カーボンナノチューブにより安定化内部自己組織化脂質粒子の簡便な調製

サマリー

私たちは、自己組織化ナノ構造をコアに含む脂質粒子の速度論的安定化のためのカーボンナノチューブのスマートな応用について報告します。脂質粒子の調製には、かなり低濃度のカーボンナノチューブが必要であり、薬物送達などの生物医学的用途での使用が可能です。

要約

我々は、カーボンナノチューブ（CNT）によって安定化されたナノ構造脂質粒子を調製する容易な方法を提示します。壁シングル（原始）及び多重壁（官能化）カーボンナノチューブは、ピカリング型水中油型（O / W）エマルジョンを製造するために安定剤として使用されます。脂質はすなわち、のDimodan U及びフィタントリオールは、過剰の水の中で、バイコンティニュアスキュービックPn3m相に自己集合乳化剤として使用されています。この高粘性相は、ここで行ったように、従来の界面活性剤安定剤またはCNTの存在下で、プローブ超音波処理を使用して、より小さな粒子に断片化されています。最初に、カーボンナノチューブ（粉末状）は、最終的なエマルジョンを形成する溶融脂質とさらなる超音波処理、続いて水に分散されています。このプロセスの間にCNTを順番にヶ月間安定である粒子状のエマルジョンを形成する脂質滴を囲むように推定される脂質分子、で被覆されます。 CNT安定化ナノ構造脂質粒子の平均サイズは、サブミクロンのRであり粒子とよく比較angeさんは、従来の界面活性剤を用いて安定化。純粋な脂質相（バルク状態）に比べて、小角X線散乱データは、CNT-安定化脂質分散液中の元のPn3mキュービック相の保持を確認します。ブルーシフトと特性Gとラマン分光法で観察されたCNTのG 'バンドにおける強度の低下は、CNT表面と脂質分子間の相互作用を特徴づけます。これらの結果は、カーボンナノチューブと脂質との相互作用が、水溶液中でそれらの相互の安定化に関与していることを示唆しています。安定化のために用いられるカーボンナノチューブの濃度は非常に低く、脂質分子はCNTを官能化することが可能であるので、その生体適合性が大幅に向上しているが、CNTの毒性は軽微であると予想されます。したがって、本発明の方法は、メートルの送達のためのハイブリッドナノキャリアシステムを開発するために、例えば、様々な生物医学的応用に大きな可能性を発見しますultiple併用療法またはpolytherapyのような機能性分子。

概要

過去数十年にわたり、ナノテクノロジーは、特に、癌の¹のような悪名高い病気と闘うための薬の前臨床開発の分野で強力なツールとして浮上しています。この文脈において、サイズのナノスケール構造体は、<1000nmでは、広くそのような薬物、タンパク質、核酸、遺伝子および診断用造影剤^1-4のような種々の活性な生体分子の送達媒体として調査されています。これらの生体分子は、いずれのナノ粒子内にカプセル化またはナノ粒子の表面に結合させ、例えばpHや温度^5,6のようなトリガーによって作用部位で放出されるされています。サイズは非常に小さいが、これらのナノ粒子の大きな表面積は、活性生体分子の標的化送達のために非常に有利であることがわかります。粒子サイズおよび生体適合性の制御は、治療有効性、従って、ナノ粒子^7,8の適用可能性を最適化するために最も重要です。脂質^9-13、ポリマー^14,15、金属^16,17およびカーボンナノチューブ^{18,19は、一般的に} 、様々な生物医学および医薬用途のためのナノ担体として用いられてきました。

また、脂質自己組織化ナノ構造に基づくナノキャリアアプリケーションは、食品および化粧品産業^20,21を含む他の多くの分野の広い意味を持っています。例えば、それらは 、例えば、デザート²⁴において、そのような栄養素、香味料および香料^25-31のような活性分子の送達における食品安定剤として、タンパク質結晶^22、生体分子²³の分離に使用されています。自己組織化脂質ナノ構造を制御し、目標とファッション^32-38で生理活性分子を放出する能力を持っているだけでなく、彼らはまた、化学的および酵素分解^39,40から機能性分子を保護することができます。平面流体二重層は、ほとんどのCOMMですが水の存在下で両親媒性脂質分子により形成されるナノ構造体に、例えば、六角形及び立方体のような他の構造も一般^20,41,42が観察されます。ナノ構造形成のタイプは、水ならびにそのような温度及び圧力⁴³として用いる物理化学的条件脂質」分子形状の構造、脂質組成に依存します。キュービック相の、特にその非平面脂質ナノ構造の適用は、その高い粘度および不均質なドメインの整合性を制限されています。これらの問題は、ミクロンまたはサブミクロンサイズの脂質粒子を含有する水中油型（O / W）エマルジョンを形成するために大量の水での脂質ナノ構造を分散させることによって克服されます。分散粒子内部の元の脂質の自己集合構造を保持しながら、このようにして、低粘度の適切な製品を製造することができます。これらの内部で自己組織化粒子の形成は、（ISAsomes ⁴⁴と略します 例えば、立方晶相と六方晶相からhexosomes）からキュボソームは、一般的に高エネルギーの入力ステップと、このような界面活性剤やポリマーなどの安定剤の添加の組み合わせを必要とします。この方向での最近の研究では、適切にピカリング⁵¹またはラムスデン-ピカリング乳剤⁵²と呼ばシリカナノ粒子⁴⁶は、上記エマルションの安定化のための粘土^47-49カーボンナノチューブ⁵⁰を含む様々な固体粒子⁴⁵のアプリケーションを示しています。

