パーキンソン脳からの可溶性および不溶性のα-シヌクレインの逐次抽出

Summary

ここでは、死後のヒト脳組織からますます不溶性/凝集したα-シヌクレイン（α-syn）を単離するためのプロトコルを提示します。界面活性剤強度が増大するバッファーと高速超遠心分離技術の利用により、疾患組織および非疾患組織におけるα-syn凝集の変動特性を調べることができます。

Abstract

α-シヌクレイン（α-SYN）、タンパク質が豊富に主に神経細胞内で発現し、多くの異なる形態で存在します - モノマー、四量体、オリゴマーおよび原線維。疾患中に、α-SYNは、タンパク質をより不溶性にする傾向があるオリゴマー及び高分子量の凝集体を形成するためにコンフォメーション変化を受けます。異常に凝集したα-SYNは、パーキンソン病（PD）、レビー小体（DLB）および多系統萎縮症（MSA）と認知症の神経病理学的特徴です。増加洗剤強度と高速超遠心分離を用いて緩衝液を使用して不溶性のα-SYNの生化学的特徴付けおよび分析は、疾患の進行に関連付けられているα-SYN病理の発達を決定するための強力なツールを提供します。このプロトコルは、死後のヒト脳組織からますます不溶性/凝集したα-SYNの単離を記載しています。この方法は、正常と異常αの研究への変更を適応させることができます異なるα-シン変異を有するトランスジェニック動物モデルにおける、ならびにそれらのそれぞれの病態に関与するタンパク質の異常な線維状沈着を特徴と他の神経変性疾患で-syn生物学。

Introduction

いくつかの神経変性疾患の間で共通鍵の病理学的特徴の一つは、タンパク質/疾患特異的¹で発生した異常なタンパク質凝集体の形成です。このように、アルツハイマー病（AD）における神経細胞内の特徴的な神経外アミロイドβプラーク凝集過リン酸化タウの沈着があります。レビー小体^{（DLBs）2-4}とPD、PDの認知症や認知症におけるレビー神経突起（LNS）と呼ばれるニューロン内封入体あるレビー小体（ポンド）であり、また、ジストロフィー神経突起内で凝集し、α-SYN預金。異常なα-SYN預金もMSA ⁵におけるグリア細胞質封入体の特徴病変で見られます。ハンチントン病では、そこに特徴的ポリQ堆積物であり、異常タールDNAは、タンパク質43と結合し、蛋白質肉腫（FUS）に融合した前頭側頭型認知症を堆積します。重要なことには、PDのための、α-SYN遺伝子変異はCAUに見出されていますSE常染色体優性PD ^6-11。さらに、α-SYN遺伝子三重¹²と重複^{13はまた、}このように、PDの発症機序に増加し、α-SYN式をリンクする家族性PDの原因となります。注目すべきは、散発的と家族の両方のPDの場合は、α-SYN病理¹⁴の異常沈着を抱きます。 PDのための現在利用​​可能な処置は対症的に過ぎず、容赦のない疾患の進行を停止または遅延させることには影響しません。

α-SYNが豊富ヒト脳で発現し、全脳タンパク質の約1％を占めています。これは、神経細胞内で、より具体的に存在するが、グリア細胞内のより少ない量ではあるが存在することができます。論争点がランダムモノマー¹⁵として、または折り畳ま四量体¹⁶として存在することができるα-SYNの天然の構造です。疾患中に、α-SYNは、ミスフォールドを取得することができ、その立体配座を変化させ、このプロセスは、疾患pathogeの原因であると考えられていますネシス。 α-SYNと疾患の病態生理学的側面 ​​の調査の数年にもかかわらず、病気のメカニズムの正確な原因は¹⁴とらえどころのない残っていました。

パーキンソン脳の事後分析を用いた研究はこれまでに、LRRK2遺伝子^17-22における突然変異に関連するPD散発PDにし、また、両方のα-SYNの正常および異常な生物学に関する重要な手がかりを提供しています。ここでは、程度の差は、α-SYN凝集体を抱く人間の死後のPD脳組織からますます不溶性α-SYN預金の生化学的な抽出プロトコルは、（参照方式は、図1に示す ）に記載されています。この技術はまた、他の神経変性疾患^23,24から集合タンパク質を研究するためのバッファ組成物に変更して、また、トランスジェニック動物の脳組織^25-27から適応させることができます。適応のための主な考慮事項はsolubiの違いですリティ、主に核であり、FUS ²⁸について示されるように、最適な抽出のために、高塩緩衝液を必要とするかもしれないそのうちのいくつかは、それぞれのタンパク質の総量。

