列（ECM）コラーゲンと基底膜材料⁵で構成される。この方法は、簡単な実験、種々の条件下で浸潤を比較するために利用することができる効率的なアプローチを提供することにより、これらの以前に確立された技術を改良することを目的とします。

in vitroで細胞の運動性を評価するためのより多くの伝統的な方法は、スクラッチ巻きアッセイおよびトランスウェルアッセイ⁶です。前者の分析は、2D設定で細胞の運動性を示し、したがって、in vivoでの侵略、 例えばプロテアーゼ活性 ⁷のための重要な機能の様々な独立しています。トランスウェルアッセイは、より良いウェルインサートは、ECM基質でコーティングされたが、単一のパラメータのみ、反対側の膜表面上の細胞の出現、すなわちされたモデル細胞の浸潤を測定したり、細胞浸潤の多くのニュアンスは、このように容易に観察されません。これらの技術とは対照的に、癌細胞スフェロイド浸潤アッセイ（ 図1 </ strong>の）だけで、生理学的に関連しない設定に細胞浸潤のリアルタイム監視が可能になり、だけでなく、個々の対集団細胞遊走⁸として可視化されるべき重要な細胞株固有の機能を、許可します。この方法はまた、標準的な三次元培養増殖アッセイを超える利点を提供します。細胞は、この制約が解除された後に侵入する奨励されるように、ハンギングドロップ法を介した細胞凝集体の生成は、最初に、細胞運動を抑制します。その制約が解除された後さらに、細胞放出はその後便利に定量することができる一定の方向に進むことになります。

癌細胞スフェロイドのアッセイのために使用される最も人気のあるECM材料は、マトリゲルとこれらの各コンポーネントは、転移挙動に影響を与える上で重要と異なる役割を持っているI型コラーゲン、あります。マトリゲルは、エンゲルホルム、スウォームマウス肉腫細胞によって産生されるタンパク質の分泌混合物であり、かつbasemeに富みますラミニン、エンタクチン、およびIV型コラーゲンなどの⁹ヌクレオチド膜タンパク質。この理由のために、マトリゲルを今後とも呼ばれる「基底膜材料。」これらの基底膜材料を細胞の挙動¹¹への影響の範囲を発揮する多くの他のタンパク質に加えて、癌細胞の浸潤¹⁰中インテグリン接着のために必要不可欠なリガンドを提供します。比較では、一般的に腱および他の高密度のコラーゲン構造物¹²の酸消化物から調製されたI型コラーゲンは、身体の組織および器官を支持する結合組織と間質の主要な構造要素として機能する非常に単純なマトリックス材料です。それは、コラーゲンの物理的特性は、細胞運動性の機能の数を調節することができることが実証されています。例えば、腫瘍間質界面におけるコラーゲン線維の整列は、基質^13内に侵入したときに、その後、それらの線維に沿って移動するように癌細胞を許可します。ここで紹介するアッセイでは、両方のI型コラーゲンと基底膜の材料は、3Dがん細胞間質の相互作用を研究するためのツールと​​して利用されています。

細胞は三次元マトリックス中に埋め込まれた後の侵入を制御する経路の阻害または刺激の効果をモニターすることができます。細胞は、長い治療が侵入を調節するために必要とされるかどうかに応じて、ハンギングドロップまたは3D培養に移す際に、成長中に前処理することができます。短い治療のためには、薬物が収集後のスフェロイド懸濁物、ならびに細胞への適切な薬物暴露を容易にするために、3次元培養を取り囲む培地と混合することをお勧めします。次に、正常または腫瘍関連間質細胞は、腫瘍細胞浸潤の調節におけるそれらの役割を評価するために、またはどのように傍分泌および自己分泌シグナル伝達に影響を与える細胞の挙動を決定するために、マトリックス材料と混合することができます。このアイデアは、COLの共培養の研究で示されました懸滴中の癌細胞および内皮細胞上でスフェロイド^14内の血管網につながりました。癌細胞の浸潤は、異なる基板¹⁵の影響を受けるように、最終的に、ECMの成分はまた、変更することができます。以下に示す方法は、このように様々な条件下での癌細胞の浸潤を評価するための枠組みを提供します。一般に、すべての細胞株は、ハンギングドロップでスフェロイドを作成し、上皮に見える細胞株は、典型的には、定期的な球を形成しないことが見出されました。

