新生豚のリンパ節の腸リンパトランクやコレクションの長期カテーテル法

サマリー

私たちは、遠心性リンパ液から大量の脂質代謝成分を採取するために、新生児ブタの腸管リンパ幹をカテーテル挿入する外科的処置を提示します。

要約

新生児ブタの腸リンパ幹のカテーテル法は、大量の腸(中枢)遠心性リンパ液の長期収集を可能にする技術です。重要なことに、腸から中枢リンパ液を採取することで、研究者は脂質代謝、腸管炎症、がん転移に関連するメカニズムと脂質組成、および免疫機能と免疫監視に関与する細胞の両方を研究できます。腹側正中線外科的アプローチは、頭蓋腹部への優れた外科的露出を可能にし、膵臓と右肝葉の内臓面の下にある門脈の右腹側セグメントの近くにある腸リンパ幹血管への比較的容易なアクセスを可能にします。血管は細心の注意を払って解剖され、周囲の筋膜から解放され、その後縫合糸で拡張され、カテーテルが血管に挿入され、その後固定されます。カテーテルを外部に出し、7 日間で約 1 L/24 時間のリンパ液を採取します。この技術は、長期間にわたって大量の中枢リンパを採取することを可能にしますが、その成功は、慎重な外科的解剖、組織の取り扱い、および適切な外科的技術への細心の注意にかかっています。これは、リンパ管が簡単に裂け、外科的および実験的失敗につながる可能性があるため、若い動物の手術では特に重要です。このビデオは、腸管リンパの採取のための優れた手術技術を示しています。

概要

リンパ系は、生理の​​understudied領域です。リンパカテーテル法の前臨床モデルは、異なる動物種^1-8で発生し、脂質^8-12および薬物代謝^13-15、実験的治療¹⁷と癌転移¹⁶に関与するメカニズムを調査するために製薬産業や研究機関によって使用され、免疫機能^{18 -26。}この研究は、リポタンパク質代謝の成分を測定するために、国内のブタモデルにおける腸管リンパトランクカテーテルの使用を探ります。リポタンパク質代謝を産生および分泌カイロミクロンの、ならびに関連する脂質および総蛋白質の変化に関与しています。一般的に使用される齧歯類モデルと人間の間のような脂質代謝の主要な違いがあるように、これらは私を、脂質を研究するためのより多くの比較可能な情報を提供することができる腸のリンパ節を収集するために豚のモデルを採用し、重要な考慮すべき事項であります人々 ^27-31でtabolism。

いくつかの外科技術は、大規模な動物種における腸管リンパを収集するために使用されている：頭蓋肩のアプローチ（ すなわち、胸管カテーテル法^）5、横上部脇腹のアプローチ^32-34、および腹側正中線またはparamedianアプローチ^22,35。このビデオでは、具体的に腸のリンパトランクのカテーテル挿入のための腹側正中外科的アプローチを使用して、ブタにおいて外科的手順を説明します。慎重な手術法は、長期間にわたって大リンパの量とその成分を収集するためにリンパカテーテル法のこの方法が可能になります。

この技術は、様々な生理学的機能を調べる多くの分野への応用の無数を開きます。アプリケーションが含まれる可能性があり、これらに限定されないが、全身リポタンパク質と脂質代謝、免疫学、腫瘍の起源及び転移、腸機能、およびdevelopm耳鼻咽喉科や腸の炎症性疾患の進行。

プロトコル

ビデオと原稿の両方で説明した実験動物でのすべての手順は、制度的動物実験委員会によって承認され、動物ケアのカナダ人評議会によって設定されたガイドラインに従いました。