Protocol

死後脳組織が神経疾患のためにクイーンスクエア脳バンクに寄贈された、ロンドン大学、倫理的に承認されたプロトコルを用いて神経学研究所ヒト組織機関によって発行されたライセンスの下で研究のために保存（HTA）、英国（NO。12198）。このプロトコル（ 表1）に使用するケースのリストを参照してください。

バッファーの調製

1. 1×TBS（トリス緩衝食塩水）バッファーを準備します。
   1. 500 mMトリス - 塩酸pHが7.4と1500 mMのNaClを含む原液として10倍のTBSを準備します。
      1. うち60.5グラムのTris-ClでpHを7.6と高純度水の800ミリリットル中のNaClの87.6グラムを計量。 1MのHClを用いてpHを調整し、1 Lに、最終的な在庫量を作ります
   2. 蒸留水に株式を10回希釈することにより1X TBSの最終濃度を準備します。
   3. プロテアーゼ阻害剤を加える（PI）、（50 mlの緩衝液当たり1錠）及びフォス停止ホスファターゼ阻害剤錠剤（緩衝液10ml当たり1錠）にプロテアーゼおよびホスファターゼの非特異的な酵素作用の影響を排除。
      注：ここでは、ロシュからの酵素阻害剤錠剤を使用しているが、同じように他の市販の阻害剤は、製造業者の説明書に従って使用することができます。
2. 1X TBSへW / Vドデシル硫酸ナトリウム（SDS）（pH7.4）でバッファ5％添加し、TBS-SDS緩衝液を準備します。 SDSを可溶化するために、磁気スターラーを用いて一定に攪拌しながら60℃に溶液を加熱します。
3. / 1×TBS-SDS緩衝液（pH 7.4）にV wを8 Mの最終濃度に尿素を加えることによって、TBS-SDS-尿素緩衝液を準備します。尿素を溶解し、マグネチックスターラーで絶えず撹拌しながら60℃に溶液を加熱します。

2.サンプル均質化および差動超遠心

注：以下の作業の一部は、HTA UKの規則に従って、ヒト脳組織の取り扱いを伴います。ローカル標準操作手順は、すべてのTIで追跡されていますMES。脳サンプルを負圧に維持microcabinetで均質化凍結脳ブロックおよび組織材料から切除されます。使い捨てガウン手袋、フェイスマスク、オーバーシューズプロテクターと安全ゴーグルは、プロシージャ全体で着用されています。ヒト組織廃棄物は安全に処分するため、20分間121℃でオートクレーブ処理後に廃棄されます。シャープ（メスの刃）を包含し、安全に処分するために適切なシャープコンテナに配置されています。