プロトコル

スフェロイドの1世代

1. PBSを用いて70％のコンフルエンス〜の接着性癌細胞培養物を分離することによって、ドロップ培養を掛けるために、単一細胞懸濁液を調製し、0.05％トリプシン-EDTA溶液への暴露に続いて洗浄します。
   1. 細胞培養培地でトリプシン溶液を中和し、細胞懸濁液のアリコートを用いて細胞を数えます。注記：特定の細胞培養培地は、試験される細胞株に依存します。細胞培養培地は、典型的には、DMEM + 10％FBSであり、ATCCメディアの推奨事項に従ってください。詳細については、資料の表に記載されています。
   2. 細胞培養培地20μlのドロップあたり500〜1,000細胞の播種を可能にするために希釈を実行します。
2. 10cmディッシュを取得し、底に滅菌5mlのPBSを追加。注：このステップでは、吊り蒸発から落下保護します。細胞が続きないので「細菌グレード」皿を、細胞培養等級皿の代わりに使用することができる低コスト培養面として作用します。
3. 蓋の内面に希釈した細胞懸濁液の20μlの液滴を転送するためにマルチチャンネルピペットを使用します。
   1. ピペット40は、10cmの皿の蓋の上に（8滴の5行）をドロップします。
4. 培養皿の上に蓋と場所を反転。スフェロイドを生成するために、72時間、37℃で懸滴培養物をインキュベートします。
   1. 自信を持って、まだ制御された方法で蓋を反転します。注意：蓋が速すぎたり遅すぎ反転させると、液滴がシフトする可能性があります。他のものはコンパクト凝集体を生成するために72時間以上を必要とするかもしれないいくつかの細胞株は、48時間以下でスフェロイドを形成することができます。

3Dマトリックスへのスフェロイドの2埋め込み

1. 一晩スフェロイドを埋め込む前に、4°Cで成長因子低減基底膜材料のアリコートを解凍します。
   1. オプション：組織cultuの潜在的な回転楕円体との相互作用を防止するために、事前にECMとのレイヤウェル表面再。
      1. 24ウェルプレートにウェル当たりECMのピペットで200μlの。
      2. ECMは全体ウェル表面を覆っていることを確認するために、プレートを傾けます。
      3. 慎重にピペットで余分なECMを削除します。
      4. 3時間、室温または4℃で一晩：井戸が乾燥するまで、プレートをインキュベートします。
2. 組織培養皿の蓋を傾け、メディアをプールすることによりスフェロイドを収集します。 1.5mlの微小管にスフェロイドとメディアを転送します。
3. スフェロイドのための10分は、マイクロチューブの底に沈降することを許可します。スフェロイドを目で見えるようにする必要があります。
4. 私は独立した予備冷却管に型コラーゲン冷たい100μlの（4℃）と基底膜材料の100μLを混合します。途中で固化からゲルのいずれかを防ぐために4℃で混合物を保管してください 。
   1. 小さなボリュームを転送する場合はあらかじめ冷却ピペットチップを使用してください。
   2. するときには注意を与えますIは、気泡の形成を防止するために、基底膜の材料や型コラーゲンを混合します。注：彼らはゲル中に埋め込 ​​まれたとなった場合に気泡が 、後のプロトコルでの撮像を妨げることがあります。
5. マイクロチューブの40μlの底部分からのスフェロイドを吸引し、そして私は、混合物をコラーゲン基底膜材料/タイプと組み合わせます。混合する際に気泡形成を防止するように注意してください。注：100μlの基底膜の素材を含む溶液、100μlのコラーゲンI型、およびスフェロイド40μlのは、4つの独立した3次元培養のための十分な材料を作成します。これは、拡大または縮小することができます。
6. ピペットで24ウェルプレート上のウェルの中心に粘性混合物の40μlの滴。ウェルの側に実行してから、混合物を防ぐために、プレートのレベルを保持します。注：24ウェルプレート上の単一の列 - 4ウェルが - 各条件がテストされることをお勧めします。
7. プレートINTを置きますOA 37℃のインキュベーターで30分間乱されていないままにしておきます。 3D培養はこの期間中に重合します。
8. ゆっくりと細胞培養培地1ml中に三次元培養を沈めます。
   1. さらにゲル重合を促進するためにウェルにそれを追加するときにメディアが暖かいであることを確認してください。
   2. 重要なステップ： 静か 3D培養にメディアを追加 。ウェルに早すぎるメディアをピペットは、組織培養表面から3D培養の離脱につながることができます。

