リビングゼブラフィッシュ胚における細胞内構造のイメージング

サマリー

>jove_content<細胞小器官や他の細胞内構造の動的挙動をin vivoでイメージングすることで、生理学的および疾患的条件におけるそれらの機能を明らかにすることができます。ここでは、2つの細胞小器官(中心体とミトコンドリア)を遺伝的にタグ付けし、広視野顕微鏡と共焦点顕微鏡を使用して、生きたゼブラフィッシュの胚におけるそれらのダイナミクスをイメージングする方法を紹介します。

要約

In vivoイメージングは、自然な文脈での細胞および細胞内構造の動的挙動への前例のないアクセスを提供します。哺乳類などの高等脊椎動物でこのようなイメージング実験を行うには、一般に、研究対象のシステムへの外科的アクセスが必要です。ゼブラフィッシュの胚および幼生の光学的アクセス性により、このような侵襲的な手順を回避し、無傷の生物でのイメージングが可能になります。実際、ゼブラフィッシュは、増殖から移動、分化まで、幅広い発生状況でin vivo顕微鏡を使用して動的な細胞挙動を視覚化するための確立されたモデルとなっています。より最近の進展は、ミトコンドリアの輸送や中心体のダイナミクスなどの細胞内イベントを研究するためにゼブラフィッシュの使用が増加していることです。これらの細胞内構造を蛍光タンパク質によって遺伝的に標識することが比較的容易であること、およびそれらを画像化するための光学顕微鏡技術の使用により、ゼブラフィッシュは細胞生物学のin vivoモデルに変貌しています。ここでは、オルガネラを蛍光標識する遺伝的構築物を生成する方法について説明し、ミトコンドリアとセントロソームを具体例として強調します。私たちは、二者構成のGal4-UASシステムを複数の構成で使用して、発現を特定の細胞タイプに制限し、一過性に発現する安定したトランスジェニックフィッシュを生成するためのプロトコルを提供します。最後に、細胞内ダイナミクスのイメージングに最も適した光学顕微鏡法を選択するためのガイドラインを提供します。

概要

in vivoイメージングでは 、ほとんどの生理的な文脈における細胞の挙動の直接可視化を提供します。ゼブラフィッシュの胚の透明性、その迅速かつ外部の開発と蛍光標識を可能にする遺伝子ツールの豊富なアレイは、すべてのキーの発達のイベントのダイナミクスを解明するためにin vivoでの顕微鏡の利用拡大に貢献しています。ゼブラフィッシュにおける神経系の発達のイメージング研究では、例えば大幅に神経前駆細胞の挙動とそれに続く遊走、分化および回路の集積^1-8を含むそれらの子孫の運命の我々の知識を拡大しています。

ステージは、現在、これらの細胞の挙動の基礎となる細胞内動態を調査するために設定されています。確かに、ゼブラフィッシュは、既にin vivoでの細胞生物学のためのツールとして利用されています。ミトコンドリア^9-11を可視化できるようになりました^2,8,12-14を中心体、ゴルジ¹⁵、微小管⁴およびアクチン細胞骨格¹⁶は^、17エンドソームおよびin vivoでのゼブラフィッシュ胚における他の細胞内構造の中で^、1,18頂端膜の構成成分の複雑な。これまでのところ、これらの細胞小器官の機能について知られていることの多くは、培養細胞中で彼らの行動を研究から来ています。 in vitro試験は、細胞生物学に多大な洞察が得られているが、培養中の細胞は、完全にin vivoでの状況の複雑さを表すものではありませんので、必ずしも生体内での細胞内小器官の機能とダイナミクスを反映するものではありません。ゼブラフィッシュの胚は、細胞内ダイナミクスを調べるためにインビボ代替中の生存を提供しています。

脊椎動物としては、ゼブラフィッシュは、哺乳動物種に見られるものと相同であり、多くの器官系（ 例えば、神経網膜）を有します。さらに、ゼブラフィッシュの胚はますます人間の病気^19,20をモデル化するために使用されています、中心体の機能（ 例えば、小頭²¹およびレーバー先天性黒内障^22）とのミトコンドリア機能（ 例えば、パーキンソン病^{23は 、10,24}およびバルト症候群²⁵タウオパチー）に関連するものを含む。細胞および細胞下レベルでのin vivoイメージングこれらの例では、これらの病理学的状態の根底にある細胞生物学のより良い理解を可能にします。

ここに記載された方法の全体的な目標は、 インビボでの光学顕微鏡に用いゼブラフィッシュ胚における器官及び他の細胞内構造を調査するために総合的なガイドを提供することです。 in vivoでの細胞内構造を可視化し、追跡に関わる全体の作業の流れを説明する-遺伝的標識アプローチから、一時的に生成し発現させ、安定したトランスジェニック魚、そして最終的に広視野と共焦点顕微鏡を使用して画像化することに。これらのprocの各一方、eduresは、多数のゼブラフィッシュの研究室で使用されて、記載されているプロトコルは、最適化され、細胞内構造のダイナミクスを調査するための合理化されています。ここで説明する作業の2つの特定の側面は言及に値する：まず、遺伝的に複数の構成でのGal4-UAS発現系の使用は、特定の細胞型における細胞小器官にラベルを付けます。第二に、in vivoでの画像細胞内構造に広視野と共焦点顕微鏡の直接比較。

ゼブラフィッシュにおける遺伝的にラベル細胞小器官および他の細胞内構造への現在の戦略のいずれかにするプロモーター要素が直接融合タンパク質^9,14,15。 インビトロ転写キャッピングされたRNAの結果での発現を駆動するキャップされたmRNA ^1,4,8またはDNAに基づく構築物の使用しかし、組織特異的ではありません迅速かつ広範な表現、。キャップされたRNAは希釈または分解されるようにさらに、発現レベルは経時的に減少します。 RNAのこのように使用するベース開発の後の段階でオルガネラダイナミクスを調べるために構築する（通常は最大3日後に受精）制限されます。

