クジラミオグロビンの検出のための金コロイドベースのイムノクロマト法テストストリップの開発

サマリー

このプロトコルは、鯨類のミオグロビンに強く反応する2つのIgGクラスモノクローナル抗体(mAb)の開発について説明しています。これらのモノクローナル抗体は、サンドイッチフォーマットに基づく金コロイドイムノクロマトグラフィー試験ストリップに適用され、鯨類のMbをアザラシや他の動物と区別します。

要約

このプロトコルは、鯨類のミオグロビン(Mb)をアザラシや他の動物のミオグロビン(Mb)と区別するために使用できるサンドイッチ形式に基づくコロイド金イムノクロマトグラフィーテストストリップの開発を説明しています。このストリップは、鯨類の肉の迅速かつその場でのスクリーニングを提供し、それによってその違法な取引と消費を抑制します。鯨類のMbに対して反応性を持つ2つのモノクローナル抗体(mAb)を開発しました。2つの合成ペプチド(一般ペプチドと特異的ペプチド)を設計し、その後、モノクローナル抗体(サブクラスIgG₁)を上げるために、さまざまな動物由来のMb抗原反応領域のアミノ酸配列を分析しました。mAbは、間接ELISAでスクリーニングしたハイブリドーマ、ウェスタンブロット、およびドットブロットから選択しました。CGF5H9は、ウサギ、イヌ、ブタ、ウシ、ヤギ、クジラ類のMbsに特異的であり、ニワトリ、マグロ、アザラシのMbsには弱いか、まったく親和性がありませんでした。CSF1H13アザラシやクジラ類には強い親和性で結合できますが、他の動物には親和性を示しませんでした。この研究では、4つの科(Balaenopteridae、Delphinidae、Phocoenidae、Kogiidae)の鯨類サンプルを使用し、その結果、これら2つのmAbが異なる鯨類由来のMbsに広く結合できることが示されました。これらのモノクローナル抗体をサンドイッチ型コロイド金イムノクロマトグラフィー試験ストリップに適用しました。CGF5H9は多くの種を認識するため、金コロイド標識を行い、検出抗体として使用しました。試験ゾーンにコーティングされたCSF1H13は、鯨類とアザラシの存在を検出し、マグロ、ニワトリ、アザラシ、陸生哺乳類5種、鯨類15種の筋肉サンプルを三重に試験しました。すべての鯨類のサンプルは陽性の結果を示し、他のすべてのサンプルは陰性の結果を示しました。

概要

歴史的に、鯨類の肉は世界の多くの地域で消費され^{、この消費}は今日も続いています。鯨類の栄養段階により、高濃度の水銀やその他の毒素が肉に存在することが知られています²。したがって、鯨類の肉の摂取は、妊婦などのハイリスクグループだけでなく、一般の人々にとっても健康問題につながる可能性があります³。さらに、鯨類の肉が人獣共通感染症または潜在的に人獣共通感染症の病原体に汚染されることも、その加工および保管中に発生する可能性があります⁴。経験豊富なエージェントでも、見た目だけで鯨類の肉を識別することは困難です。したがって、鯨類の肉を他の肉と区別するためには、信頼性の高い科学的同定方法が必要です。これは、鯨類の肉の消費を制限するのに役立ちます。

現在の種の同定方法には、分子技術と免疫学的方法が含まれます。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)やDNAシーケンシングなどの分子技術を用いて、生肉⁵や分解サンプル⁶だけでなく、調理済みソーセージや飼料などの加工食品^7,8からもサンプルを同定することができる。酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)などの免疫学的方法は、豚肉⁹、牛肉¹⁰、ナマズ¹¹などの肉含有量を検出するために、食品製造に一般的に適用されています。鯨類の肉を同定するためのPCRベースのDNA分析が利用可能であり¹²、日本、韓国、フィリピン、台湾、香港、ロシア、ノルウェー、および米国における鯨類の違法な国際取引の防止に役立っています¹。これらの方法は効果的で信頼性がありますが、完了するまでに数時間から数日かかり、面倒な手順を伴う場合があります。鯨類の肉の同定は通常、分子技術に基づいており、現在利用可能な免疫学的方法はありません。規制当局にとって、鯨類の肉を同定するために現場で使用できる信頼性と迅速な技術を開発することが非常に望ましいです。

