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方法論記事

マウスで同所後肢移植

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DOI:

10.3791/53483

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2016年2月12日

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1Department of Plastic and Reconstructive Surgery, Vascularized Composite Allotransplantation (VCA) Laboratory, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Visceral, Transplant and Thoracic Surgery, Innsbruck Medical University, 3Center for Vascularized Composite Allotransplantation, Department of Plastic and Reconstructive Surgery, Chang Gung Memorial Hospital and School of Medicine, 4Department of General, Visceral and Transplant Surgery, Charite Berlin

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

超微小血管吻合のための非縫合カフ技術を適用したマウスにおける同所後肢移植のためのこの新規モデルは、血管新生複合同種移植（VCA）に関連したin vivoでのメカニズムの免疫学的研究のための強力なツールを提供します。

要約

生体内動物モデルシステム、特にマウスモデルは、移植医療の分野における基礎研究やトランスレーショナル研究に不可欠な強力で汎用性の高い科学ツールへと進化しました。この設定では、診断およびインターベンションアプリケーション用のモノクローナル抗体とポリクローナル抗体を含む、膨大な数の試薬が専用に提供されています。さらに、膨大な数の遺伝子型、近交系、トランスジェニック、およびノックアウト株により、免疫応答の複雑な相互作用に対する体液性および細胞成分の個々の寄与を詳細に調査することができ、マウスを免疫学研究のゴールドスタンダードにしています。

血管新生複合同種移植（VCA）は、外傷性または先天性の組織喪失に苦しむ患者の「同種を同種」に置き換えるために同種移植片を使用した新しい移植分野を描写しています。この外科的方法論的プロトコルは、同所性マウス後肢移植モデルにおける超微小血管吻合のための非縫合カフ技術の使用を示しています。このモデルは、固形臓器移植における確立されたパラダイムと、さまざまな異なる組織成分からなる新しい移植形態との比較を特に可能にします。ユニークなことに、このモデルは、免疫受容と拒絶のバランスに有益な効果を発揮する可能性のある生存可能な血管新生骨髄コンパートメントとニッチの移植を可能にします。この技術は、同種抗原の認識と同種移植片の拒絶反応と受容を調査するツールを提供するだけでなく、この新しい移植分野をさらに前進させるための機能的神経再生研究の追求を可能にします。

概要

90年代後半は、1998年にフランスで初めて成功した手の移植により、再建移植の先駆的な時代を告げました。それ以来、壊滅的な組織欠損の再建のためのVCAの使用は、幅広い患者に採用され、成功を収めています。現在までに、世界は112の上肢の76人のレシピエントと31の顔1-3を数えています。さらに、腹壁4、喉頭5、気管6、血管新生関節7、さらには陰茎8など、他のいくつかの種類のVCAが行われています。さらに、子宮移植後の赤ちゃんの生児出産が最近報告されました9。この世界的な経験の高まりは、従来の再建および修復手術および治療では修正できない重大な機能組織欠損に苦しむ患者にとって、再建移植が有効な治療選択肢になっていることを示しています。

「同類」を置き換えるという考えは臨床的な熱意を呼び起こしましたが、同種移植片とその機能を維持するために必要な従来の高用量免疫抑制の副作用に関しては、当初の懐疑論が依然として優勢です10,11。しかし、Leeらの独創的な研究によって示されるように、これらの複合移植片は、その個々の成分よりも拒絶する可能性が低く、さらに、血管新生骨コンパートメントなどの組織成分の一部は、免疫受容と拒絶のバランスに独自の免疫学的効果を発揮する可能性があるため、楽観主義を煽っています12。

私たちのグループは、固形臓器移植のためのいくつかの顕微手術動物モデル、ならびに血管新生複合同種移植13-19の先駆者となりました。ここでは、非縫合カフ技術を使用して、同所性マウス後肢移植モデルで超微小血管吻合を行う新しい外科的処置について説明します。この移植モデルは、免疫受容および拒絶メカニズム、ならびにマウス種の免疫学的に汎用性の高い環境における耐性誘導に向けた血管新生骨髄コンパートメントなどの個々の組織構成要素の役割を調査するための有用なツールを提供します。さらに、四肢の同所性配置は、VCAの設定にとって非常に重要な神経再生と機能転帰研究の可能性を開きます。

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プロトコル

全ての実験は、国立衛生研究所の実験動物の管理と使用に関する指針（NIH）に従って行ったし、ジョンズ・ホプキンス大学動物実験委員会（JHUACUC）によって承認されました。具体的な手順は、承認されたACUCプロトコルMO13M108下で行いました。