これらの制限は、発現の空間的および時間的制御は、特定のプロモーターエレメントにより決定されるDNA構築物を使用することによって克服することができます。 DNAベースの構築物のGal4-UASシステムの文脈で使用される場合、導入遺伝子発現レベルに有意な改善が^26,27を観察しています。レポーター遺伝子は、Gal4の結合性上流活性化配列（UAS）の下流にクローニングされている間、この二部式システムでは、細胞型特異的プロモーターエレメントは、転写活性化因子GAL4の発現を駆動します。適切なGal4のドライバとUASレポーターを組み合わせることによって、発現が異なるプロモーターの後ろに特異的な発現パターンが所望されるたびに、レポーター遺伝子をクローニングする必要性を回避し、特定の細胞型に限定することができます。また、複数のUASレポーター遺伝子の発現をすることができ単一のGal4活性化因子によって駆動されます。 Gal4-UASシステムは、このように細胞内標識化のための汎用性と柔軟な遺伝的なアプローチを提供します。

広い視野と共焦点顕微鏡は、ほとんどの研究室の主力です。広視野システムは、典型的には、光源として、アークランプを使用して、光路の端部に配置されている敏感なカメラで放射された光を検出します。アウトオブフォーカスライトは、厚い試料での合焦情報を覆い隠すように、このイメージングモダリティは、典型的には、薄いサンプルに制限されています。共焦点顕微鏡は、彼らが焦点（ すなわち 、「光学切片^」）28のうち、発信するものの上に焦点面からの発信信号を優先するように構築されているという点で、広視野システムとは異なります。光学セクショニングを達成するために、ピンホールは、点光源に共役な位置に排出経路に配置されます。レーザーが光源として使用され、信号は、光電子増倍管（PMT）で検出されます。具体的には、レーザービームは、試料によってポイントツーポイント及び各スポット（ピクセル）での蛍光発光は、PMTによって検出さにわたって通されます。

ここでは画像の両方顕微鏡モダリティの直接比較を提供するために、広視野および共焦点顕微鏡法の両方を使用してゼブラフィッシュ胚生体において全く同じ細胞内構造。このような比較を提供する基礎となる目的は、手元の特定の質問に最も適切な顕微鏡技術を選択するためのガイドラインを提供することです。

ここで説明する手法を用いて、我々は、ミトコンドリアと中心体ののGal4 UASベースの遺伝的標識化を実証します。これらの細胞小器官は、各撮像モダリティの適合性を実証するために広視野共焦点顕微鏡を用いて、神経系の異なる細胞型内および筋肉細胞内に結像されます。ここで説明する方法は、容易に生きたゼブラフィッシュ胚における他の細胞小器官および細胞内構造を調査するために適合させることができます。

プロトコル

全ての動物実験は、バイエルン（ミュンヘン、ドイツ）の政府の地域の規則に従って行われました。

1.ラベリング細胞小器官およびその他の細胞内構造

注：ここでは 、遺伝的レポーターは、蛍光タグの中心体、ミトコンドリアおよび細胞膜が記載されていることを構築します。

1. 蛍光中心体とミトコンドリアを標識融合タンパク質を生成するために、従来のクローニング方法^29を使用してください。このようなcetn4-YFPを生成するために、黄色蛍光タンパク質などの蛍光タンパク質^2（FP）とインフレームゼブラフィッシュcentrin4（cetn4）のコード配列のクローンを作成します。このようなmitoCFP ^9-11を生成するためのシアン蛍光タンパク質としてインフレームFPとシトクロムcオキシダーゼのサブユニットVIIIのミトコンドリア標的配列を複製します。
2. zebrafの特定の細胞に（cetn4-YFPまたはmitoCFP）融合タンパク質の発現を制限するには風の胚（ 例えば 、ニューロンまたは筋細胞）は二部のGal4-UAS発現系^26,27を使用^しています。まずUASレポーター構築物を生成します。コイからのE1b基本プロモーター（Gal4の結合UASカセット（変異体は1倍から14倍UASの範囲、説明を参照^）26,27,30および最小プロモーターの下流に、UAS発現ベクターに融合タンパク質をクローニングするために、従来の方法を使用します遺伝子βアクチン）、およびUAS生成：cetn4-YFPとUAS：mitoCFPを。
   注：UASレポーターを準備するには、追加の要素をクローニングする必要がある安定したトランスジェニック株の生成のための構築（下記3を参照してください）
3. 中心体やミトコンドリアが標識された細胞の状況を可視化するために、生成UASリポーターは、細胞膜をのFPによって標識された構築物。細胞膜^{（memFP）31,32}にそのFPを標的とするためにFPとインフレーム（パルミトイル化部位を含む）ゼブラフィッシュGAP43の最初の20アミノ酸を複製します。
4. Obtain個のドライバの構築物またはトランスジェニック株は、細胞型特異的プロモーターエレメントは、転写活性化因子のGal4-VP16 ^{27、Gal4FF 33}またはKalTA4 ³⁰の発現を駆動します。
5. UASリポーターが（ニューロンまたは筋細胞において、例えば ）は、対象の所望の細胞型に式を制限するために適切なドライバ構築物を用いて構築組み合わせます。この共同注入Gal4ドライバーとUASレポーターは受精卵の1細胞期で構築を行うために一時的に魚を表現生成する（詳細な手順については、下記の2を参照します）。別の方法として、（詳細な手順は、以下の3を参照）UASリポーター安定したトランスジェニック系統を生成し、両方の導入遺伝子を保有する子孫を生成するために、Gal4ドライバー安定したトランスジェニック系統に渡ります。
   注：Gal4ドライバー安定したトランスジェニック系統からの受精卵にUASレポーター構築/秒を注入することも可能であるか、Gal4ドライバーがfertilizに構築UASリポーター安定したトランスジェニック系統から卵を編。
6. A.の複数の、独立したUASのレポーター構築物（ 例えば、UAS：mitoCFPとUAS：memYFPの共同のGal4-UASシステムを使用して、複数の異なる融合タンパク質を共発現するには、次のいずれかの構成でGal4ドライバーとUASレポーター/をsの使用Gal4ドライバーコンストラクトで^{-injected）10、}単一のレポーター上のB.複数のUASカセット（ 例えば^{、UAS：cetn4-YFP、UAS：memCerulean）12} C.双方向UASレポーター（ 例えば ^{UAS：memYFP、mitoCFP）2,10,24（} 図1）。