イムノクロマトグラフィーストリップは、現場での使用に適した簡単なプロトコルで迅速な結果が得られるという利点を持つ検出ツールとして使用されます。イムノクロマトグラフィーストリップとELISAの原理は非常に似ており、抗体、抗原、および標識が含まれます。コロイド状金、カーボン、ラテックスなどの多くの異なる標識が、イムノクロマトグラフィーストリップの開発に使用されてきました。現在、この方法は、抗生物質、毒素、細菌、ウイルス¹³の検出に一般的に使用されているが、肉^14,15のタンパク質の同定にはほとんど使用されていない。ここでは、鯨類ミオグロビン(Mb)の迅速な検出のためのラテラルフロークロマトグラフィー酵素免疫測定法を提案します。

プロトコル

倫理に関する声明：本研究は、国立嘉義大学、承認IDの施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって国際的なガイドラインに従って行われ、承認されました：鯨類のサンプル使用は、台湾の農業委員会（研究許可証によって許可された99022. 100M-02.1-C-99）。

1.筋肉サンプル調製し、SDS-PAGE

注：海洋哺乳類の16種、陸生哺乳類の5種を含む23種から筋肉サンプルは、マグロや鶏肉は、この試験（ 表1）で使用しました。鯨類の筋肉サンプルは二本鎖個人、漁業の混獲、および没収から入手しました。ウサギ、ラット、イヌ、およびニワトリ筋組織は、国立嘉義大学の動物疾病診断センターから入手しました。牛肉、豚肉、羊肉、マグロのサンプルは地元のスーパーマーケットから購入しました。港シール（ ゴマフアザラシ属のvitulinaの筋肉サンプル）Fargloryオーシャンパークによって提供されました。ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）は、筋肉試料中の異なる分子量を有する可溶性タンパク質を分離するために使用しました。

1. 使用するまで-20℃ですべてのサンプルを保管してください。
2. -20℃でプレクールモルタル。そして、その中に凍結された筋肉サンプルの3グラムを入れました。
3. 組織ホモジナイザーを使用して冷たいリン酸緩衝生理食塩水（PBS）10mlで試料を均質化。
4. 4℃で10分間万×gで均質化したサンプルを遠心。上清を収集し、使用するまで-20℃で保存。
5. 5％の5mlをゲル（蒸留水3.07 mlであり、pHが6.8の4倍上部ゲル緩衝液1.25mlの40％アクリルアミド、10％の過硫酸アンモニウム（APS）を50μl、およびテトラメチルエチレンジアミンを5μlの625μLを（積層調製TEMED））および15％分離ゲルの10ミリリットル（40％アクリルアミドの蒸留水3.65ミリリットル、pHが8.8の4倍より低いゲル緩衝液の2.5ミリリットル、3.75ミリリットル、10％APS100μlの、そして、TEMEDの4μL）。
   1. 後者が固化した後、電気泳動セルでは、分離ゲル（15％アクリルアミド）の上にゲル（5％アクリルアミド）を積層注ぎます。スタッキングゲル中のゲルコームを挿入します。
6. 以下の条件に応じてページを実行します。最初の実行条件：100ボルト、20分と最終条件：120ボルト、40分。
7. ゲルの色が均一に青になるまで30分間、室温でクマシーブリリアントブルーでゲルを染色します。
   注：ゲルはもはや色素溶液に表示されない場合に染色が完了しました。
8. 1時間室温で酢酸溶液（10％）として脱色。バンドが表示されるようになります。背景が透明になるまで4℃で一晩脱色続けます。