1.ドナー操作

  1. 手術前に各薬理学的製剤のための適切な時点で鎮痛を管理します。承認された動物の世話のとおりと前皮膚切開にブプレノルフィン皮下に1時間の0.1ミリグラム/キログラムBWプロトコルの使用を使用します。
  2. イソフルランで落ち着いたドナーは4％でイソフルラン気化器に取り付けられた室を通って適用しました。ノーズコーンを介して2％で鎮静や麻酔を維持します。手続きの開始に先立って麻酔深度を監視するためにつま先ピンチ撤退反射を実行します。
  3. マスク、使い捨ての分離ガウンと手袋を着用してください。
  4. 外科的ARを剃りますEA、特に後肢と鼠径部、および10％のポビドンで準備を - ヨウ素。
  5. 滅菌野ドレープ、オートクレーブ処理機器や高倍率顕微鏡（40X）を使用します。
  6. 半ば腿領域に近位にはさみを使用して、脚の付け根の皮膚切開を行い、円周方向にマウス本体の残りの部分から後肢を画定するために切開部を接続します。
  7. 大腿動脈、静脈や神経を特定し、解剖。鉗子とマイクロはさみを使用して、すべての3つの構造を分離します。
  8. 血管茎を解剖したら、マイクロはさみを使用して、鼠径靱帯のレベルで血管を分割します。
  9. 次に、はさみを使用して、ドナー動物からの移植片を分離するために半ば腿のレベルで近位個々の腹側（薄と大腿内側の筋肉）と背側の筋肉群20を分割し続けます。
  10. 大腿骨を横断し、はさみを使用して大腿骨シャフトの中間で切断。
  11. イソフルラン過剰摂取FOLにより動物を安楽死させます頚椎脱臼が続き。心拍や呼吸の停止を確認してください。
  12. 注射器に取り付けられた33のGフラッシング針を使用してヘパリン化2ミリリットル（30 IE）の冷（4℃）生理食塩水で手足をフラッシュ（材料表を参照してください）​​。
  13. それぞれ、大腿静脈と動脈に1ポリイミドカフを配置します。
  14. インセットまで湿った綿ガーゼ、4℃でペトリ皿や店舗内の所定の場所に移植片をラップします。

2.受信者の操作

  1. 後肢の除去
    1. 手術前に各薬理学的製剤のための適切な時点で鎮痛を管理します。承認された動物の管理と使用プロトコルを使用ブプレノルフィンSC 1時間前に皮膚切開の0.1ミリグラム/ kg体重あたりとして。
    2. イソフルランで落ち着いたドナーは4％でイソフルラン気化器に取り付けられた室を通って適用しました。ノーズコーンを介して2％で鎮静や麻酔を維持します。 DEPTを監視するために、つま先のピンチ撤退の反射を行います手続きの開始に先立って麻酔の時間。
    3. 麻酔下ながら乾燥を防ぐために、マウスの目に獣医の軟膏を使用してください。
    4. 特に、10％ポビドンと後肢と脚の付け根と準備を手術領域を剃る - ヨウ素。
    5. 半ば腿領域に近位にはさみを使用して、脚の付け根の皮膚切開を行い、円周方向にマウス本体の残りの部分から後肢を画定するために切開部を接続します。
    6. 鉗子とマイクロはさみを使用して、すべての3つの構造を特定し、大腿動脈、静脈や神経を解剖し、分離します。
    7. 血管茎を解剖したら、鼠径靱帯のレベルで大腿血管をクランプします。
    8. 浅腹壁動脈のレベルで遠位血管をカットします。
    9. 次に、ネイティブ後肢リチウムを分離するために、近位に半ば腿のレベルで個々の腹側（薄と大腿内側の筋肉）と背側の筋肉群20を分割し続けますはさみを使用して、レシピエント動物からMB。
    10. はさみを使用して大腿骨シャフトの中央に大腿骨を横断。
    11. 切開部位の出血、したがってレシピエントの血液損失を防止するために、以前に離断大腿部の筋肉を焼灼。
  2. 移植
    1. 温かい生理食塩水（37°C）で術野を灌漑し、操作の前と後の0.3ミリリットル暖かい生理食塩水を注入することにより、流体の損失を最小限に抑えます。
    2. 受信者の大腿骨と移植片を整列させることによって、ネイティブ後肢の正確な解剖学的位置を反映し、髄内ロッドとして20 G脊髄針を使用してそれらを接続する方法で、移植片を置きます。
    3. 吸収性縫合糸材料（6-0ポリソーブ）を使用して癒合腹側と背側の筋肉群。
    4. 非縫合カフ技術を用いて大腿血管を接続します。詳細に、以前グラーフの容器端部に取り付けられたカフの上に容器の受信者側を引っ張りますトン。 10-0ナイロン縫合糸を使用し、袖口に受信者の容器を固定するために、円周ネクタイを行います。
    5. 次のクランプを解放します。この段階で視覚的にカフ回転および血管の誤回転やねじれを防止するための最適な位置を確認します。
    6. 筋肉の受信者ドナーインターフェースと骨の両端を中心とした電気メスを使用して細心の止血を行います。
    7. 非吸収性ナイロン縫合糸（6-0 Ethilon）を用いて皮膚を閉じます。
    8. 動物は加熱ランプの下で、そのケージに回復できるようにすることで、正常体温条件を確立します。住宅施設に戻す前に、少なくとも4時間、定期的なモニタリングを続けます。
    9. 3日間は0.1mg / kgをSC毎に6-8時間の用量でブプレノルフィンと術後鎮痛を提供します。