1. 凍結ヒト組織（大脳基底核領域から重量で約0.5グラム）のチャンクを取り、迅速に小さなペトリ皿や滅菌手術用メスの刃を使用して氷の上に小さな断片（約1mm ^2）にミンチ。各サンプルの別々のペトリ皿とメスの刃を使用してください。 15mlチューブにみじん切りの組織を収集し、チューブに氷冷1XTBSバッファの10のボリュームを追加します。
2. 10秒間20,000rpmで機械的ホモジナイザーを用いてサンプルをホモジナイズします。 2分間氷上で冷却します。このステップ3回繰り返します秒。
   注：均質化しながら、サンプルが加熱されないように行われます。
3. 4℃で5分間、1000×gで遠心分離することによって明らかにします。非均質化された材料のペレットを捨てます。
4. 、上清（粗ホモジネート）を取るポリカーボネート遠心管に加える（チューブのサイズはローターのサイズに依存）、慎重にバランスをとります。 4℃で1時間、100,000×gで遠心分離します。
5. これは、TBS-可溶性画分であるとして、上清を保持します。
6. 洗浄は、4℃で15分間、100,000×gで1×TBS緩衝液および遠心分離の5つのボリュームに2回ずつ時間をペレット化。上清を捨てます。
   1. 室温で1×TBS-SDSの約5倍量の20 kHzで10秒間ペレットを超音波処理することによって、最終的なペレットを再懸濁。
      注：SDS含有緩衝液サンプルの添加はSDS沈殿を避けるために、10℃でもたらされるべきである前に。
   2. 25℃で30分間100,000×gで超遠心機。
7. これは番目であるとして、上清を保持eは可溶性画分をSDS。
   1. ウォッシュは、室温で1×TBS-SDS緩衝液の5倍量の二回ペレット。 25℃で15分間100,000×gで遠心分離するたびに。
   2. 完全な可溶化を達成するために10秒間20 kHzで設定し、超音波処理器を使用して、1×TBS-SDS-尿素緩衝液50μlの最終ペレットを可溶化します。これは、尿素可溶性画分と呼ばれます。
8. 製造業者のプロトコルに従って市販のタンパク質アッセイキットを用いて全タンパク質含量のために、各画分をアッセイ。タンパク質アッセイ試薬との互換性を可能にするために、1×TBSバッファーで1：TBS-SDS-尿素サンプル1を希釈します。 -80℃で少量のアリコート（20μL）中で凍結サンプルを、凍結融解サイクルを減少させます。
   注：サンプルに10％グリセロールを追加すると、-80℃で長期保存することをお勧めします。

サンプルと分析結果の3イムノブロッティング

1. 10ウェル、4〜12％ビス - トリスポリアクリルアミドゲル上で、TBS、TBS-SDSおよびTBS-SDS-尿素抽出物からの実行サンプル標準的な技術を使用してバッファを実行しているとしてMOPSを持ちます。詳細なウエスタンブロットプロトコルのギャラガーとチャクラバルティ^{（2008）29を参照してください} 。
2. TBSとSDSおよび尿素分画のための分子量マーカーと一緒に各レーンにロード各試料からの10μgのタンパク質を。
3. 1時間またはローディングバッファーからの青色色素がゲルの底に到達するまで、200Vでゲルを実行します。
4. 電気泳動ナイロン膜²⁸上にゲルからタンパク質を転送し、20％メタノールを含有する転写緩衝液中に最初に100％メタノールで、次いで、予め湿らせました。タンパク質側及び分子量サイズマーカーの向きを決定するために、ブロット上の識別マークを提供します。
   1. 湿った濾紙と一緒に膜を有するゲルを挟みます。膜の正しい配置は、ゲルとアノードとの間の膜とが重要です。 40 Vで2時間転送を行います
   2. 1X PBS-トゥイーン（1X PBS-T）バッファを構成する：200ml中にPBSを1錠を溶かし水は、0.01 Mリン酸緩衝液、0.0027 M塩化カリウムおよび0.137 M塩化ナトリウム、pHが7.4を得ました。
   3. 70rpmで振盪しながら30分間、1X PBS-T中の5％BSA溶液中で膜をブロックします。これは、膜を一次抗体の非特異的結合を防止します。
5. （1×PBS-Tで一連の洗浄に続いて（4℃でO / N）750希釈：1で、α-SYN一次抗体SYN-1（マウスモノクローナル抗体BD Biosciences社）を6 mlのタンパク質ブロットをプローブ3×5分ごとに^）28。
6. 1で適切なHRP結合二次抗体でブロットをインキュベート：30分2,000希釈。 1×PBS-Tで一連の洗浄（3×5分ごとに）を実行します。
   1. 暗い部屋で15秒間増強化学発光溶液中でブロットを浸し。ラップフィルムでブロットをカバーし、適切な信号（適切なサイズのバンド）をキャプチャするために、光を通さないカセットにタンパク質側を上にしてブロットに対してオートラジオグラフィーフィルムを配置します。
   2. 自動化された現像剤中のオートラジオグラフィーフィルムを開発。
      注意：ブロットはまた、自動化された開発者のマシンが利用できない場合には商業的供給源からの現像液と定着液を使用して手動で開発することができます。
7. 定数α-SYN抗体シグナルのブロットを取り除くために振盪しながら10分間ストリッピングバッファーウエスタンブロットの6ミリリットルでウエスタンブロットをインキュベートします。 8000希釈：1でベータアクチン一次抗体（マウスモノクローナル）を使用して3.6.2に至るまでのステップ3.43に従ってください。
8. スキャンおよび定量のために、NIH ImageJの（無料ダウンロード可能なソフトウェア）を使用して、TIFF画像と測定濃度に最終画像を変換します。
   注：ソフトウェアは、関心の相対面積（適切なサイズのバンド）の濃度の読み取りを可能にし、データがいずれかの上の任意の単位として、またはα-SYN密度/βアクチン（ハウスキーピング遺伝子）の比として表すことができます。独自のハウスキーピング遺伝子は、（尿素水溶性サンプルの場合のように）有効でない場合。