近年では、単層カーボンナノチューブ（SWCNTの）として、炭素系ナノ構造、多層カーボンナノチューブ（MWCNT）とフラーレンは、新規の生体材料^53,54として大きな注目を受 ​​けています。主な懸念は、その毒性^55-58、水不溶性^59、したがって、それらの生体適合性⁵⁶です。これらの問題に取り組むための効率的な方法は、表面関数でありますそのような脂質のような非毒性および生体適合性分子を使用alization。水の存在下において、脂質は、脂質の親水性頭部基が水^60,61におけるそれらの溶解性または分散を助ける一方、CNTの疎水性表面は、極性水性媒体から遮蔽されてなる ​​ようにカーボンナノチューブと相互作用します。脂質は、したがって、それらの装飾は、理想的には、CNTのin vivoでの毒性を減少させる必要があり、細胞小器官だけでなく、いくつかの食品素材の一体的な構成要素です。カーボンナノチューブ^18,19および脂質ナノ構造体^9-13に独立基づく生物医学的用途は、広範な開発が進められているが、2つの特性を組み合わせるアプリケーションでは、まだ十分に探求されていません。

この研究では、脂質の二種類やたMWCNTは、ヒドロキシルおよびカルボキシル基で官能化されている一方のSWCNTは、自然のままの形態であるのCNTの三種類を採用します。我々は、その分散液を調製したCNTの非常に低い濃度を使用しています安定性は、 例えば、脂質、CNTの種類、使用されるCNTに対する脂質の比率の種類、ならびにそのようなパワーと持続時間として用い、超音波処理パラメータにいくつかの要因に依存します。このビデオプロトコルは、動力学的に様々なCNT-安定剤を使用して、脂質ナノ粒子を安定化する方法の技術的な詳細を提供します。

プロトコル

注意：この作業で使用されるCNTは、それらのバルクの対応と比較して、追加の危険性を有することができるナノ粒子形態です。グラファイトの吸入は、天然および合成の両方、石炭労働者のじん肺に似塵肺^{62を引き起こす可能性があります} 。また、炭素系ナノ構造体の毒性に関する懸念があったと以前の研究の一部は、カーボンナノチューブ^63から68の吸入に伴う急性および慢性毒性を示唆しています。このため、微細なCNT粉末の吸入を避けるために、細心の注意を払ってそれを扱います。吸入した場合、空気の新鮮な場所に移動します。呼吸が困難な場合は、代わりに純酸素を使用し、診察を受けてください。 CNTの溶液/分散液製剤の取り扱いがかなり安全です。

注意：本研究で用いた脂質および界面活性剤は、一般的に食品用材料、したがって非危険ですが、彼らはまた、非常に可燃性の目や皮膚への刺激性であり、。従って、このような専用の使用などすべての適切な安全対策を使用してくださいナノ粒子のサンプルを処理または調製する際のコントロール（ヒュームフード）と個人用保護具（安全眼鏡、手袋、白衣、完全長ズボン、閉じたつま先の靴を）gineering。皮膚や目、少なくとも15分間多量の水で直ちにフラッシュ皮膚や目に接触した場合。必要に応じて医師の診察を受けます。

脂質/水バルク相の調製

注意：4℃の冷蔵庫に脂質を保管してください。純粋なグレードの脂質は、冷凍庫（-20℃）に格納する必要があります。全体の在庫や取り扱いの利便性の汚染を避けるために、小さなガラスバイアルにそれらを分取。カーボンナノチューブ及び界面活性剤を含む他の化学物質は、室温で保存されているが、直射日光の当たらない場所に保管することができます。