Gal4-UASシステムを使用して、図1の戦略に共発現する融合タンパク質。
複数の融合タンパク質の共発現は、様々な構成でUASレポーターカセットを使用することによって達成することができる：（a）複数の別個のUAS-駆動定数ructs、（B）は、単一の構築物または（C）単一の構築物上の双方向UASカセット上の複数のUASカセット。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

2.魚を表現一過生成

注：以下は、以前に公開されたプロトコル^34,35の適応です。基本噴射セットアップは、12倍の倍率範囲を上にして実体顕微鏡、マイクロピペットホルダーと空気圧源とマイクロマニピュレーターを含める必要があります。時間の2.1から2.5前方を準備します。

1. 卵の微量注入チャンバーを準備するために、水中の1.5％（w / v）のアガロースの溶液を調製します。アガロースが完全に溶解するまで水と電子レンジにアガロース粉末を追加します。この溶液をシャーレ（100×15 mm）を入力します。
   1. アガロース溶液はAPPRまで冷却しますoximately ^45°Cの 、溶融アガロースの表面に（6×50ミリメートル1.5ミリメートルの深さ1mm、幅で、3ミリメートル離間長い尾根で、40ミリメートルX 66ミリメートル）プラスチック製のマイクロインジェクション金型を配置することに注意しないように取る前に界面に気泡を導入します。
   2. アガロースセットした後、4 ^O CO / Nで保存。慎重にスパチュラを用いて金型を削除します。 4 ^{O C}で、一度店を複数のマイクロインジェクション室を準備し、数週間にわたって繰り返し使用します。
2. 長いシャンク³⁶とガラス注入毛細血管を生成するために、マイクロピペットプラーを使用してください。
   注：注射キャピラリーを生成するために使用される特定の設定は、経験的に決定されるべきです。注射キャピラリーを事前に引っ張られ、使用前に保存することができます。
3. 製造元のマニュアルに従って、分光光度計を用いてマイクロインジェクション用のプラスミドDNA（Gal4ドライバーとUASのレポーター構築物）の濃度を測定します。メジャー60; 260 nmでの吸光度の比および280nm（A260 / 280）。ヌクレアーゼフリー水で100 ngの/μlの最終濃度にDNAを希釈します。
   注：〜1.8のA260 / 280比は純粋なDNAを意味します。注射のために使用されるプラスミドDNAを精製し（シリカベースの結合行列に基づく）は、市販のキットを使用して検討。プラスミドDNAは、毒性を防止するために、高品質のものでなければなりません。
4. 、（30X株式の0.33μl）を、Danieauのソリューション（5 ngの/μlの20の最終濃度を100ng /μlの株式の0.5〜2.5μl）をDNAを組み合わせることにより、フェノールレッド（0.25μLを10μlの注入ミックスを準備します10μlの全体積に対するオプション）およびヌクレアーゼフリー水。
   注：経験的に適切な発現をもたらすDNAの濃度を決定します。 Gal4ドライバーとUASレポータープラスミドを共注入する必要があります。 Gal4ドライバーまたはUASリポータープラスミドのみが野生型受精卵にインジェクションされた際には式が続いて起こるません。ただしトン彼は卵が1つまたはいくつかのUASレポータープラスミドで十分の注入後、Gal4ドライバーラインからのものである受精しました。逆に、UASレポーターラインにマイクロインジェクションする場合は、唯一のGal4ドライバープラスミドを注入する必要があります。フェノールレッドが大幅に注射を可視化するために助けることができるしながら最後に、それはまた、蛍光化合物そのものです。それは十分にこの時間によって希釈されないことがありますようにイメージングは​​24時間後に受精（HPF）の前に計画されている場合そのため、フェノールレッドは、可視化のFPを不明瞭でした。
5. 注射が予定されている前の晩は、繁殖用のオスとメスのゼブラフィッシュのいくつかのペア（典型的には5〜10）を設定します。オスとメスの魚を分離するためにグリッド底を含有する挿入と取り外し可能な分周器で飼育タンクを使用してください。
   注：男性と女性のゼブラフィッシュは、一般的に自分の体の形状によって区別することができます。女性は腹側に突出した腹部を示す傾向がある一方で男性は細身になる傾向があります。男性はさらに、黄色がかった赤のcolを持っている傾向があります自分の腹側腹部領域に論理和。
6. DNA注射の直前に、オスとメスが交尾できるようにするために仕切りを取り外します。分周器を除去した後、約15〜30分、タンクの底に卵を確認してください。新しい繁殖タンクに釣りネットを使用して成魚を転送します。
7. ふるいに飼育槽のうち、新たに敷設受精卵を含む、水を注ぐ（ 例えば、プラスチック製ティーストレーナー）。 Danieauの溶液を含むスプレーボトルを使用してふるいに卵を洗います。 （成魚の繁殖ペア当たり、通常、50〜200個の卵）ペトリ皿にふるいを反転し、すべての卵を回収するためにDanieauの溶液でスプレーボトルを使用します。
8. microloaderピペットを用いて、DNA注入ミックスで引っ張っインジェクションキャピラリをバックフィル。 PEことができますマイクロピペットを作成するために鉗子を使用して、実体顕微鏡の視覚的な制御の下で、マイクロマニピュレータのホルダーに注入キャピラリーをマウントチップをトリムDNAの適切な量を提供することを可能としながら、絨毛膜と細胞質をnetrate。
   注：注入キャピラリーの先端がトリミングされる程度は、経験的に決定されるべきであり、卵を注入したときに最も良く判定することができます。
9. 注射のためのDNAの量を決定するために、鉱物油への注入溶液の液滴を吐出します。キャリブレーションマイクロメーターを使用して、ドロップの半径（r）を測定し、その体積（4/3πrの^3）を計算^します。射出圧力および/または各噴射パルスの持続時間を調整することにより、音量を調節します。
10. プラスチックピペットを用いて、マイクロインジェクション室の溝の中に収集されたすべての卵（典型的には50-200、上記2.7から）を転送します。実体顕微鏡の視覚的な制御下で、細胞質（透明）と卵黄（密な、非透明）を容易に識別できるように卵を配向させるために鉗子を使用しています。
11. ステレオの視覚的な制御の下顕微鏡は、注入量は、（1 NL 2）細胞の容積の約10％に相当することを確実にするために注意しながら、受精卵の細胞質にDNAを注入します。
    注：注入量の可視化におけるDNA溶液補助でフェノールレッド。
12. 注入後、Danieauの溶液を含むスプレーボトルでそれらをフラッシュすることにより、射出成形金型の溝から卵を緩めます。その後プラスチックトランスファーピペットを用いて、新鮮なペトリ皿に卵を転送し^{、28.5°Cの}インキュベーター内で維持します。
13. 注射はマイクロピペットの浸透やDNA混合物中に持続的な物理的損傷の結果として、高い死亡率に寄与するかどうかを判断するためのコントロールとして非注入卵を維持します。
    注：注射を次の高死亡率が高すぎDNA濃度や注入体積および/ ​​またはcontaminaを有するプラスミドを含む多数の要因になり得ますNTS。低品質のDNA調​​製物からの毒性を防止するために、（シリカベースの結合行列に基づいて）市販のキットを使用することができます。
14. 注射後、定期的に、未受精卵とデッドまたは不正な胚をスクリーニングし、これらを廃棄するために実体顕微鏡を使用しています。
    注：未受精卵のように、数時間受精後1細胞期であるように見える卵と認めます。このような妥協前後体軸として肉眼解剖学的欠陥によって不正な胚を特定します。絨毛膜内のアモルファス材料は、胚が発育段階を経て進行し、死亡しなかったことを示唆しています。マイクロインジェクションした胚は、開発の通常の過程を受けるかどうかを確認するには、解剖学的ア ​​トラス^37を参照^してください。
15. 色素形成を防ぐために、10と24の間にHPF 1X 1-フェニル-2-チオ尿素（1xPTU）を含むDanieauの溶液に、プラスチック製のトランスファーピペットを用いて胚を移します。 Danieauのソリューションの続きで胚を維持します実験期間中PTUをaining。
    注：メラニン保有細胞に加えて、皮膚の表面上の虹色素胞は、イメージングのために問題となる可能性があります。 PTUは、虹色素胞の形成を阻害しないが、そのようなロイ・オービソン（ロイ）のような虹色素胞の減少した番号の突然変異系統が存在し^、38を使用することができます。
16. （通常は第二または第三日目受精後、2または3 DPFに）胚の孵化後、絨毛膜を破棄し、PTUを含むDanieauのソリューションを交換します。
    注：これらの手順は、胚培地の品質と健康の胚の生存性を確保することが重要です。

