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方法論記事

アピカル切除マウスモデルは、初期の哺乳類の心臓の再生を研究するために

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DOI：

10.3791/53488

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2016年1月23日

 , 
1Center for Molecular Medicine, National Heart, Lung, and Blood Institute, National Institutes of Health, 2State Key Laboratory for Agrobiotechnology, College of Biological Science, China Agricultural University

この記事について

サマリー

この研究では、根尖切除の段階的なビデオプロトコルが示されています。根尖切除術は、哺乳類の心臓再生研究において最近注目されている外科的アプローチです。この研究は、心臓再生の根底にあるメカニズムの研究における標準的な方法論としての根尖切除の適用を促進する可能性があります。

要約

心血管疾患は集中的なライフスタイルの変化による全世界を悩ませています。ハートの再生には、負傷や病気に負けた心筋細胞を修復し、復元するための大きな可能性を秘めています。一定の下等脊​​椎動物の強固な心臓再生とは対照的に、大人の哺乳類の心臓は、通常、心臓の再生および修復のための最小限の容量を示しています。しかし、最近の研究では、（P7へP1）1〜7生後日の間、新生児マウスの心臓が心尖切除（ すなわち 、外科的切断および左心室の頂点の曝露）後の重要な再生能力を保持し、知見とかなりの科学的関心を巻き起こしています。この発見を介して1つの主要な論争は、この重要な知見に複製または拡大するための努力で使用される多様な手術に関連した手順に起因する可能性があります。これらの命令は、動的にマウスモデルにおいて、頂端切除するための材料および方法論を提示します。このげっ歯類survivaの顕著なステップL手術は低体温麻酔、開胸、心臓心室尖部の外科的切断、縫合糸およびマウスの回復を伴います。記載されているアプローチは、心血管研究のための頂端切除マウスモデルの適用を拡大することができます。

概要

人間の寿命が延びると、さまざまな老化や生活習慣病、例えば心不全が主な死亡原因となります。しかし、失われた心筋細胞や機能不全の心筋細胞を補充しなければ、現在の治療法では心機能を一過性に改善することしかできません1、2。そのため、心臓の再生と修復のための革新的な戦略を発見し、開発する必要があります。成体の哺乳類の心臓は、再生能力が限られています。ウロデール両生類や魚類などの下等脊椎動物からの研究は、心臓再生の根底にある分子的および細胞的メカニズムについて前例のない洞察を提供しました3、4。最近、心臓再生の新生児マウスモデルが登場し、ヒトの心臓再生に必要な進化的に保存された病態生理学的事象の同定と特性評価が可能になるかもしれない5。

根尖切除術は、左心室尖の外科的切除を指します。この手順は、高齢のマウスで致死率が高いため、1〜7日齢(P1〜P7)のマウスに限定されています6。根尖切除後の新生児マウスの心臓再生プロセスは、次のようになると予想されます:(I)頂点を密閉し、放血を防ぐための血腫の迅速かつ効果的な形成。(II) 心筋細胞の再生と収縮機能回復5, 7.最近の研究は、このモデル8-11の重要性と効率性についての議論を刺激しています。したがって、根尖切除を明確かつ詳細に提示することが重要です。この目的のために、このプロトコルは、以前のプロトコル6に基づいて頂端切除を行った方法のビデオを鮮やかかつ具体的に説明しています。

心臓再生の根底にある分子メカニズムを理解することは、心不全1、2などの心筋細胞の喪失および/または損傷を特徴とする心臓病の治療にとって重要です。心臓再生の研究における根尖切除の現在および有望な進歩を考えると、この研究は、この技術の使用と心臓再生研究におけるその使用を促進する可能性があります。

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プロトコル

すべてのマウスの実験では、プロトコル番号H0083R3と国立衛生研究所（NIH）での動物管理使用プログラムによって承認されました。 NHLBI IACUCは鎮痛剤なしでプロトコルを承認しました。

新生児マウスの1の低体温麻酔

  1. 手術前にオートクレーブにスポンジや手術用機器を滅菌します。すべての外科的材料を準備し、270℃まで240℃に到達するために、事前にホットビーズ滅菌器で15〜20分を切り替えます。
  2. 新鮮な寝具、ネスティング材料ときれいなマウスのケージへの看護母からすべてのC57BL / 6仔（年齢P1）を転送します。子犬が手術室に取り込まれると、母親から分離され、母体の共食いの危険性を低減するために費やされた自分の時間を最小限にするために速やかに頂端手術を行います。
  3. 氷のベッドの上にスポンジを入れた後、低体温麻酔を達成するために〜3分間スポンジに1子犬を置きます。 APを観察することによって麻酔を確認NEAと無動とリアの足をつまんで。あまりにも少しの時間が子犬の無動や無呼吸をすることはありませんし、麻酔の過剰な期間は生存率12を低下させることができるので、頻繁に新生児の状態を確認してください。