2.ペプチド合成およびモノクローナル抗体産生

1. マグロ、鶏、ダチョウ、家畜哺乳類、シールと18種を含むのGenBankからメガビットのアミノ酸配列を取得します鯨類（ 表2）。
2. 適切なソフトウェア^16を使用して配列を整列させます：
   1. 整列を選択することにより、アライメントExplorerを起動します 。 編集/起動バー上のアライメントを構築します 。 新しいアラインメントを作成 ] を選択し、[OK]をクリックします。ダイアログが尋ねる表示されます。「あなたは、DNAやタンパク質配列アラインメントを構築していますか？」
   2. 「 タンパク質 」というボタンをクリックします。 オープン：データを選択し、ファイルを選択し、シーケンスファイルからの配列を取得します 。 [編集]を選択します 。複数の配列アラインメントを作成するためのデータセット内のすべてのシーケンスのすべてのサイトを選択するために、 すべてのメニューコマンドを選択します 。
   3. 選択配向：のClustalWアルゴリズムを用いて選択された配列データを整列するために、メインメニューからのClustalWによって揃え 。ウェイトマトリックスプロテインとして「BLOSUM」を選択し、[OK]ボタンをクリックします。
3. 配列アラインメントを分析します。
   1. 5抗原反応性のsiに焦点を当てますTES ^17：サイト1（AKVEADVA、15-22）、サイト2（KASEDLK、56-62）、サイト3（ATKHKI、94-99）、サイト4（HVLHSRH、113-119）、サイト5（KYKELGY、145- 151）と鯨類間で保存断片を見つけます。 *（アスタリスク;アライメント（プロトコル2.2.3）でのコンセンサス記号）は、単一の、完全に保存された残基を持っている位置を示しています。鯨類の以下の保存された断片が発見された：（サイト2を含みます）シーケンスKASEDLKKHGとシーケンスHVLHSRHP（サイト4を含みます）。
4. 配列分析によると候補配列の断片を合成し、商業サービスを使用して、担体タンパク質として卵白アルブミンタンパク質（OVA）とコンジュゲート。
   1. 分解（ 例えば 、M-KASEDLKKHG）からペプチドを防止するための抗原反応性部位のN末端 ​​に疎水性アミノ酸（ 例えば 、メチオニン）を加えます。
   2. 免疫細胞にコア抗原部位を露出させるための抗原反応性部位のC末端側を長く。また、conjuゲートC末端にシステイン（Cysを、C）を添加することにより、OVAを有するペプチド（ 例えば 、M-KASEDLKKHG-NTVL-C）。
5. 免疫原1またはPBS中の各合成ペプチドの等量の（3ミリリットル、最終濃度30〜50μgの/100μl）を持つ免疫原2のための不完全フロイントアジュバントのために完全フロイントアジュバントを乳化。
6. 皮下に5匹の雌BALB / cマウスの各々に、免疫原1（0.1 mg）を接種します。
7. 2週間間隔で免疫原2を使用して皮下のブースター注射を5回実行し、すべての追加免疫前のマウスから尾クリップサンプリングによって試験血清を収集します。
8. 最初のスクリーニングのための血清力価を決定します。
   1. 96ウェルプレートの各ウェルに、反応バッファ、アリコート25mlの溶液50μl中の遊離ペプチドの100μgのを溶かします。各ウェルに10μlのカップリング試薬溶液を加え、プレートを混ぜます。室温で2時間静置します。
   2. ウェルの内容を削除し、蒸留水で各ウェルを3回洗浄し、ブロッキング溶液を200μlを添加することによりプレートをブロックします。室温で1時間インキュベートします。コンテンツを削除し、蒸留水で各ウェルを3回洗浄します。