3.安定したトランスジェニック系統を生成します

注：安定なトランスジェニック系統を効率的Tol2のトランスポゾンシステムを用いて生成することができます。目的の導入遺伝子を含むTol2のトランスポゾンベクターは、mRNAが受精にトランスポザーゼ酵素をコードするとともに同時注入され、1細胞期でD卵。注入されたmRNA由来のトランスポザーゼタンパク質は、トランスポゾンベクターおよびゲノム³⁹への統合から導入遺伝子カセットの切除を触媒します。

1. 導入遺伝子レポーターカセットのクローンを作成する（ 例えば、UAS：mitoCFP）Tol2の間には^40を説明したように、現在、ゼブラフィッシュのコミュニティで使用されるのTol2ベクターのいずれかで逆方向末端反復を。
   注記：プロモーター要素は、関心領域に無関係の器官系におけるFPの発現を駆動する選択カセットを含むTol2のベクター（ 例えば、心臓⁴¹又はレンズ^42）のGal4のトランス活性化の非存在下でのUASレポータートランスジェニック系統をスクリーニングするために有用です。
2. （シリカベースの結合行列に基づいて）市販のキットを用いて、注射のために使用されるプラスミドDNAを精製します。プラスミドDNAは、毒性を防止するために、高品質であることを確認してください。
3. 使用してTol2のトランスポザーゼをコードするmRNAを転写このようなPCS-TP ⁴³のような適切な転写ベクター。簡単に言えば、PCS-TPを線形化し、蓋をしてmRNAを生成し、製造業者のプロトコルに従うように、市販のキットを使用します。 （RNアーゼフリーのピペットチップやチューブを使用し、例えば ）のRNaseの混入を避けるように注意してください。 C. ^O -80でシングルユースや店舗のために、100 ngの/μlの濃度で、RNAを等分
4. 注射の朝、氷の上でトランスポゼースmRNAのアリコートを解凍。トランスポゾンDNAベクター（100 ngの/μlに2μl）を混合し、1中のmRNA（100 ngの/μlに2μl）をトランスポザーゼ：1の比率、および10μLする全量をRNaseフリー水の6μlを添加します。
   注：20 ngの/μlの濃度は、それぞれに推奨されますが、最適濃度は、経験的に決定されるべきです。希釈にRNaseフリー水を使用してください。 Mの劣化を防止するために、DNA-RNA注入ミックスを取り扱う際の手袋を使用して注射の全期間氷上に保ちますRNA。
5. 上記のセクション2に詳細な手順を使用して、1細胞期で受精卵にDNA-RNA注入ミックスを注入します。実体顕微鏡の視覚的な制御下で遺伝子導入効率の最も高いレートのための1細胞期での細胞の細胞質を標的とします。導入遺伝子の発現をスクリーニングするための準備ができるまで^28.5°Cので注入された胚を維持します。
   注：以前に^44を説明したように、PCRはTol2のトランスポザーゼの効率を確認するために行うことができます。
6. 蛍光解剖顕微鏡の接眼レンズを用いて、遺伝子導入のためのペトリ皿の画面胚。
   注：2または3 DPFで選択可能なカセット（心臓やレンズ内すなわち、蛍光）のFP発現を可視化するために、顕微鏡の適切なフィルターセットを使用してください。 （心臓やレンズ内）の発現によって潜在的なトランスジェニック胚を特定し、成人期にこれらの胚を上げる（F ₀世代）を使用して、標準プロトコル^45。また^、46で説明したように、PCRによって潜在的なトランスジェニック胚を識別します。
7. F ₁世代を確立するために卵を取得する非トランスジェニック野生型魚に（詳細は2.5を参照）、それらを横断、生後3ヶ月- UASリポーターF ₀魚たら2.5です。また、F ₁世代を確立するために、Gal4ドライバーラインにUASリポーターF ₀魚を渡ります。後者の場合には、UAS-駆動導入遺伝子を直接交雑から得られた胚で監視することができます。
8. 導入遺伝子または選択可能なカセットの発現のためにF ₁胚を選別するために、蛍光解剖顕微鏡を使用してください。
   注：発現が確認された場合、その後、導入遺伝子を生殖系列に送信されるといえます。遺伝子組換えは、F ₀の段階で非メンデルです。導入遺伝子を発現する胚の数は、個々のclutcheに少数から大半に異なる場合があります秒。異なるF ₀魚類のトランスポゾン統合は異なる発現パターンで、その結果、大幅に異なる場合があります。したがって、別々のサブ線のように異なるF ₀創始者からF ₁魚を維持します。 F ₁魚におけるトランスポゾン統合が安定であり、メンデルの法則に次の世代に渡されます。
9. 導入遺伝子のキャリアを再識別するために、別のタンク内の各F ₀魚を維持します。