2.開胸

  1. 外科的なベンチトップ型領域に氷床から子犬を転送し、仰臥位でその腕、脚、尾を固定するテープを使用しています。
  2. ベタジンを使用して胸を消毒し、ゆっくりと70％アルコールの準備パッドを使用して清掃してください。
  3. Vannas春シザーを用いて、胸腔の第肋間領域に沿って横方向の皮膚切開を行い、その後、心臓へのアクセスを容易にするために記載肋間筋を解剖鈍ら。
    注：血液損失は、外科的処理中に最小化されたときに生存率が向上します。

ハート心室アペックスの3外科切断術

  1. 手で、優しく体外に出すために、腹部に圧力を適用します心尖​​。明確な可視化のための滅菌綿棒アプリケーターで手術領域の周りに血液を吸収します。偽手術対照新生児の場合は、4（縫合糸とマウスの回復）をステップに進んで。
  2. LV室が露出するまで拡大ランプの下や虹彩切除鋏を使用して、静かに左心室（LV）の断片的な切除を行います。 LVの切除部分を最小限にするように注意してください。約15％の切除は、LV室の最適な露出を達成するために必要です。
  3. LV室が露出されると、心臓が胸腔に返すことを確認してください。

4.縫合およびマウスの回復

  1. 無菌プロリン6-0縫合糸を使用して胸腔を密封するために一緒に肋骨や筋肉を縫合した後、慎重に皮膚接着剤を用いた皮膚切開部位を閉じます。
  2. 回復のために〜3分間加熱ランプの下で新生児を温め、その後、70％のアルコールプレップパッドbefoを用いて血液や接着剤の痕跡をきれいにその同腹子に再導入する再。母親から分離かかる時間を最小限に抑えること頂端切除後の仔の生存率を改善するため、10分以内に全体の外科的手順を完了してみてください。
  3. 各手術後、完全な殺菌のため約20秒間ホットビーズ滅菌器のビーズと接触した手術器具を配置します。手術器具がそれぞれの外科手術の前に室温まで冷却してください。
  4. ごみのすべての子犬のための手術を完了した後、母親の巣に戻す前に、母親の寝具や排泄物との子犬を混ぜます。
    注：一般的に、ICR / CD-1マウスは、C57BL / 6よりも優れ養母であるが、同じであっても遺伝的背景の授乳中の母親の間で、育成本能が異なります。看護母を変更すると、母体の共食いによって死亡率を減少させる看護母にP0仔を削除して、P1で頂端切除を行う必要がある場合。のみ偽手術または頂端Rのいずれかを実行します子犬の1リターのesection、混合偽手術子犬は子犬6の手術群の生存率を低下させる可能性があるため。

5.術後の分析

  1. ある日手術後、子犬を監視し、偽手術群の間に差がないことを確認し、生存率を測定するために、仔の数を数えます。手術が適切に行われている場合、生存率は、偽手術群の両方に類似しており、60％以上でなければなりません。
  2. ハートの分離と固定。
    1. 70％アルコールの準備を使用して胸をきれいその後、頚椎脱臼により死亡の保証とCO2によって断頭し、21日目、手術後経由で1日目および2日目、手術後に子犬を安楽死させます。
    2. 胸の正中線の皮膚や筋肉を切開して、胸を開きます。
    3. 消費税​​胸腔から全体の心と室温で4％パラホルムアルデヒド、O / N 5mlに、各サンプルの心臓全体を固定します。
  3. 翌日、70％エタノールにサンプルを転送します。サンプルは、パラフィン包埋の前に一週間まで保存することができます。
  4. スライス5ミクロンの厚さのパラフィン切片全体の心室を通って、再生応答5,7を調べるために 、標準的なヘマトキシリンおよびエオシン（H＆E）およびマッソントリクローム染色を行う。具体的には、H＆E染色は、筋肉の交換を検討するために使用され、マッソントリクローム染色を使用しています線維性応答5を検討します。
  5. 関心のある領域を選択し、スライドスキャナを使用して手動でサンプル当たり少なくとも三つの焦点を設定します。デフォルトのパラメータで、製造元の指示に従って40倍の倍率で染色スライドをイメージし、分析します。