1.外科麻酔や新生児ブタの外科的準備

1. アザペロン（0.3ミリグラム/キログラム）、塩酸ケタミン（10mg / kgの）、デクスメデトミジン（15μgの/キログラム）：分離控室では、25キロの含有筋肉内鎮静麻酔薬カクテルと首の付け根の近くに豚をpremedicate。
   注：強化された術中疼痛管理のためのプレ麻酔薬カクテルにブプレノルフィン（0.005から0.02ミリグラム/キログラム）を追加します。
2. フェイスマスクを使用して（500ミリリットル、千ミリリットル/分のO ₂で四から五パーセントイソフルラン）吸入イソフルラン吸入ガスと豚を麻酔。獣医の喉頭スコープ（17〜25センチメートル長いストレート刃）を使用して、声帯を視覚化し、ボーカルへの局所10％のリドカインの去勢を適用コー​​ド。リドカインスプレーは声帯の痙攣および気道閉塞の可能性を低減するために、挿管に30-60秒前に声帯に連絡することを許可します。
3. 声帯の間（5.0〜7.0ミリメートル内径（ID））カフ付き気管内チューブを渡すことで豚を挿管し、イソフルランガスで麻酔を維持（1,000〜2,000 mlの0.5から2.0パーセントイソフルラン/分O _2）が閉じを使用して、手術全体の麻酔システムを再呼吸回路。顎トーンによって麻酔のレベル、およびペダルと眼瞼反射応答の両方を評価します。期限切れの麻酔ガスを掃気し、手術室の外に排出されます。
4. 70％イソプロピルアルコールリンスに続いて2.0％クロルヘキシジン手術用スクラブ溶液で耳の外面を清掃してください。手術中に、20 G静脈カテーテルを用いて、静脈内輸液（5〜10ミリリットル/ kg /時間乳酸リンゲル液）を提供するために、耳静脈をカテーテルを挿入。メッドの舌の粘膜表面にパルスオキシメータを確保iCalのテープは、心拍数および末梢血酸素飽和度（SpO _2）を監視します。
5. 背臥位で麻酔をかけた豚を置き、恥骨の腹側面に半ば胸部尾側から腹側腹部を剃ります。 2交互に2.0％クロルヘキシジン手術用スクラブし、滅菌水洗浄でこのエリアを清掃してください。
6. 手術室に麻酔豚を移し、70％イソプロピルアルコールリンスの最終的な手術用スクラブを適用し、それを乾燥させ、その後、動物を羽織ります。
7. 体温を監視するために、直腸内に、直腸温度プローブ約2〜4センチ挿入します。外科手術中に正常な体温（38-40°C）を維持するために、水の循環加熱パッド上豚を置きます。
8. 腹部の周りの上層象限パターンに配置された4タオルのカーテンで豚を羽織ります。約5℃、腹部の外側面に沿って第2のドレープ、剣状突起全体で最初のドレープを配置腹部正中線にメートルの横。骨盤の回腸稜と第四ドレープ全体で三ドレープを配置し、（反対側が）二ドレープのように、腹部の外側面腹部正中線に横約5cmに沿って配置されています。
9. 根底にあるタオルドレープの上に、手術部位へのアクセスを可能にするスリット開口と、大きなテーブルのドレープを置き、豚、全体の手術台をカバーしています。最終的なドレープは、大きなテーブルのドレープの上に配置された使い捨てsteriドレープです。

腸リンパ本幹の2腹部手術やカテーテル

1. 根本的な腹筋を公開するために手術用メスの刃で20センチの皮膚切開を行います。壁側腹膜を露出させるためにモノポーラ電気メス（20ワットの設定）で腹部の筋肉層を切開。腹部内臓やリンパ管にアクセスするためにMetzenbaumのはさみで頭頂腹膜20cmの直線セグメントを開きます。
2. 手術中は開いた腹腔を維持するために外科的切開の頭蓋側面でリトラクタを配置します。
3. 全体の外科的処置のための暖かい（37°C）滅菌生理食塩水ですべての組織を湿ら。静かに腹腔から結腸、盲腸、回腸および空腸を含む小腸の大部分を持ち上げ、上腹部、肝臓やリンパ管にアクセスするには、豚の左脇腹にそれを体外に出します。優しく腸をサポートするためにスリングを形成するために追加のタオルドレープとの位置に体外に腸を固定します。
4. リンパ管の位置を確認し、それが約4センチメートル右腎静脈、6センチメートル尾-medial-大静脈職長の腹側および膵臓^22,36,37の近くに右肝葉の内臓の側面の下の頭蓋-内側を産みます。門脈^36,37の右腹側セグメントに並置された半透明の構造としてリンパ管を識別します。
5. リンパヴェスを切り離しエル優しくQチップアプリケーターで付着した組織を離れてからかうことにより、周囲の筋膜から。容器の外側の側面は、周囲の組織から分離されると、微鈍鉗子をひっくり返して容器の下の「トンネル」の開口部を作成します。
6. 細かいピンセットでリンパ管の下に3 2-0絹縫合糸を渡します。 、閉塞拡張とリンパで容器を埋めるために最初に最も尾側の縫合糸を結紮。意図的にリンパ管にカテーテルを固定する（4センチ）比較的長いこの縫合糸の端を残します。他の二つの縫合糸を配置し、互いから1.0センチメートルを分離し、保護された尾縫合糸に頭蓋約1.0〜1.5センチメートルです。血管内にカテーテルを速く確保を可能にするために '一緩い結紮ネクタイ'でこれら2本の縫合糸を残します。
   注：（2頭蓋縫合の）ほとんどの尾側結紮縫合糸と中間縫合糸の間に位置するリンパ管のセグメントは、カテーテル挿入のためのサイトです。 suコマンドについて必要に応じて、トゥーレ材料は、2-0ポリグラクチン縫合糸は、2-0絹縫合糸の代わりにすることができます。
7. アイリスハサミで容器に小さな穴をカットし、微鈍鉗子で血管を拡張。容器内に傾斜した端部に特殊なカテーテルチューブ（4.06外径（OD）X 2.31ミリメートルのID）の約1.0〜1.5センチメートルを挿入し、所定の位置にカテーテルを固定するための2つの頭蓋縫合糸を結びます。容器にカテーテルを固定するために尾縫合糸の長い縫合糸の端を使用してください。
8. 温かい生理食塩水のおびただしい量の体外に腸を洗浄し、静かに腸の正しい解剖学的な位置決めを確実に腹腔に戻します。
9. 左ミッド脇腹（腹側paralumbar窩5〜10センチメートル）でカテーテルを体外に出します。メスで皮膚切開を行い、カテーテルの具象化するための開口部を作成するために、皮膚表面に腹腔からトロカールを通過します。腹部CAVからカテーテルを体外に出すために、大きなケリー鉗子を使用しますトロカールの貫通開口性。
10. ラウンド（テーパー）針で2-0ポリグラクチン縫合糸の単純連続縫合パターンで壁側腹膜を閉じます。ラウンド針に2-0ポリグラクチン縫合糸でシンプルな結節縫合パターンで腹部の筋肉層を閉じます。
11. 切断針に2-0ポリグラクチン縫合糸で表皮下のパターンで皮膚を閉じます。巾着縫合パターンおよび切断針上の2-0ナイロン縫合糸で皮膚に体外カテーテルを固定します。
12. まだその配置を容易にし、リカバリ時に豚のストレスを軽減するために麻酔しながら、豚に特化したジャケットを置きます。