4.正立顕微鏡のイメージングのための胚を準備します

注：ここで説明する手順は、長作動距離水浸漬コーン目標に直立顕微鏡のイメージングのために最適化されています。

1. 導入遺伝子発現のための胚をスクリーニングするために、蛍光解剖顕微鏡を使用してください。
   注：UASレポーター導入遺伝子の発現は、使用される特定のGal4ドライバーラインに依存します。希望のexpに基づいて、撮像実験のための胚を選択ressionパターン。
2. 1×PTUとの1xトリカインとDanieauのバッファを含む別のペトリ皿にプラスチック製のピペットを使用して、選択した胚を転送します。
   注：標識は（器官系における唯一の少数の細胞）アガロースで胚をマウントまばらである場合（4.3参照-下記4.7）高倍率の目標と広視野顕微鏡を使用して、導入遺伝子発現のために、画面を（下記5.1を参照）。トリカインは魚をanesthetizesし​​、秒以内に有効なはずです。魚が固定化されていない場合には、トリカインが劣化している可能性があります。この分解のために考えられる理由は^、47感光性であるトリカインの悪い記憶を、含まれています。
3. 0.7％の最終濃度までDanieauのバッファに低融点アガロース粉末を溶解することにより、魚を埋め込むアガロースを準備します。アリコート（1ミリリットル）と使用する準備ができるまで40℃のヒートブロックに保ちます。
   注：高等concentrat（1.5％点で最大）アガロースのイオンも魚を埋め込むために使用することができます。
4. 低融点アガロース1mlのアリコートにトリカインの20×ストックとPTUの50倍ストック溶液20μlを50μlを加え、チューブの側面をタップしてよく混ぜます。ヒートブロックにチューブを返します。プラスチック製トランスファーピペットを使用して、穏やかにアガロースを希釈回避するためにできるだけ少ない液体を移送、アガロース、いくつかの（1-10）麻酔胚をピペット。
5. プラスチックピペット転送ガラスボトムシャーレにアガロース少量のすべての胚を使用。
6. 比較的高速作業、画像化される構造に応じて、所望の向きに胚を配置するために鉗子を使用しています。
   注：自分側のオリエント胚網膜またはRohon-ビアード（RB）感覚ニューロンは、画像化されるべきか。
7. アガロースは、少なくとも15分間固化することができます。 agaroに埋め込まれた胚をカバーするために1xPTUと1xTricaineを含むDanieauのバッファを追加します。SE。画像への準備が整うまで^28.5°Cのインキュベーターにアガロース埋め込 ​​まれた胚を含む皿を置きます。

5.イメージング細胞と細胞内構造広視野または共焦点顕微鏡を用いて、

注：広視野顕微鏡とポイントスキャン共焦点顕微鏡画像に最も広く使用されている様式は、蛍光ゼブラフィッシュ胚のラベルが付いています。表1は 、両方のシステムの主な利点と欠点をまとめました。上記4に記載したように顕微鏡の両方の形態のために、胚をアガロースに搭載され、顕微鏡のステージ上の加熱室を使用して画像化実験を通して28.5 ^O℃に維持しました。温度変動は、z次元のドリフトを引き起こす等の撮像を開始する前に重要なことは、アガロース包埋の胚と皿を^28.5°Cのに平衡化させます。長期的なイメージング実験を行う場合（Severaのオーバーリットル時間）、バッファの蒸発を減らすためにペトリ皿の上にプレキシガラスのカバーを置きます。

	広視野の	点走査型共焦点
コスト	比較的安価	高価（約5倍以上）
光退色	ロー	高い。サンプルは、焦点面の上下にレーザー光に暴露されます。
フォト毒性	ロー	ハイ（上記写真漂白を参照してください）
取得速度	ファスト	スロー
XYの分解能	アッベの法則	アッベの法則は、（アプリケーションによって改善することができる40％の非常に小さなピンホールを使用して、しかし、中ほとんどの設定これは）少し実用的なアプリケーションを持っています
光学切片	貧しいです	はい（ピンホールサイズによって調整することができます）
組織透過性	表面的な構造に限定される（ 例えば 、Rohon-ビアード細胞や筋線維）	胚の表面から<100ミリメートルに限定