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結果

非縫合カフ技術を用いて、マウスモデルにおいて血管新生複合同種移植を行うと、 図1に示すように優れ、長期間の移植および動物の生存を達成することができる。また、血管新生合成の緩やかな同種移植片拒絶反応の再現可能な結果を得るための信頼できる方法を表します。などの同種移植は、 図2に示されている画像によって文書化。拒絶を受けた動物から得られた組織のH＆E組織学はさらに、このマウスモデル（ 図3）に同種移植片拒絶反応の再現性のダイナミクスを強調しています。

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すべての同系transplながら[C57BL6（H2K b）はへのBalb / C（H2K d）は]完全H2...

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ディスカッション

このような壊滅的な組織欠損の再建のための上肢と顔面移植などの血管新生したコンポジット同種移植は、従来の再建手続きに修正可能ではない患者に対する有効な治療法の選択肢として発展してきました。マイクロサージャリーの分野における技術の進歩だけでなく、強力な免疫抑制および固形臓器移植における免疫調節療法と豊富な経験は、今、このユニークな患者集団3,21の長期同種移植片の生存を可能にします。しかし、同種移植片の維持および生存のために必要な長期的な免疫抑制の重大な副作用は、まだ3,22,23救命再建モダリティを強化ではなく、これらの生命のより広い適用を制限します。また、固形臓器移植とは対照的に、のVCAの成功はまた、運動機能のための両方の筋肉を神経支配再ならびにする同種移植に受信者の神経のタイムリーな再生に依存タッチと機能を回復する温度感覚のための感覚のコンポーネント。免疫学的な観点から、移植医療のすべてのように、再建移植における包括的な目標は、長期維持免疫抑制23を必要とせずに同種移植片の受け入れを可能にする運用寛容の状態を達成することです。この点において、マウスは、無傷の免疫系にお...

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開示事項

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言する。

謝辞

この作品は賞号W81XWH-13-2-0053の下で、AFIRM II努力をサポートするために、陸軍、海軍、NIH、空軍、VAおよび保健省によってサポートされていました。米陸軍医学研究買収活動、820チャンドラーストリート、フォート・デトリックMD 21702から5014までは表彰および管理取得オフィスです。ご意見、解釈、結論と勧告は著者のものであり、必ずしも国防総省によって承認されていません。

著者らは、この研究の間に、その優れた獣医のサポートのためにジェシカイッチ、DVM、キャロライン・ギャレット、DVMとジュリー・ワトソン、DVMに感謝したいと思います。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
縫合糸、6-0 ナイロンMWI31849
縫合糸、6-0 ポリソーブMWI72667
縫合糸、10-0 ナイロンエアロ サージカルTK-107038
ポリイミド チューブ、サイズ 25Vention Medical141-0023
ポリイミド チューブ、サイズ 27Vention Medical141-0015
微小血管クランプ (シングル)Synovis00396
微小血管クランプ (ダブル)Synovis00414
マイクロハサミSynovisSAS-18
マイクロ鉗子SynovisFRS-15 RM-8
マイクロ拡張器SynovisFRS-15 RM-8d.1
マイクロニードルドライバーSynovisC-14
マイクロクランプアプリケーターSynovisCAF-4
マイクロフラッシングニードルハミルトン10MM、30°、33G
乳酸リンガー 溶液フィッシャーサイエンティフィNC9968051
ブプレノルフィンDEA 番号が必要です。ホスピタル薬局から入手。
エンロフロキサシン;バイトリルバイエルヘルスケア186599
ヘパリンホスピタル薬局から入手
ック

参考文献

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