1. 結露を避けるために、ボトル/バイアルの蓋を開ける前に15〜20分間室温での脂質、 すなわち、のDimodan U（DU）とフィタントリオール（PT）を保管してください。
   （注：DUは、96％のモノグリセリドを含有する蒸留グリセリドと残りはジグリセリドおよび遊離脂肪酸です。 DU 2つの主要なモノグリセリド成分はリノール酸（62％）及びオレイン酸（25％）です。したがって、DUの疎水性部分は、主にC18鎖（91％）、以下のようになっている正確な組成が含まれています。 C18：2（61.9パーセント）、C18：1（24.9パーセント）、およびC18：0（4.2％）、C18は、18C-チェーンとコロンの後の番号を示し、C = C結合の数を示します。 PTは、3,7,11,15-テトラメチル-1,2,3- hexadecanetriol光学異性体の混合物です。これは、エステル官能基を​​含有するが、トリ - ヒドロキシ頭部基と高度に分岐フィタニル尾から構成されていません。 DUとPTの両方はまた、安定化脂質粒子^13、45）のコアの場合の過剰な水の存在下でキュービック相を形成します。
2. 湯浴または60°C以上に維持ビーカー含有水にバイアルを置くことにより、脂質を溶融（マグネチックスターラーを加熱：230 V、50 Hzの、630 Wまたは類似のビーカー内の水を加熱するために使用されます）。
3. ブロックヒーターを使用して、あるいは、熱バイアル。温度勾配とそれに続く脂質の分解を回避するために、ホットプレート上で直接バイアルを含む脂質を加熱しないでください。
4. ラテックス球でパスツールガラスピペットを用いて、（1.5 mlの円錐形のスナップキャップで）予め秤量した微量遠心管中で、溶融した脂質の500ミリグラムを秤量します。
5. 上記のマイクロ遠心チューブに超純水500ミリリットル（水抵抗率= 18.2MΩ・cm程度）を追加します。
6. 小さな（カスタムビルド）スパチュラを使用して15分間のコンポーネントを手動で混ぜます。プライヤーを使用して、注射針（0.9ミリメートル×40ミリメートルカニューレの長さ）の鋭い端部を平坦化することにより、このようなへらを行います。
7. 遠心2,000×gでの速度で10分間、脂質/水混合物。再び24時間のためにそれを平衡化、10分間手動で混合物を攪拌。サンプルを特徴づける前に、5分間、それらを攪拌し、その後、室温でそれらを残します。
8. 管全体にわたって平衡脂質相の形成を確実にするために、約10回の凍結融解サイクルとINTEを行います上記で定義されたrmittently遠心分離工程を行います。両方DU及びPTフォーム高粘性バルク脂質相が困難手動で（ 図1）、それらを処理すること。
   注：1は、バルクの脂質相と分散粒子の（格子型と自己集合体の寸法）ナノ構造の挙動を比較したいおよび/ ​​または確認するためのコントロールとして、それを使用する場合は、上記のプロトコル（セクション1）は、必要なだけです元のナノ構造の保持。

異なるCNT安定剤、すなわち、SWCNTを用いた高エネルギー入力（超音波）を用いて高粘度脂質相から液体コンシステンシーを有するO / W微粒子エマルションの図1の製造MWCNT-OH、MWCNT-COOH（基準から再生図[50] ）化学の王立協会から許可を得て。_upload / 53489 / 53489fig1large.jpg "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

界面活性剤の調製は、脂質粒子を安定化

1. 水中の0.2％（w / w）の界面活性剤（プルロニックF127）溶液を調製します。
   1. （マグネチックスターラーバーを用いた磁気プレート上）20-30分間それを攪拌100 mlの超純水に界面活性剤（白色の綿毛状の粉末）200mgを溶解します。プルロニックF127は、非イオン性界面活性剤であり、一般に乳化安定剤として使用されます。これは、PEO ₉₉ -PPO ₆₇ -PEO ₉₉のトリブロック共重合体であるので、水に溶解するのに長い時間がかかります。
2. ガラスバイアル（箔裏打ちさ尿素キャップを装着したシンチレーションソーダ石灰、20ミリリットル）に溶融DUまたはPT（パスツールガラスピペットを用いて）500mgのを追加します。
3. 0.2％のF127水溶液の9.5グラムを追加します。
4. プローブ超音波マシンでは、しっかりとレトルトのバイアルは顎をスタンドクランプ（レトルトはとスタンドセットそれは超音波処理により生成された振動に耐えることができるように、クランプ、ベース、ロッド、ゴム3顎主任）が立ちます。
5. セル超音波処理に取り付けられた固体状チタン合金プローブ（直径13mm X 139ミリメートルの長さ）を挿入します。その側面と底面はプローブに触れていないことを保証するために、バイアルの高さと位置を調整します。プローブ先端とガラスバイアルの底部との間の0.5センチメートルの距離が良好な結果を与えます。
6. 電力（最大の）35％で1秒の遅延時間によって媒介される1秒のパルスとパルスモードで10分間、混合物を超音波処理します。バイアルが原因で超音波処理中に発生する熱に非常に高温になります。したがって、それはクランプからそれを取る前に、室温まで冷却することができます。
7. 前さらに使用するには、少なくとも24時間、室温で乳白色に形成された分散物を保管してください。これは、相分離に対する安定性を確保することです。
   注：前とプローブを使用した後、アセトンでそれをきれいに、ペーパータオルで乾燥し、その後、超純水のANとそれを洗い流しもう一度それを乾燥さdは。