広視野の表1.一般的な比較とポイントスキャン共焦点顕微鏡

1. 広視野顕微鏡
   注記：ここではガイドラインは長い作動距離水浸漬コーン目標と直立広視野顕微鏡を使用してゼブラフィッシュ胚を撮像するために設けられています。顕微鏡は、冷却CCDカメラを装備した、異なるフルオロフォアを可視化するためのフィルターセットは、複数のチャネルの迅速な取得のための自動化されたフィルタホイールに取り付けられています。画像取得はマイクロマネージャー、オープンソース顕微鏡ソフトウェアパッケージ⁴⁸によって制御されます。 RB感覚ニューロンにおけるミトコンドリアを撮像するための具体的な例が提供されます。 RB細胞を遺伝子操作した膜を用いて標識されている（上記1.1を参照）YFPを対象とし、それらのミトコンドリアは、CFP-タグ付けされます。
   1. 低融点で彼らの側にマウント胚は、アガロース、上記4に記載されているように。
   2. 取り付けられた魚料理は撮影を開始する前に顕微鏡のステージ上で加熱室に^28.5°Cのに平衡化することを可能にします。
   3. 低倍率水浸漬コーン目的を使用して、画像への胚の表面上の領域を選択するために、顕微鏡の接眼レンズに目を通します。
      注：安定したトランスジェニックMitoFishレポーターラインの場合、Tgは（UAS-の^{E1b：mYFP、mitoCFP）mde6、}などユックなどのドライバーラインと組み合わせて使用されます。Gal4の後、ほとんどのRBニューロンが標識されている、そして緻密なMESとして表示されます胚の表面上の神経突起アーバーのH-仕事。 DNAのマイクロインジェクションは、構築した場合は（感覚例えば、MA-YFP：UASとのGal4-VP16：mitoCFPとUAS）疎ラベリング達成するために使用される二重標識細胞を同定するために、画面の胚を。
   4. 顕微鏡ソフトウェア（マイクロマネージャー1.4）を開き、カメラの設定」の下に。関心（現在例えばYFPまたはCFP）の波長のための正しいフィルタセットを定義するには、「構成設定」の下にイルミネーション ''」をクリックして「露光時間を入力します適切な画像を取得するために必要。
      注：「イルミネーション設定」は、ソフトウェアのインストール時にユーザによって予め設定されており、マイクロマネージャーを開くときにロードされます。ソフトウェアは、フィルタホイールを制御するように構成されていない場合は、手動で適切な位置にタレットにフィルターホイールを移動させます。
   5. 40-100x倍率に至るまでの長作動距離水浸漬コーン目的に変更します。選択します最も高い開口数（NA）を有し、色彩補正して対物レンズ（アポクロマート）。
   6. ビューのフィールドを選択するには、「ライブ」をクリックして：RBニューロンの場合には、幹軸索の画像ミトコンドリアの輸送を、細胞体から、または末梢アーバーに発します。
      注：胚の尾鰭倍でRBニューロンの周辺アーバは、画像に平坦であり、従って、広視野顕微鏡を備えた単一のフレームに取り込むことができる広い視野を理想的な機会を提供します。尾びれ倍はペトリ皿の底に平行になるように、きっぱりとその側にできるだけ胚をマウントすることが重要です。
   7. 視野を選択した後、ImageJのメニューで「長方形の選択」ボタンをクリックして関心領域（ROI）を定義し、マイクロマネージャーウィンドウで「ROI」をクリックしてください。イメージングのためのROIを選択した後、TAに「停止」と「保存」をクリックkeはYFPチャンネルの画像は、神経突起/秒のローカル形態を記録します。
   8. 画像ミトコンドリア輸送に上にクリックし、「マルチD ACQ。」ボタン。追加のウィンドウ（「多次元買収」）を観察し、時間ポイントの数だけでなく、このウィンドウの時点の間の間隔を選択します。 0.3から1ヘルツのフレームレートを使用してください。できるだけ多くのデータポイントを収集するために、少なくとも10分間の記録を行います。
   9. 「多次元取得」ウィンドウでは、撮像用の波長（この例では、ミトコンドリアのためのCFP）と露出の時間を追加して定義し、「チャンネル」をクリックしてください。ミトコンドリアの輸送を画像化するために400ミリ秒以下に露光時間をおいてください。
   10. 自動的に「Directoryのルート」で概説した特定のフォルダ内のファイルを保存するには、オプションの「多次元取得」ウィンドウで「画像を保存」をクリックします。ティムを開始するには右上の「獲得」をクリックします。電子タイムラプスイメージング。
   11. タイムラプス撮影は、z次元における任意のドリフトを補償するためにしながら、手動でピントを合わせ直します。
       注：RBニューロンにおけるミトコンドリアの輸送は限り4として時間画像化することができるこれらのパラメータを使用しました。
2. 共焦点顕微鏡検査
   注：ここでのガイドラインは直立オリンパスFV1000共焦点顕微鏡と長い作動距離の水浸漬コーン目標に撮影するために設けられています。顕微鏡は、複数のレーザラインとマルチチャンネルイメージングを可能にするいくつかの検出器（従来​​のPMTとより敏感ガリウム砒素リン検出器）を備えています。具体的な基準は、オリンパスFLUOVIEWソフトウェアになされます。しかし、ここで説明した撮像パラメータは、他の共焦点システムに容易に譲渡する必要があります。
   1. 低融点上記4に記載されているように、画像化される臓器/構造のための適切な向きにアガロースでマウント胚。
   2. 取り付けられた魚料理は撮影を開始する前に顕微鏡のステージ上で加熱室に^28.5°Cのに平衡状態にします。
   3. 直立構成では、共焦点顕微鏡用長作動距離水浸漬コーン目標を使用します。収集できる蛍光シグナルの量を最大化し、最高の解像力を持つようにNA可能な限り高いと目的を選択してください。複数のチャネルから収集した画像は、色彩補正後の目標（アポクロマート）を選択します。
   4. 顕微鏡のソフトウェアを開いて、顕微鏡の接眼レンズを介して、関心領域を識別するために、それぞれのいずれかの送信または蛍光光を使用する「トランスランプ」または「エピランプ」をクリックしてください。