   3. 最初のスクリーニングのための血清力価を決定するための間接ELISA（プロトコル5.1から5.7）を実行します。脾臓収集のための最高力価（最高光学密度）を有するマウスを選択してください。
9. 3日前脾臓コレクションに、皮下最高力価を提示するマウスに免疫原1の0.1 mgの接種。
10. モノクローナル抗体の生成¹⁸のためのハイブリドーマ細胞を得るために、マウス骨髄腫細胞F0（SP2 / 0-AG14）との選択免疫したマウスとヒューズからの脾臓細胞を収集します。
11. 14日融合後、間接ELISA（プロトコル5.1から5.7）を用いて遊離合成ペプチドに向かってハイブリドーマ上清の反応性をスクリーニングすることにより陽性クローンを選択します。
12. maximizウェル毎に適切な数に細胞を希釈ただ1つのクローン（希釈クローニング）を含有するウェルの割合をる。
    1. 空のままにされたウェルA1を除いて、96ウェルプレート内のすべてのウェルに細胞培養培地100μlを加えます。
    2. よくA1に200μlの細胞懸濁液を追加します。その後すぐにB1にA1から100μlのを転送し、穏やかにピペッティングして混ぜます。列全体ダウン2希釈液、およびそれはそれ以上の井戸と同じボリュームで終わるように、H1から100μLを捨てる：これらの1を繰り返します。
    3. 8チャンネルのマイクロピペットを用いてカラム1に培地の追加の100μlのを追加します。その後すぐに同じピペットを用いてカラム2のものに列1の各ウェルから100μlのを転送し、穏やかにピペッティングして混ぜます。
    4. プレート全体を横切る2希釈液：同じチップを使用して、これらの1を繰り返します。最後の列に各ウェルから100μlを廃棄してください。
    5. 各ウェルに100μlの培地を添加することによって200μlにすべてのウェルの最終容量をもたらします。ナンプラーをインキュベートteの加湿CO ₂インキュベーター中、37℃で邪魔されず。
    6. 各ウェルをチェックして、ちょうど単一コロニーを含むすべてのウェルをマーク。単一クローンを含むウェルの> 90％が抗体産生について陽性であるまで、二つ以上のクローニングを行います。
13. ウェスタンブロット、ドットブロット（プロトコル3.1から4.6）によりクローンをスクリーニングします。次に、モノクローナル抗体を得るために細胞を拡大するために、より大きな容器にウェルからコロニーを継代培養。通常、各クローンは、12または24ウェルプレート中で単一のウェルに移します。
14. ウェスタンブロット、ドットブロット（プロトコル3.1から4.6）によってmAbおよび牛、ヤギ、ブタ、イヌ、ウサギ、マグロ、鶏肉、シール、および4つの代表鯨類から筋肉抽出物との親和性を測定します。
15. 腹水を誘導するためにマウスの腹腔内に（3×10 ⁶まで）選択されたハイブリドーマ細胞を接種します。腹部の腫れは7-10日以内に一般的に明らかであるハイブリドーマ注射後。皮下注射針を使用して流体を収集（未満20ゲージ）。
16. 遠心分離機腹水（10分間万XG）は、細胞および破片を除去します。 0.45μmのフィルターを通して濾過。プロテインGセファロースカラムへのサンプルの1〜20ミリリットル、結合緩衝液15ミリリットル、および溶出バッファーの3〜5ミリリットルを追加します。マウス腹水から精製された抗体を含む溶出画分を収集します。
17. 製造元の指示を用いて抗体アイソタイピングキットによって抗体のアイソタイプを決定します。