水中での純粋なCNTの分散液の調製

1. 二つの別々のビーカーで、色は黒で、どちらも4 mgの粉末MWCNT-OHおよびMW​​CNT-COOHで重量を量ります。
2. 各ビーカーに500ミリリットルの超純水を追加します。プローブを使用する（最大で）40％での連続パルスモードにおいて電力を2分間混合物を超音波処理超音波処理。 MWCNT分散の結果として得られる濃度は、8 / mlの（原液）です。
3. 6.25、5、4、2 / mlのMWCNT分散を達成するために、超純水の適切な量のMWCNTストック溶液を希釈します。
4. 前述したように、これらの分散液（3.2を参照）超音波処理。
5. 同様に、6 / mlのSWCNT分散液（原液）を作るために500ミリリットル超純水に粉末化SWCNTの3ミリグラム（色も黒）を分散させます。
6. SWCNTの原液を希釈し、上記のように、それらを超音波処理（3.2参照）0.5、0.4、0.3125を得るために、0.2μgの/ mLのSWCNTのdispersions。
   注：すべての分散液は、CNTが底に沈降し始めた後、約30分間明確です。

CNT-安定化ナノ構造脂質粒子の4調製（図1）

1. ガラスバイアル中に溶融DU 500ミリグラムに秤量します。
2. バイアルに6 / mlののSWCNT分散液9.5ミリリットルを追加します。
3. （3.2を参照）は、純粋なCNT分散液を製造するために使用されるのと同じパラメータを使用してCNT-DU混合物を超音波処理します。 RTに冷却すると、保存された内部自己組織化ナノ構造を持つCNT-安定化脂質粒子は、準備が整います。
4. 同様に、0.4μgの/ mlおよび0.2 / mlのSWCNT分散液を用いて、脂質粒子を準備します。
5. MWCNT-OHおよびMW​​CNT-COOHを使用したが、異なる濃度、CNTのすなわち8,4および2μg/ mlのを使用して、脂質粒子を作るためのプロトコルを4.4から4.1に従ってください。
6. 同様に、4 / mlのMWCNT-OH及びMWCNTを使用して、3つの異なるCNT-PT分散液を調製します-COOHと同様に0.4μgの/ mLのSWCNT。 CNT-PT分散液は、連続パルスモードで少ない電力（最大値の35％）が、より長い時間（15分）を必要とすることに注意してください。 RTに分散液を冷却し、それらを特徴付ける前に24時間のためにそれらを残します。
   注：超音波処理パラメータは（DU、ここでPT用として）と異なる組成のために、異なる脂質のために異なる場合があります。それらは十分に安定化された分散を達成するために最適化される必要があります。

5. CNT-安定化脂質分散液の安定性を監視します

1. 目視での分散液の安定性を監視します。分散液は不安定化している場合、または塊が分散液中で形成されているかどうかを確認します。
2. 定期的に（デジタルカメラで）写真を撮ります。たとえば、最初の週に毎日分散液の写真を撮って、その後週一日おきには、次の2週間は週に一度、続いて、最後に月に一度の要件ごととして。

結果

以下の結果は、分散液の）安定性、脂質粒子のb）の粒度分布、自己集合及びDのC）タイプ）CNTの脂質コーティングの証拠を表します。分散液の安定性（ 図2）は、オートフォーカスとLEDフラッシュで5 MPのカメラを用いてモニターしました。

CNTの種類（A）MWCNT-OH、（B）MWCNT-COOH、及び（C）SWCNTと、対応するエマルジ ​​ョンの写真を図2の回路図。安定したエマルジ ​​ョンにのみ、特定の地域で得られた（斜線）ここで、CNT脂質へ比率が最適でした。以下および安定なエマルジョンの上には、それぞれ、理由CNTの少なすぎるまたは多すぎる量で形成されませんでした。矢印は、不安定なエマルジョン中の典型的なCNTの塊を示しています。これらの測定は、DU-...