3.手術後の回復とリンパコレクション

1. 前吸入麻酔の中止へ約10分で、即時術後の鎮痛を提供するために、筋肉内にbupenorphine（0.1ミリグラム/キログラム）を管理。 bupenorphineを続行（0.1ミリグラム/キログラム）24〜48時間を維持するために12時間ごとに術後の鎮痛。
2. 手術後の合併症のために7日間の期間ごとに8-12時間を豚を監視します。
3. エチレンジアミン四酢酸（EDTA）でコーティングし、抗生物質を補充した500 mlのポリプロピレン製の洗瓶でリンパ液を集めます。ペニシリン（6000 IU）、ストレプトマイシン（6 mg）をアムホテリシンB（3 mg）を7日間ごとに12時間。

リポタンパク質ApoB48、トリグリセリド、コレステロールと総タンパクの4定量リンパから収集

1. 4℃で5分間、1800×gでリンパサンプルを遠心します。上清を収集し、トリグリセリド、コレステロールおよび総タンパク質の定量化のためにそれを使用しています。
2. 希釈していないサンプル、サンプル希釈1：20蒸留水と1希釈した最終サンプル：蒸留水で100 3サンプルに上清を分割します。
3. 市販のキットを用いて、コレステロールレベルを測定するために希釈されていない上澄みを使用してください。
4. 1時20分と午前1時10分を使用します0は、それぞれ、市販のキットおよびビシンコニン酸総タンパク質アッセイを用いてトリグリセリドおよび総タンパク質レベルを測定するため、サンプルを希釈しました。

リンパ³⁸から収集したリポタンパク質ApoB48 5.定量化、

1. 適応免疫ウエスタンブロッティング法³⁸でリポタンパクApoB48の濃度を決定します。 3〜8％トリス - 酢酸塩、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）で区切り、総リンパ。
2. ポリフッ化ビニリデン膜（0.45μmの）に分離したタンパク質を移し、アポB（1：4000）にヤギポリクローナル抗体でそれらをインキュベートし、その後、抗ヤギ二次抗体とそれをバインドします。
3. 精製されたげっ歯類ApoB48タンパク質標準との線形濃度測定の比較を用い​​て、化学発光とリポ蛋白ApoB48を定量化します。

結果

新生児の豚の腸リンパ本幹のリンパカテーテル法は、7日間にわたって中央リンパの約1 L / 24時間の収集を可能にします。この実験で収集さリンパは、脂質代謝、すなわち総リンパタンパク質、ApoB48リポタンパク質、トリグリセリド、総タンパク質、およびコレステロールの成分を含有していました。表1のハイライト3匹のブタのプールされたリンパサンプルからこれらの脂質成分の代表的な量。特に、リンパの流れと脂質成分は、インライン腸リンパ管のカテーテル法以下の他の研究者によって報告された中央のリンパの値を持つ（リンパ節は570±158から979±284ミリリットル/ 24時間^{25、360±120} MLL / 24時間に流れています1080 720ミリリットル/ 24時間^26±;トリグリセリド687±110ミリグラム/ dLの^9;コレステロール63.1±5.6ミリグラム/ dLの^9）。リンパ血管内カテーテルの適切な配置を示します。