3.ウエスタンブロット

1. BME50μlの2×Laemmliサンプルバッファーの950μLを混合することにより、βメルカプトエタノール（BME）を含む2×ローディングバッファーを準備します。良好な信号を得るための適切な比率でローディングバッファーで筋肉上清（プロトコル1.1から1.4）を希釈：1：50（鯨類とシール）と1：5（家畜やマグロ）ポリクローナルウサギ抗ヒトMbの抗体を使用した場合、および1：1（ブタ、ウサギ、ニワトリやマグロ）、1：5（牛、ヤギ、犬）、および1時25分（鯨類とシール）時ntibodyは、ハイブリドーマ上清からです。
2. 5分間95℃で加熱試料。分子量マーカーと一緒にSDS-PAGEゲル（4％アクリルアミドスタッキングおよび12％アクリルアミド分離）のウェルにロードしたサンプル。約1時間に実行を完了するために150 Vに電圧を増加させる、その後50 Vで5分間ゲルを実行します。
3. 15分間、1×転写バッファーでゲルを置きます。彼らはPAGEによって分離された後、ニトロセルロース（NC）膜に分離されたタンパク質を転送します。転送は、60〜90分間、100Vで行うことができます。
4. ブロッキング溶液を準備します：1×PBS、5％脱脂粉乳、0.1％Tween 20を含みます。室温で1時間ブロッキング溶液25mlにNC膜をブロックします。トゥイーン20（PBST）で15ミリリットルのリン酸緩衝生理食塩水で5分間ずつ3回洗浄します。
5. 抗体希釈緩衝液を4℃で一晩5％ブロッキング溶液で希釈して10ml中膜と一次抗体（腹水またはハイブリドーマ上清）をインキュベートします。
6. membranを洗います過剰な抗体をきれいにするPBSTで再び電子三回。
7. 1でアルカリホスファターゼ結合ヤギ抗マウスIgGで膜をインキュベートする：ブロッカー溶液中1,250室温で1時間穏やかに撹拌しながら。
8. 再度、膜を洗浄し、発色する​​まで10〜20分間、5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルホスフェート/ P-ニトロブルーテトラゾリウムクロリド（BCIP / NBT）ホスファターゼ基質混合物中でインキュベートします。
9. 蒸留水のいくつかの変更で膜を洗浄することにより反応を停止します。

4.ドットブロット

1. 家畜およびマグロ5、及び鯨類及びシールのための1時25分：1：良好な信号を得るために適切な比率でPBST中の5％ウシ血清アルブミン（BSA）で筋肉上清（プロトコル1.1〜1.4）で希釈します。スポット膜上のサンプル5μlの。溶液をゆっくりそれを適用することで（通常は3〜4ミリメートルの直径）を貫通すること面積を最小限に抑えます。
2. 室温（ 例えば、<で膜を乾燥させ30~60分間の層流中/ EM>）、室温で1時間、ペトリ皿中のブロッキング溶液でそれをブロックし、PBSTでそれを洗浄します。
3. （1：10,000または腹水：1でハイブリドーマ上清からのモノクローナル抗体の5％ブロッキング溶液中に希釈10万）一次抗体で膜をインキュベートし、室温で1時間。
4. 使用PBST過剰な抗体を除去し、次いで二次抗体と一緒にインキュベートし、膜を5分間、3回ずつ洗浄する（1におけるアルカリホスファターゼ結合ヤギ抗マウスIgG：5％のブロッキング溶液中で1,250）を室温で1時間。
5. 再び膜を洗浄し、発色する​​まで10〜20分以内にBCIP / NBTホスファターゼ基質混合物でそれをインキュベートします。
6. 蒸留水のいくつかの変更で膜を洗浄することにより反応を停止します。

5.間接ELISA

1. 洗浄バッファー（0.02％Tween 20で0.002 Mイミダゾール緩衝生理食塩水）を準備します。洗濯でプレートを3回洗浄各次のステップ（プロトコル5.2から5.5）の間にバッファ。
2. コー​​ティング緩衝液中の筋肉上清（プロトコル1.1から1.4）の午前1時25希釈を準備します。一晩4℃で上清を希釈し、室温で1時間、緩衝液（PBS中1％BSA）でブロッキングを阻止する100μlのコート96ウェルELISAプレート。
3. 希釈した緩衝液を用いて精製されたmAbの2000希釈し、各ウェルに希釈されたmAbの100μlを添加する：1を準備します。室温で1時間静置します。
4. さらなるインキュベーションのため：（希釈緩衝液中に200倍希釈）、ヤギ抗マウスIgG西洋ワサビペルオキシダーゼとコンジュゲート追加します。
5. 各ウェルにペルオキシダーゼ基質を加える（100μl/ウェル）、10〜15分間インキュベートします。
6. 発色が観察されたときに（100μl/ウェル）ペルオキシダーゼ停止溶液により、酵素反応を停止させます。
7. マイクロプレート分光光度計を用いて450nmでの光学密度を読みます。