ディスカッション

脂質粒子の安定化
三つの異なるCNTは、脂質分散体を安定化するために使用されます。二は、多重壁及び-OH及び-COOH基を用いて官能化され、一方は壁の単一および非官能（原始）です。 MWCNT-COOH：（直径×長さ）は、以下のようにカーボンナノチューブのサイズは変化し9.5ナノメートル×1.5ミクロン。 MWCNT-OH：8-15 nmの×50ミクロン。 SWCNT：1-2 nmでのx 1-3ミクロン。粉末状のCNTをプローブ超音波処理により水中に分散させました。 CNTの前述のサイズが不均一ではあるが、超音波処理によりさらに減少する可能性があります。純水中のCNT分散液は、さらに作業がこの時間内に脂質および第二の超音波処理、すなわち、加算を実行されたため、約20分後に分離し始めました。後者（脂質-CNTの混合物で行わ超音波）は溶融するのに役立つとサブミクロンの部分に水和の間に形成された大規模かつ一貫性のない脂質ドメインを破壊します。バルク脂質私を分散させますnはこの方法は、そうでなければ、厳密な凍結融解サイクル、および/または（数日から数週間）に長い時間を要する自己集...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Dimodan U	Danisco	15312	4 の店舗°C.非危険です。目や肌に刺激を与えます。
フィタントリオール(> 95%、GC)	TCI Europe N.V.	P1674	4 °C.非危険です。目や肌に刺激を与えます。
単層カーボンナノチューブ(90%)	ナノ構造&アモルファスマテリアルズ株式会社	1246YJS	は室温で保存します。直射日光を避けてください。目、皮膚、呼吸器系に刺激を与えます。
多層カルボン酸官能基カーボンナノチューブ (> 80% キャロンベース、> 8%カルボン酸を官能基化)	Sigma-Aldrich Co. LLC	755125	室温で保存してください。直射日光を避けてください。深刻な眼の炎症を引き起こします。呼吸器への刺激を引き起こす可能性があります。
グラファイトマルチウォールドヒドロキシ官能化カーボンナノチューブ(99.9%)	ナノ構造&アモルファスマテリアルズ株式会社(ナノアモール)	1224YJF	は室温で保管してください。直射日光を避けてください。目、皮膚、呼吸器系に刺激を与えます。
プルロニックF127	シグマ-アルドリッチ株式会社LLC	P2443	BioReagent、細胞培養に適しています。有害物質または混合物ではありません。室温で保存してください。
アセトン(99.5%)	フィッシャーサイエンティフィック	10134100	引火性の高い液体。深刻な眼の炎症を引き起こします。眠気やめまいを引き起こす可能性があります。
ゆるい折り畳み式の蓋が付いた瓶(375 ml)	VWR International Ltd	216-3308
カー、1,000 ml	フィッシャーサイエンティフィック	12942161	ヘビーデューティー、ローフォーム、注ぎ口と目盛り付きパス
ツールガラスピペット(長さ150mm)、ラテックス球根付き	ッシャーサイエンティフィック
微量遠心チューブ 円錐形スナップキャップ 1.5 ml	フィッシャーサイエンティフィック
スパチュラ	フィッシャー サイエンティフィック
加熱マグネチックスターラー	フィッシャーサイエンティフィック
マグネチックスターラーバー(円筒形、不透明PTFE、30 mm x 7 mm (l x diameter)フィ	ッシャーサイエンティフィック
針(0.9mm×40 mmカニューレの長さ)	テルモUK Ltd	MN-2038MQ
レトルトスタンドセット - スタンド、クランプ、ベース、ロッド、ゴム3ジョー、ボスヘッド付き	Camlab Ltd、英国	1177157
ミリポア水機器	バーンステッドナノピュア、サーモサイエンティフィック、米国
プロジェンGen Genfuge 24Dデジタルマイクロ遠心分離機	プロジェンサイエンティフィック	C-2400
プローブ超音波装置、13 mm付き	SONICS、ビブラセル、 オート
5MPカメラ	サムスンギャラクシーフェイムモバイルカメラ
ラマン分光計	堀場Jobin-Yvon LabRAM HR800分光計
マスターサイザー3000	Malvern Instruments Ltd, Malvern, United Kingdom
Small angle X-ray scattering (SAXS)	SAXSpace camera (Anton Paar, Graz, Austria), X-ray Generator equipment (ISO-DEBYEFLEX3003, GE Inspection Technologies GmbH), closed water circuit (Chilly 35, HYFRA, Germany).