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ディスカッション

腸リンパを収集する様々な実験動物モデルにおいて、脂質^8-12に関与する機構と薬物^13-15代謝、癌転移^16,17、細胞輸送及び免疫機能^18-26を調査するための優れた方法です。実際に、長期間にわたって、末梢（求心性）と中央（遠心性と大きなトランク船）リンパを大量に収穫する能力は、免疫調節剤を^18-22と課題以下の細胞集団で発生する時間的な変化を理解するために特に重要でした^、25,26。同様に、中央のリンパのコレクションは、リポタンパク質代謝^8-12に関連するプロセスの輪郭を描くのに役立つてきました。リンパコレクションのユーティリティは、カテーテル処置の成功とリンパ血管内カテーテルの開通性に依存しています。

に関与する主要なリンパ管のカテーテル法大型動物における腸管リンパドレナージは、一般に、3つの外科的アプローチのいずれかを使用しています。第一の技術は、一般的な頸静脈（牛胸管^）5を覆う胸管を入力するために頭蓋...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ミラー喉頭鏡ブレード	ウェルチ アリン	68044	182 mm 長さ
サージベット アドバイザー: バイタル サイン モニター	サージ	V9203
直腸温度プローブ	サージ	V3417
モノポーラ電気手術発生器	バレー ラボ
メッツェンバウム はさみ	ファイン サイエンス	14518-18
タフィレトラ	スティーブンス	162-11-676
蚊鉗子	スティーブンス	162-7-10
ケリー鉗子湾曲 (14cm)	スティーブンス	162-7-38
アリス組織鉗子	スティーブンス	162-7-38
鉗子ドレッシング - アイ (10.2cm)	スティーブンス	162-18-780
鉗子ドレッシング - アディソン (12.1cm)	スティーブンス	162-17-2510
ニードルドライバー	スティーブンス	162-V98-42
アイリスはさみ	ファインサイエンス	14058-11
循環ウォーターポンプ	Jorvet	J-783X
Maxitherm-ビニールブランケット	Jorvet	J-784C
Q チップアプリケーター	フィッシャーサイエンティフィック	22-037-960
カテーテル法 チューブ (4.06 OD X 2.31 ID)	Braintree Scientific Inc.	MRE-160	マイクロレネタン注入チューブ
2-0 シルク縫合	Ethicon	LA556
2-0 ポリグラクチン縫合	Ethicon	J443H	2-0 vicryl
大型動物ジャケット	Lomir Biomedical Inc.	SSJ2YC
ポリプロピレンウォッシュボトルフィ	ッシャーサイエンティフィック	03-409-22C	500 ml
ペニシリン-ストレプトマイシン	シグマアルドリッチ	D4333
EDTA	シグマアルドリッチ	60-00-4
ホテリシンB	シグマアルドリッチ	A2411
ザペロン	エランコアニマルヘルス		ストレニル
デクスメデトミジン塩酸塩	Zoetis	6295	デキスドマイトール
イソフルラン	アボット アニマル Health	05260-5	IsoFlo
Ketamine hydrochloride	Zoetis	2626	Ketaset
Bupenorphine hydrochloride	Champion Alstoe Animal Health		DIN:02347510
6 mm 気管内チューブ	Jorvet	J-165d
10% リドカイン	アストラゼネカ		DIN:02003767
4 % クロルヘキシジン サージカルスクラブ	Partnar Animal Health	PCH-011	希釈:2.0%溶液
3M 外科用ステリドレープ	3M Health Care	1040
SDS page gel	Invitrogen	EA0375BOX	3-8 % 酢酸トリス
ビニリデンフッ化物膜	ミリポア	IPVH00010	0.45 μm孔径
ApoB抗体	EMD Millipore	AB742	1:4000希釈ロ
バ抗ヤギIgG-HRP	Santa Cruz Biotechnology	Sc-2304
ECL Prime Western Blotting Reagent	GE Healthcare LifeSciences	RPN2232
トリグリセリドキット	和光ピュアケミカル	998-40391/994-40491
総コレステロールキット	和光ピュアケミカルズ	439-17501
総タンパク質	ピアス	23225	ビシンコニン酸アッセイ