3.スフェロイドの侵入を監視し、分析

1. 研究者が決定した時点での周囲の3次元マトリックスにスフェロイドからの画像侵攻。 20倍対物レンズを倒立顕微鏡を用いて写真を取得します。注：理想の時点は、試験される細胞株によって異なります。より侵襲的な細胞株はすぐにメッキ後のスフェロイドからの出力を開始し、そのため、最初の写真がかかりますメッキ後の数時間内の。一般的に、写真は（メッキ後）0時間、24時間、および48時間で採取されます。侵攻は通常、播種後24〜48時間を終了します。
2. 画像J.のような画像解析ソフトを使用して侵襲的な能力を定量
   1. 回転楕円体の端からセル距離として侵略を分析します。
      1. 半径および/または最大侵襲距離をマークするためにストレートドローツールを使用します。
      2. トップメニューの「分析」をクリックして、[長さ測定値を表示するには、「測定」をクリックします。
   2. 回転楕円体の外側全体の侵襲領域として侵略を分析します。
      1. 回転楕円体および/または総侵襲的領域の境界をトレースするフリーハンド描画ツールを使用します。
      2. トップメニューの「分析」をクリックして、[面積計測を表示するには、「測定」をクリックします。
   3. 画像のスタックのための測定を作成するために、ROIマネージャーツールなどのプラグインを使用してください。

結果

スフェロイド浸潤アッセイを用いた （図1）、癌細胞株のパネルは、同様に基底膜材料およびI型コラーゲンから成る3次元マトリクス状に移植後展示電池出口の量についてのスフェロイドを形成するそれらの能力について試験しました（ 表1）。これらの結果は、全ての癌細胞株は、 インビトロでの上皮形態を有する細胞株は、通常、滑らかな凝集物を生成する傾向があった整形スフェロイドを、作成されていないことを示しています。アッセイに侵入する異なる細胞株の能力はまた、可変でした。 4T1、E0771、およびU-87 MGのような侵襲的なものとして確立された細胞株は、アッセイにおいて、回転楕円体出口の高度を示しました。予想されたようにあまり積極的な細胞株は、MCF-7のように、BT474、およびMCF10DICS.comは、侵入しませんでした。予期しない、しかし、A-431およびCOLO 357 PL細胞によって表示される浸潤の欠如でした。これらのいくつかのためのデータの例ラインは（ 図2）が示されています。 4T...

ディスカッション

この研究では、スフェロイド浸潤アッセイ（ 表1）の癌細胞株のパネルの性能を評価しました。一般的に、我々はスフェロイド形成が細胞間結合の存在は、回転楕円体のような構造の形成を促進する複数の上皮に見える細胞株に増強されることを見つけます。 MDA-MB-231細胞のような上皮間葉移行を経験した既知の細胞系は、それらの減少E-、N-およびP-カドヘリン発現¹⁶に最も可能性の高いハンギングドロップ培養でのスフェロイドを形成しません。

スフェロイド浸潤アッセイのステップのいくつかは、プロトコルへの密着性を必要とします。これは、基底膜とコラーゲンの混合物をピペットとき迅速に作業することが絶対的に重要であり、それは1つが、それが室温で固化し始めるであろうとして働いている間4℃に近い混合物を保持することが重要です。また、可溶性コラーゲンの調製物は、酸性であり、ADDITによりゲルに誘導されます水酸化ナトリウムおよび塩の少量のイオンを、37℃に加温しました。基底膜成分がコラーゲンを中和することが可能であるため、私たちの手では、単純に基底膜材料で...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
マトリゲル成長因子還元	コーニング	CB-40234
コラーゲンI型、ラットテール、ミリポア100mg08-115
DMEM	ライフサイエンステクノロジー	ズ11995-065RPMI1640
ミディアム	ライフテクノロジー	ズ 11875-093
PBS	ライフテクノロジー	ズ 10010-023
0.05% トリプシン-EDTA	ライフテクノロジー	ズ 25300-054
ウシ胎児血清、熱不活性化	オメガサイエンティフィック	FB-12
100 mm TC処理ディッシュ	コーニングインコーポレイテッド	430167
24ウェルTC処理プレート	NESTバイオテクノロジー	702001
オリンパスIX-71倒立顕微鏡
細胞株は、DMEM + 10%FBSで維持され、RPMI + 10%FBSでマンテインされたBT-474およびLNCaP細胞が期待されました。