   5. 画像スタックを取得するには、以下のスキャンパラメータを設定するためのソフトウェアを使用します。
      1. 「取得の設定」ウィンドウで、イメージングのために選択された目的は、ドロップダウに表示される目的と一致していることを確認使用可能な目標のn個のメニュー。
         注：これは、特定の目的（ 例えば、横方向及び軸方向の分解能、共焦点絞り等のサイズ）のための任意の事前計算されたパラメータがtrue保持し、確実に使用できることを確実にするためです。
      2. 画像の特定の蛍光タンパク質（複数可）に、適切なレーザーライン/ sであり、励起および発光ダイクロイックフィルタを選択します。 「画像取得制御」画面で「染料リスト」ボタンをクリックすることでこれを行い、適切なフルオロフォア/秒を選択します。代わりに、手動でこれらのパラメータを設定するには、「光パスと染料」ボタンをクリックします。
         注：「染料リスト」ボタンオプションを選択すると、ソフトウェアは自動的に適切なレーザ線、励起および発光のダイクロイックフィルタを選択し、適切に共焦点開口部の大きさを調整します。
      3. 「取得設定」ウィンドウで、「ズーム」因子と「サイズASPを調整構造が撮像されている最高の解決に必要なピクセルサイズを得るために、スキャン画像のECT比」（ すなわち 、512×512、1024×1024など）。これにより、ナイキストサンプリング基準以下、目的の約半分の理論的な解像度であることが、画素のサイズを設定します。「画像取得制御」ウィンドウ内の情報のための記号（「I」）でボタンを取得された画像のクリックのピクセルサイズを決定するために。
      4. 「取得の設定」ウィンドウで最速可能（2マイクロ秒/ピクセル）のスキャン速度を設定します。
      5. 3に2のnoise.A率を減らすために平均化カルマンライン上の「画像取得制御」画面のクリックが通常で十分では。
      6. スペクトルを重ねてフルオロフォアを撮像する場合、シーケンシャルスキャンモードを選択します。これを行うには、「画像取得制御」ウィンドウで「順次」と「ライン」をクリックしてください。
      7. 典型的には、（該当するレーザーライン/秒の電力出力を調整します5％以下）。具体的な値は、経験的に決定する必要があります。
      8. 各チャンネルの検出器の設定を調整しながら継続的に選択した領域をスキャンするために、「X4フォーカス "ボタンを" XYがリピート」または「フォーカス×2」またはをクリックしてください。 「HV」、「ゲイン」を調整し、グレー値の最も高いダイナミックレンジを有する画像を取得するために、各チャネルは、「オフセット」。
         注：これらの設定のための具体的な値は、経験的に決定する必要があります。 「HV」は、その感度を変更する「オフセ​​ット」する検出器の電圧を調整する検出器の出力信号を調整し、「ゲイン」は定数係数で、検出器の出力信号を乗算します。
      9. 下飽和識別するルックアップテーブル（ヒロ）を介して取得した画像を可視化（青く見える）と、一般的には避けるべきである、どちらも過飽和ピクセル（赤表示されます）、するCtrlキーを押しながらH。関連するレーザー林のパワー出力を再評価しますE / Sと検出器の設定。
         注：高いレーザパワーと検出器の「HV」の高レベルを使用して複数の信号をもたらします。高いレーザーパワーは、しかし、増加した漂白および光毒性につながります。 「HV」を大きくすると、ノイズの増加につながります。したがって、妥協点は、レーザパワーと光損傷を防止しつつ、ノイズの許容可能なレベルを有する画像を取得するための「HV」を設定するときに発見される必要がある（ 表1参照 ）。
      10. 関心領域の上限と下限に着目して定義されたボリュームから画像を収集します。 「終了セット」と「スタートセット」に「取得設定」ウィンドウをクリックで画像化するボリュームの上限と下限でzスタックウィンドウのボタンが表示されます。与えられた目的のためのz解像度の半分であるステップサイズを選択し（ 例えば 、zの解像度が2μmが1μmを選択した場合）。 objectivのz解像度を決定するために、e」の画像取得制御」ウィンドウ内の情報のための記号（「I」）でボタンをクリックします。
      11. 画像化される細胞内構造のダイナミクスに適した時間周波数でのzスタックを収集するために、時系列を設定します。 「TimeScan「サブウィンドウでのzスタックが取得すべき頻度を入力します（「間隔」 '）と回数のイメージ（「民」）を取得する必要があります。
      12. zスタックおよび時系列が取得されることを確認するために、「画像取得制御」ウィンドウの「深さ」と「時間」のボタンをクリックします。最後に、タイムラプス画像の収集を開始するために「XYZT」ボタンをクリックします。
      13. 画像取得が完了した後、ソフトウェアのインターフェイス上で「完了シリーズ」を観察します。それをクリックすると、それらに関連する画像やメタデータを記録するために「OIB」形式で画像を保存します。
          注：上で得られた画像広視野顕微鏡及び共焦点顕微鏡は、可視化などフィジー、フリーパブリックドメイン画像処理プログラムなどのソフトウェアを用いて分析することができます。

結果

ここでは、広い視野と画像ミトコンドリアおよびゼブラフィッシュの胚を生きている中で中心体への共焦点顕微鏡の使用は、直接比較と対照的です。オルガネラダイナミクスが検討されるべき細胞の位置および特定の細胞内イベントの固有振動数に応じて、一般的に広視野または共焦点顕微鏡のいずれかがより良い選択です。我々は、胚の表面上に配置さRBニューロンに深く位置する網膜細胞内小器官を画像化しました。一緒に彼らの2次元形状を有するRBニューロンの表面的な場所は、それら広視野と共焦点顕微鏡（ 図 2）の両方で撮像されるための良い候補となります。共焦点顕微鏡を用いて取得した画像は、しかし、かなり遅く、特定の細胞内イベント（ミトコンドリアの例えば、運動、 図2C、Dのダイナミクスの過小評価につながることができます）。組織の大量の蛍光信号を焦点面に詳細を不明瞭として広視野顕微鏡によって取得された網膜細胞の画像が悪いコントラス...