金コロイド標識mAbの6準備

注：金コロイド溶液と混合物の色は常に赤でなければなりません。黒色の沈殿物が注目されているときのpH、mAbの濃度、遠心分離速度を調整します。 6.1と6.2は、最適化のステップであるステップ。

1. 5-9からの様々なpH値を有する金コロイド溶液100μlにモノクローナル抗体（50μg/ mlの、3μl）を検出、精製を追加します。 2時間赤色を維持最小pHは至適pHとみなされます。注：この研究では、0.1 Mの炭酸カリウムをpH 8.0（至適pH）にコロイド金（40 nm）の溶液を調整するために使用しました。
2. pH8.0で金コロイド溶液100μlにモノクローナル抗体を検出精製の様々な量（500 / mlの、1から20μl）を追加します。注意：本研究における最適濃度は、6 / mlの（なし黒色の沈殿物）です。
3. 以上の結果によれば、精製された検出のmAb滴下コロイド金溶液を10mlの60μgのを加えます。 10分間、室温で穏やかに混合物を乳化します。広告D混合物にPBS中の5％BSA液（pH7.4）2mlのバックグラウンド干渉を減少させるために室温で15分間穏やかに乳化します。
4. 4℃で30分間万×gで混合物を遠心分離します。
5. 慎重に非結合抗体で上清を除去し、1％BSAおよび0.1％Tween 20を含む4ミリリットルPBSTで得られたペレットを懸濁し、遠心分離とサスペンションを数回繰り返します。
6. 1ミリリットルPBST中で、最終的な沈殿物を一時停止し、使用するまで4℃で保管してください。

免疫ストリップの7建設

注： 図1は、免疫ストリップ設計を示 ​​しています。 <（1年）、長期貯蔵寿命のために（20％相対湿度、低湿度の実験室環境条件でストリップを）>準備し、組み立てます。パッドと膜の寸法は、コンジュゲートパッド300ミリメートル×10ミリメートル、吸収パッド300ミリメートル×24ミリメートル、サンプルパッド300ミリメートル×24ミリメートル、NC膜のx 25ミリメートル300ミリメートル、300をペーストボードミリメートルは、80ミリメートルのxは。

1. コンジュゲートパッドを飽和させ、その後、組み立てる前に、37℃で1時間、それを乾燥させるためにマイクロピペットでステップ6.6から金コロイド標識MAb溶液を追加します。
2. ピペットまたはイムノプリンタを使用してNC膜上のmAbを検出するための制御ゾーンに特異的な抗原捕捉試験ゾーンでのmAb（500μgの/ ml）を、ウサギ抗マウスIgG（500μgの/ ml）を分配します。干渉を回避するために、2つのゾーン間の距離（> 5 mm）を維持します。
3. 両面テープでのペーストボード上の共役パッド、吸収パッドとNC膜を貼り付けます。
   注：約2mmによってNC膜の両側のパッドを重ねます。不適切なストリップ構造が不完全なテストになります。
4. コンジュゲートパッド（2ミリメートル）の上にサンプルパッドを配置し、ペーストボードに貼り付けます。
5. ペーパーカッター付き6ミリメートル幅のストリップを作成します。乾燥剤とアルミ箔袋にストリップをパックし、使用するまで4℃で保管してください。

8.交差反応性試験

1. 竹の棒を使用して、又はロッド研削1.5 mlの遠心チューブに1mlのPBS（0.1％BSAを含む）で生の筋肉試料0.03 gで均質化します。
2. テスト領域と反対側の端部によってストリップを持ち、5〜10分間、試験片にサンプルパッド部分を浸漬し、結果を直接観察します。
   1. オプション：500μlの上清を収集し、新しい遠心チューブに移します。
      注：ストリップが直接上清に浸漬されたときに信号が明らかでない場合は、このステップが示唆されました。
3. 三重で様々な筋肉のサンプルをテストします。
   注：ここでは、マグロ、鶏肉、シール、鯨類の15種と陸生哺乳類の5種をテストしました。
4. 5つの独立した検査官は、合計で575ストリップを使用し、 すなわち 、5回8.3を繰り返しています。