Results

TBS、SDSおよび図1に示したプロトコルに従って基底核から抽出された尿素可溶性タンパク質は、ゲル上で実行され、α-SYN SYN-1マウスモノクローナル一次抗体を用いてイムノブロットしました。 TBS可溶性画分は、PDと制御の場合には、単量体、α-SYN（〜14 kDaの種）の存在を示した（ 図2A）を調べました。 SDS可溶性画分は、低露光ブロット（ 図2C）に表示される研究例すべての3つのサブタイプで豊富な単量体のα-SYNを示しました。 PDの例はまた、オリゴマー（ 図2C）である可能性が高い、高露光ブロットで見られるように、より高い分子量（MW）α-SYN種を示しました。 PD症例からの尿素可溶性画分は、対照例と比較して、α-SYNモノマー、オリゴマーおよび凝集した種の高められた量を示しました。新皮質特発性PDの例はaggregの高い量を実証大脳辺縁系の場合は、不溶性α-SYNの中間レベルを示す一方で、α-SYN種をated。 ^20は説明したように、SDSおよび特発性PDの例からの尿素分画の両方が、12 kDaのと6キロダルトンで短縮型α-SYNの製品の様々なレベルを示しています。対照的に、対照例は、任意の不溶性または凝集したα-SYN（ 図2E）を示さありませんでした。半定量的密度の措置は新皮質と辺縁系のPDの場合に集約されたα-SYN（ 図2B、2D、2F）の不溶性の性質を実証するα-SYNの免疫組織化学を使用してcategoriesdとしてLB負荷の量を反映しています。

図1.不溶性 α-syn抽出手順 の概略図 。目標確認= "_空白">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2. PDからのα-synレベル の代表的なイムノブロット およびヒト組織を制御する。TBS、SDSおよび尿素可溶性画分大脳基底核（対照）特発性PD症例のと神経学的に正常な（PD症例でα-SYN病理を保有領域）から脳をウェスタンイムノブロットを用いてα-SYNの存在に​​ついて分析しました。 10μgのタンパク質を各レーンにロードしました。 TBS画分（A）においては、主にα-SYNモノマーは、すべての場合に存在します。 SDS画分（C）は、α-SYNのいくつかのオリゴマーは、主に、PD組織中のモノマーと一緒に見られます。尿素画分（C）において、モノマー、オリゴマーおよび凝集したα-SYNを可変PDケースreflectinで発現されますグラム、それぞれのLB負荷。神経学的に正常な対照サンプルは、単量体のα-SYNのごく少量の存在を示します。 α-SYNの分解生成物は、高LB負荷の例いくつかに見られる可能性に注意してください。実線の矢印ヘッドは、α-SYNの単量体の形を表しています。 *おそらく以前に^{20,26に記載されているように} α-SYNのC末端切断形態を表す。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

場合	セックス	死亡歳時の年齢	死後遅延（時間）	組織のpH
新皮質1	M	82	40	6.3
新皮質2	F	75	35.3	6.4
大脳辺縁1	M	81	28.5	6.2
大脳辺縁2	F	79	36.5	6.2
コントロール1	M	80	38	6.1
コントロール2	F	83	32.5	6.3