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結果

仔マウスは1、2、および21日後に根尖切除術を安楽死させ、彼らの心は、H＆Eおよびマッソントリクローム染色のために回収しました。マッソントリクローム染色で青色は心外膜の細胞外マトリックス5の堆積を示しています。 図1Aに示すように、成功した頂端切除と、血餅を効果的に、LV一日後、頂端切除を封止するように形成されています。血液凝固および早期の心臓線維症の段階的な吸収が観測され、心筋の完全な再生は21日、頂端切除術（ 図1BおよびC）の後に行われるまで心筋組織による置換が発生します。形態素解析は、手術後21日目に切除および偽手術心（ 図1CおよびD）の間に差を示さありません。

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図1.代表的H＆Eとマッソントリクローム染色。心室新生仔マウス心臓1（A）の心筋、

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ディスカッション

心臓再生は、心不全の治療と予防の可能性を示しています1、2。動物モデルは不可欠であり、心臓の再生がどのように起こるかを理解する上で重要な役割を果たします3-6。多くの両生類や魚は損傷に反応して心臓組織を再生し、ヒトの心血管疾患の理解への洞察を提供します13、14。しかし、進化の観点からは、病態生理学はマウスモデルとヒトの間でより保存されるべきです。哺乳類動物モデルにおける心臓再生は、比較的新しいが、心不全の治療のための急成長中の研究分野です3-6。

最近、新生児マウスの心臓再生の研究において、根尖切除と心筋梗塞の 2 つの外科的アプローチが確立されました6。心尖切除は、心筋細胞の喪失および/または損傷に対する比較的簡単で直接的なモデルを提供しますが、心筋梗塞と比較した心尖切除の主な制限は、死亡率が高いため、この外科的方法が P7 を超えて実行できないことです6。ただし、この方法で死亡率を減らす方法はいくつかあります。P7 子犬の根尖手術では、最適な低...

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開示事項

この記事の発行手数料は博士建侯にファイン科学ツールからの贈り物が主催しました。

謝辞

著者は、博士に感謝します。マウスの手術と準備し、パラフィン切片の染色との支援のための国立心肺血液研究所（NHLBI）からジェームズ・ホーキンス、祖-XIゆうと玄屈原。著者は、編集支援のためのNIHフェロー編集委員会に感謝しています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
はさみ、1.5 mmファインサイエンスツール付きオルセンヘーガーニードルホルダー12002-12
バンナススプリングはさみ-2 mmカッティングエッジファインサイエンスツール15000-03虹彩切除はさみ
ホットビーズ滅菌器ファインサイエンスツール18000-45
アイリス鉗子、ストレート、鋸歯状ファインサイエンスツール11064-07
アイリス鉗子、湾曲、鋸歯状のファインサイエンスツール11065-07
シアはさみ-湾曲/鈍器/ 12cmファインサイエンスツール14105-12
ラウンドハンドル縫合タイイング鉗子、ストレートファインサイエンスツール18025-12
ラウンドハンドルバンナススプリングはさみファインサイエンスツール15400-12
ファイン止血ファインサイエンスツール13007-12
拡大鏡Luxolamp CorpIM120 
暖房ランプBrandt Equipment llc51152/3
6-0 Prolene縫合糸Ethicon8889H
スキングルー-Vetbond組織接着剤 3M 1469
滅菌コットンチップ アプリケーターDynarex4305
WEBCOL アルコール準備パッドCovidien6818ミディアム 2 プライ、200/BOX、70% イソプロピルアルコールでサチュレーション
キュリティ 万能スポンジCovidien9024不織布 4 プライ、4 インチ x 4 インチ (10.2cm×10.2cm)
ベンチトッププロテクターシートキムテックサイエンス754618インチ x 19.5インチ (45.72cm x 49.53cm) x 50
0.9% 塩化ナトリウム、250mlホスピーラ株式会社NDC 0409-6138-22
ベタジン溶液スワブスティックPurdue製品LPNDC 67618-153-03
クレーブタカラトミーデジタルバイオロジーSX-700蒸気滅菌器
スライドスキャナー浜松ナノズーマー2.0-RS
オート高圧

参考文献

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