結果

モノクローナル抗体の特性

私たちは、鯨類のMBの、それぞれ2合成ペプチド（MKASEDLKKHGNTVLCとAIIHVLHSRHPAEFGC）を、認識2のIgG ₁モノクローナル抗体（CGF5H9とCSF1H13）を開発し、これらはクジラMbのを迅速に検出するためのサンドイッチ型金コロイドイムノクロマト法テストストリップを構築するために使用しました。 図2は CGF5H9はおおよそ17キロダルトンの予測分子量で、単一の染色バンドとして鯨類および他の哺乳動物を検出することを示しています。ミンククジラ（ ミンクacutorostrata）は、他のクジラ類のバンドよりも比較的暗いバンドを示しています。約50キロダルトンのバンドが豚のために観察されるのに対し、バンドは、マグロ、鶏やシールのために存在しません。豚やマグロのための複数の非特異的なバンドがありますが、それはおおよそ17 kの予想分子量のバンドとしての鯨類やアザラシにのみ反応するため、CSF1H13は、非...

ディスカッション

担体タンパク質にコンジュゲートした合成ペプチドを使用することにより、その同族タンパク質と比較して著しくより効果的です。 mAbは既知の相対位置を有するエピトープを使用して開発されているので、サンドイッチに基づく技術については、本研究では2 mAbは、標的抗原エピトープとの互いの相互作用を妨害する可能性はありません。また、天然のタンパク質との反応性及び合成ペプチドコンジュゲートで免疫したマウスの抗体は、天然タンパク質¹⁹から製造天然タンパク質と抗体との反応性よりも強いかもしれません。合成ペプチド複合体の使用は、したがって、効果的な免疫手順や適切な抗ペプチドモノクローナル抗体の生成のために推奨されます。

タンパク質の構造は、主にポリペプチド鎖中のアミノ酸の配列を含みます。各アミノ酸は、特定の特性をもたらす、その側鎖を有しており、わずかにアミノACIを変更しますD配列は、構造変化をもたらします。 10〜20アミノ酸長を有するペプチドは、抗体調製のための理想的であるので、C末端領域における合成ペプチド（免疫原）の長さは、コア抗原性領域が認識されることを確実にするために...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
リン酸緩衝生理食塩水	AMRESCO	J373
Protein G HP SpinTrap	ジェ Healthcare	28-9031-34	スピンカラム Protein G Sepharose
IsoStrip Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit	Roche	11493027001	Isotyping Strips, precoated with subclass- and light-chain-specific anti-mouse-Ig antibodies
Trans-Blot Bio-Blot	Bio-Rad	170-3935
Nitrocellulose membrane	Whatman	Z613630
抗体ブロッカーソリューション	LTK BioLaboratories		サンプル中の非特異的IgGの非特異的結合相互作用を最小限に抑えるには
BCIP/NBTホスファターゼ基質	KPL	50-81-00
タンパク質検出器HRPマイクロウェルキット、抗マウスKPL		54-62-18
Nunc免疫プレートMaxiSorp ELISAプレート	サーモ フィッシャーサイエンティフィック	EW-01928-08
マルチスカン EX ELISAリーダー	サーモ エレクトロン Corporation	51118170
金コロイド(40nm)溶液	REGAバイオテクノロジー株式会社		40-50 nmは、イムノストリップ、
ウシ、血清、アルブミン、	Gibco	15561-020
ラピッドテスト、イmmノストリッププリンター	、REGAバイオテクノロジー、株式会社に適しています。	アギスマート RP-1000	研究開発目的のイムノストリップの小規模生産にのみ適しています
ストリップコンポーネント(NCメンブレン、サンプルパッド(#33ガラス、S&S)、共役パッド(#16S、S&S)と吸収パッド(CF6、Whatman))	レガ・バイオテクノロジー(株)
フロイントアジュバントと不完全なフロイント'sアジュバント	Sigma-Aldrich	F5881、F5506	の油中水型エマルジョンの製造に使用されます
。		SDS-PAGE
			SDS-PAGE gels ロード前にタンパク質サンプルを希釈します。