使用例表1限定人口統計

Discussion

この記事では、変性ゲル走行条件を使用して病気の脳から抽出し、モノマー、オリゴマーの溶解度差のプロパティの検査および集約α-SYNのための生化学的なプロトコルを記述します。これは、凝集したα-SYN ^{17,18を研究するために} 、十分に確立された技術^{、20、21、}その天然の形態で通常は可溶性であるが、疾患の進行を伴うまたは遺伝的変異を有するアミロイド生成または増加凝集特性を得るタンパク質です。それにもかかわらず、いくつかのグループは^30、そのバッファに（8％または10％の代わりに^{5％）21,22を} 、SDS濃度のわずかな変動を使用していた。SDSは、α-SYNの膜結合形態を含むことができオリゴマー陰イオン界面活性剤とsolubilisesですα-SYNは、尿素のに対し、カオトロピック試薬は、α-SYN ²⁰の不溶性の凝集および原線維またはアミロイド生成性のフォームを変性させます。この点でPaleologouら^31による系統的な研究は、安定性を調べました尿素の様々な濃度のα-SYNオリゴマーおよび原線維の（6.5から8 M）またはSDS（0.25から2パーセント）及び尿素濃度の高いオリゴマー、SDS濃度の安定ではないことを報告しました。 α-SYNオリゴマーおよび原線維のための具体的な彼らのFILA-1抗体は、非変性条件下での6.5 M尿素濃度で繊維の高い濃度が検出されました。このプロトコルで使用されるバッファーの濃度は厳密にCulvenor らに記載されているものを反映します。 ^{（1999）32。}

不溶性α-SYNの生化学的抽出のための解剖学的脳の領域は、慎重に選択されるべきであり、これは、疾患の進行^33,34に応じて、α-SYN LBとLN負荷を反映する必要があります。ここで使用されるケースがMcKeith ctriteria ³⁴に係るPDの進行の後期および中間段階を反映したPDの新皮質と辺縁系のサブタイプから基底核サンプルです。クイーンスクエア脳バンクでは、脳の半分です日常組織化学的分析のためにホルマリンで固定し、残りの半分は、慎重に、さらに生化学的およびDNA / RNA分析研究のために-80 ^{O Cの}冷凍庫で凍結して保存異なる解剖学的領域とフラッシュに解剖されています。神経病理学者によって脳や解剖のホルマリン固定後、免疫組織化学はアーカイブα-SYN抗体との結果を用いて行われます。また、日常的な手順として、脳組織のpHは、脳組織の死戦状態の尺度として到着時に測定されます。これは、生化学分析のための組織保存の品質のための強固な基礎を形成します。

ここで我々のデータは、より多くのSDSは、可溶性α-SYNモノマーは、対照と比較して、PDのケースであることを示しています。特に新皮質のPD症例は辺縁系PD品種に比べて高いα-SYNの負荷を持っています。新皮質の場合は、正面と頭頂CORとして新皮質の領域におけるPDα-SYN病理のより大きな進行を表しますtices ^33,34。大脳辺縁系のPDの場合は、扁桃体、transentorhinalと帯状の領域のような前脳基底部/辺縁領域の分野で高いLBスコアを持っています。意味のあるデータと統計分析のために、一つは各コホートから少なくとも4例を実行する必要があります。同様に、我々はここに提示ブロットデータの統計的分析を試みていません。

それはまた、異なる抗体は、異なる形態/高次α-シンオリゴマーの組成を認識してもよいし、それぞれが独自の相対的な感度および好みを有してもよいことに注意しなければなりません。これはトンらの結果から明らかである。彼らは4つの異なるα-SYN抗体（SYN-1、SS、オンコ及びLB509）は、少なくともα-SYNオリゴマー/集合体のための変更の結果を与えることを示している^29。これらは、α-SYN抗体エピトープは、N末端またはCのいずれかに配置されているかどうかに依存して変動を有することができるが、α-SYNモノマーはすべて4抗体によって同様の程度に認められました²⁹末端。同様に、リン酸化アルファに特異的な抗体は、シヌクレインの異なる高分子量αシヌクレイン種^{20,21を決定します} 。ここに記載されたプロトコルでは、非常に特徴の抗体のSyn-1 ^{19-21使用されて}います_。

しかし、抗体の前吸収実験によりウェスタンブロット上の任意の新しい抗体を検証し、また、細胞内のタンパク質の過剰発現とノックダウンを考慮することが重要です。

これは、α-SYNとまたは不安定な四量体、α-SYN形の小さな断片を決定するために研究者によって適用されている他のバリエーションを考慮することが重要です。これは、四量体^{36を安定化させるために}架橋剤とα-SYN ³⁵またはサンプルホモジネートの治療の短縮形態を保持するために、PBS中の0.4％のPFAを有する膜の軽度固定を含めることができます。