ディスカッション

ここでは、蛍光タグミトコンドリア、中心体とゼブラフィッシュ胚のin vivoで特定の細胞型の細胞膜へのGal4-UAS発現系の汎用性を実証します。他の細胞小器官または細胞内構造を標識する多数の蛍光融合タンパク質は、公表された文献に見出すことができ、それぞれの実験室、商業的供給源または非商業的なプラスミド寄託（ 例えば、Addgene）から得ることができます。新しい蛍光融合タンパク質を設計するために、いくつかのパラメータは、FPを使用すると、目的のタンパク質のアミノまたはカルボキシ末端にFPを融合させるかどうかを含めて、考慮される必要があります。蛍光融合タンパク質を生成についてより徹底した議論について、読者は、被験者^49-51についての詳細な記事と呼ばれています。

私たちは、UAS-駆動導入遺伝子を用いた融合タンパク質の共発現を達成するための3つの戦略を強調表示します。複数、separat電子UASレポーター構築物は異なる既存のレポーターを組み合わせることを可能にするには、追加のクローニングを必要とせずに構築...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
アガロース(2-ヒドロキシエチルアガロース)	Sigma-Aldrich	A4018-10G	低ゲル化温度 Type VII
ブロックヒーター	エッペンドルフ		サーモミキサー コンパクト
Ca(NO3)2 硝酸カルシウム水和物、99.996%	Aldrich	202967-50g	30x Danieauの
CCDカメラ	Qimaging	Retiga Exi Fast 1394
セラミックコーティング デュモン #5 鉗子	デュモン - ファインサイエンスツール	11252-50	#5 鉗子
共焦点レーザー走査顕微鏡	オリンパス	FV1000 Fluoview
培養皿ヒーター	ワーナーインスツルメンツコーポレーション	DH-35	加熱リング
エチル 3-アミノ安息香酸 メタン硫酸塩	PharmaQ	トリカイン PharmaQ-25g	トリカイン(麻酔薬)
蛍光解剖顕微鏡	ライカ	M205 FA
GeneClean kit	MP Biomedicals	111001200
ガラス底 培養皿	MatTek Corporation	P35G-0-14-C	35 mm シャーレ、14 mm マイクロウェル、No. 0 カバーガラス
ガラス針	ワールド・プレシジョン・インスツルメンツ株式会社	TW100F-4	インジェクション用
HEPES	シグマ	H3375-250g30x	ダニオー
の高真空グリース	ウコーニング	DCC000001242 150g	二酸化ケイ素グリース
KCl 99%	Sigma-Aldrich	S7643-5kg	30x Danieau
の MgSO4.7H2O   硫酸マグネシウム七水和物98 +%A.C.S試薬	Sigma-Aldrich	230291-500g	30x Danieauの
マイクロインジェクターを準備するには	Eppendorf		FemtoJet
マイクロローダーチップ	Eppendorf	930001007	0.5-20 ul
マイクロマニピュレーター	Maerzhaeuser Wetzlar	MM33 Rechts/00-42-101-0000/M3301R
マイクロピペットホルダー	Intracel	P/N 50-00XX-130-1
mMESSAGE mMACHINE SP6 転写キット	Ambion	AM1340	PCS-Transposase
NaCl BioXtra >99.5%	Sigma-Aldrich	P9541-1kg	30倍を準備するには ダニオー
のナノフォトメーター			DNA / RNA濃度を測定するには
ニードルプーラー	サッター機器	P-1000	フレーミング/ブラウン
NIR Apo 40x/0.80W	ニコン		ウォーターディッピングコーン対物レンズ
N-フェニルチオ尿素 グレード I、約 98%	シグマ	P7629-10G	PTU (色素沈着防止)
シャーレ	Sarstedt AG	821472	92 x 16mm
プラスチック金型	適応科学ツール	TU-1	マイクロインジェクション用
プレキシガラスカバー-穴付き	カスタムメイド		プレキシガラスカバーの穴は、水浸コーンの直径よりも3mm大きくする必要があります 対物
ティーストレーナー(プラスチック)			ゼブラフィッシュの卵を収集するには
温度コントローラー	ワーナーインスツルメンツコーポレーション	TC-344B	デュアル自動温度コントローラー
トランスファーピペット	Sarstedt AG	86.1171	3.5mLプラスチックトランスファーピペット
UMPlanFI 100x/1.00W	Olympus		ウォーターディッピングコーン対物レンズ
UMPlanFLN 20x/0.50W	オリンパスの		水浸コーン対物レンズ
広視野顕微鏡	リンパス	BX51WI
PTU(50倍ストック)			76 mg PTUを50 ml蒸留水に溶解 室温で激しく攪拌します  -20 oC で 1 ml アリコート で保存 1x 作業溶液
Tricaine (20x Stock)			200 mg Tricaine を 48 ml 蒸留水に溶解 2 ml 1M Tris base (pH9) 追加 pH 7  -20 oC で 1 ml アリコート 1x 作業溶液で使用
ダニオー溶液 (30x ストック)			1,740 mM NaCl  21 mM     KCl  12 mM     MgSO<サブ>4.7H<サブ>2O  18 mM     Ca(NO3)2 150 mM   HEPESバッファー  蒸留水 1リットルまで  4 oC  0.3x の作業溶液で使用