死後のTIを使用して、タンパク質の正確な生化学的評価ssueは、酵素タンパク質の分解や変更の最小化を必要とします。これは、最短死後遅延で組織を使用し、および/またはケースのコホート内で一致したサンプルを選択することをお勧めします。 α-SYNの免疫組織化学のために、標準的な抗体を用いた免疫組織化学は、分離プロトコルを開始する前に実行する必要があります。 α-SYN病理の程度は非常に可変であり、選択された領域に応じて変化することができます。これは、すべての実行で最適な歩留まりの陽性対照として、豊富な病理との領域を選択することをお勧めします。必要なホスファターゼ阻害剤、プロテアーゼ阻害剤の場合と使用は、細胞溶解中に発生し、4°Cでサンプルを維持する細胞内プロテアーゼまたはホスファターゼの放出後に非常に重要である望ましくない酵素分解を防止することができます。

これは、実験のバッチ内のサンプルのすべてがイントラユーザの変動を回避するために、均一にかつ一貫して処理されることが重要です。複数のFREこれは潜在的に、このようなリン酸化などの翻訳後修飾を撤回することとしてエズ - 融解サイクルを避けるべきです。多数のサンプルを検査する際に念頭に置いて負担する重要な点は、イムノブロットのデータは、ゲル上の他のすべてのサンプル、そのサンプルに参照されるすべてのデータと並列に実行する必要があります一つのサンプルに正規化しなければならないということです。これは、いくつかの間でイムノブロットデータの正規化を確保するために行われます。これは、我々の最近の研究²²で採用されている方法です。

これは、低いバックグラウンドECLを維持するために、ブロットをウェスタンブロットプロトコルの中の任意の時点で乾燥させてはならないことに留意すべきです。これはECL信号の飽和につながると不正確な定量につながるとして加えて、オートラジオグラフィーフィルムに非常に長時間露光（> 10分）は避けるべきです。

プロトコル上のこれは一般的な実験用試薬を用いて、比較的簡単な技術であり、中楽器とPD研究におけるα-SYNタンパク質の病態生理学を研究するための貴重なツールになります。この方法は、α-SYNトランスジェニック動物におけるα-SYNの生物学の研究にだけでなく、AD、MSA、DLB、HDとfrontotemporaldementiasとして凝集したタンパク質の異常沈着を特徴と他の神経変性疾患に適切な修正を加えて拡張することはできません。しかし、ここで説明したウエスタンブロットデータは、α-SYN ³¹の特定の形態のための抗体を用いた酵素結合免疫吸着アッセイを使用して検証することができます。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tris-HCL	Sigma	T5912
ナトリウム	VWR	27800.291
SDS	Fluka	71727
素	Sigma	U5378
プロテアーゼ阻害剤錠剤	ロシュ	04 693 116001
ホスファターゼ阻害剤錠剤	ロシュ	04 906 837001
リン酸緩衝生理食塩水錠剤	シグマ	P4417
トゥイーン-20	Sigma	P9416
NuPAGE MOPS SDS ランニングバッファー	Invitrogen	NP0001
NuPAGE transfer buffer	Invitrogen	NP0006-1
Hybond-P membrane	GEヘルスケア	RPN303F
Whatman 3MM濾紙	Sigma	WHA30306185
Bis-trisゲル 4-12%	インビトロジェン
Supersignal West Pico 化学発光基質	Pierce	34080
Bio-RAD DC タンパク質アッセイキット	Bio-Rad	500-0112
厚壁 Beckman ポリカーボネートチューブ	Beckman	355630
ウェスタンブロットストリッピングバッファー	Thermo scientific	46430
Syn-1 一次抗体 (マウスモノクローナル)	BD Biosciences	610786
β-actin 一次抗体 (マウスモノクローナル	Sigma	A5441
HRP 共結合ヤギ抗マウス二次抗体	Santa Cruz	sc-2031
ウシ血清アルブミン	Sigma	A7030
Instrument	Company	ローター/ モデル番号
卓上型超遠心分離機 Optima Max	Beckman	MLA-80
超音波処理装置	ヒートシステム	XL20-20
ホモジナイザー	Jenke and Kunkel	TP18/10