レーザ誘起脈絡膜血管新生のためのマウスモデル

サマリー

ここでは、マウスレーザー誘導性脈絡膜新生血管(CNV)プロトコル、つまり血管新生加齢黄斑変性症(AMD)の血管特性を再現する実験モデルを紹介します。習得すれば、CNVをモデルシステムとして確実かつ効果的に誘導し、さまざまな実験手段を試験することができます。

要約

マウスレーザー誘発脈絡膜新生血管(CNV)モデルは、血管新生加齢黄斑変性症(AMD)研究の重要な主力モデルとなっています。RPEとブルッフ膜に標的レーザー損傷を投与することにより、この手順は血管新生を誘導し、血管新生AMDで観察される特徴的な病理をモデル化します。

最初にヒト以外の霊長類で開発されたレーザー誘起CNVモデルは、他の多くの種にも実装されるようになりました。その中でも最も新しいのがマウスです。マウス実験は、費用対効果が高く、実験をはるかに速いタイムラインで実行でき、さまざまなトランスジェニックモデルの使用が可能です。しかし、マウスの目の小型化は、施術を行う際に特に課題となります。網膜を視覚化するために目を操作するには、レーザーを操作するための手と目と足の同時協調性だけでなく、優れた器用さのスキルの練習が必要です。ただし、一度習得すると、このモデルは、分子メカニズム、遺伝子操作の影響、薬物治療効果など、血管新生AMDの多くの側面の研究に適用できます。

レーザー誘起CNVモデルは有用ですが、病気の完全なモデルではありません。野生型のマウスの眼はそれ以外は健康であり、絨毛網膜環境はヒトAMDの病理学的変化を模倣していません。さらに、損傷による血管新生は、AMDのように加齢性および慢性疾患状態で発生する血管新生と同じ経路を反映していません。

その欠点にもかかわらず、レーザー誘起CNVモデルは、血管新生AMDの衰弱性病理を研究するために現在利用可能な最良の方法の一つです。その実施により、AMDの病因のより深い理解がもたらされ、現在利用可能な多くのAMD治療法の開発に貢献しています。

概要

加齢黄斑変性症（AMD）は50 ^1-3歳以上の個人における失明の主要な原因の1つです。萎縮（「ドライ」）AMDおよび血管新生（「ウェット」）AMD：AMDは二つの形態に分類することができます。前者は、後者は、漏れ、出血および線維症を引き起こす外網膜層への脈絡膜の異常な血管の侵入によって特徴付けられる一方で、網膜色素上皮（RPE）、脈絡毛細管板、及び光受容体の地図状萎縮によって特徴付けられ、最終的にされています失明^1,2につながります。二つの形式のうち、血管新生AMDは失明¹の大半を占めています。その萎縮相手には現在医療^{3を証明し}たのに対し、幸いなことに、この形式は、非常に多くの効果的な薬理学的管理の選択肢を持っていません。血管新生型が容易に動物モデルにおいて再降伏されているため、また、それは基本Aのより広くアクセス可能となっています新しい治療法^{4を開発するために} 、基礎となる病理学的メカニズムを探求するのMD研究。

実験的脈絡膜新生血管（CNV）の最初の動物モデルは、ライアンらによって開発されました。ヒト以外の霊長類^5インチこのモデルは、血管新生AMDに見られるものと同様の血管新生が生じる局所炎症反応を引き起こしたレーザー光凝固を介してブルッフ膜の破裂を誘発しました。血管形成後のレーザー誘導の組織病 ​​理学的進行は、モデルの妥当性^{を確認した6}血管新生AMDを、模倣することが判明しました。非ヒト霊長類は、ヒトに最も類似の解剖学的構造を提供していますが、残念ながら、簡単に遺伝子操作することができない、維持するために高価であり、疾患の進行⁷の遅い時間経過しています。対照的に、げっ歯類モデルは、はるかに費用対効果を維持するためであり、遺伝的に比較的容易に操作することができ、はるかに高速COUを持ちます疾患進行のRSE（実験はヶ月対週間の時間スケールで実施することができます）。それはアルビノ動物において視覚化することは非常に困難であるように、これらの実験は、着色されたげっ歯類において実施されるべきです。

後半に最初90の¹⁰でカンポキアーログループによって開発されたマウスのレーザー誘発CNVモデルは、最近の研究^11-16の大部分において支配的な動物モデルに成長しました。 CNVのさらに複雑で不明瞭な病因に、レーザーモデルは、将来のヒトへの使用のための新しい治療法を評価するには、血管新生を駆動する分子メカニズムを研究に至るまで、滲出型AMDの研究のすべての側面に適用されています。例えば、サクライら 。そして、エスピノサ・Heidmann ら 。トランスジェニックマウスおよび薬理学的枯渇治療^{15,16を使用して} CNVの発症に対するマクロファージの影響を調査するために、レーザーモデルを使用した。ジアーニら 。 Hoerster らと。画像を用いた光コヒーレンストモグラフィー（OCT）レーザー誘発CNVの進行を特徴づけるとOCTイメージング^12,17に見られる所見に組織病 ​​理学的所見を比較するための努力にCNV。最後に、抗血管新生剤の硝子体内注射を含む研究は、ヒトでの試験のための前提条件として使用され、血管新生AMD今日^10,18,19の管理に使用される抗VEGF薬の第一世代の開発に不可欠であったされています。

実験的CNVのための代替モデルは、CNVを誘導するための外科的方法を利用します。この手順では、血管新生^{8,20の原因となる}ことを目標に、血管新生AMDに見られる増加したVEGF発現を模倣するために血管新生促進物質（VEGF、RPE細胞および/ ​​またはポリスチレンビーズの網膜下注射を過剰発現例えば組換えウイルスベクター）を注入することを含みます。しかしながら、この方法は、血管新生のより低い発生率を大幅にもたらします。これらの研究は、CNVであることを示しましたC57 / BL6マウスは、マウス^8,14の同系統のレーザ光 ​​凝固法で見られる〜70％の成功率対注射の31％で発生します。これらの理由から、および非ヒト霊長類対げっ歯類を使用することの利点を与え、レーザー誘発CNVのマウスモデルは、ほとんどの血管新生AMDの研究実験⁸ CNVのための標準的な動物モデルとなっています。

マウスの目はで動作するように非常に小さい、繊細な組織です。網膜を視覚化する目の操縦は困難であり、習得が達成されるまで、多くの練習が必要です。このタスクは、それが優勢および非利き手で学習しなければならないという事実によって複雑になります。網膜を可視化するために必要な細かい動きが学習された後さらに、両手レーザーを作動フットペダルとの間の連携が重要です。本稿では、レーザー誘発CNV P​​ROCに関わる物理的な操作のすべてを学習する課題を蒸留しようとしましたオペレータは、このモデルで迅速な成功を達成するの​​を助けることになるガイドにedure。

プロトコル

全ての動物は、実験動物の管理と使用2013年版のガイドに従って処理され、ビジョンと眼科（ARVO）の眼科と視覚研究における動物の使用のための声明の研究のための協会、および動物実験によって承認されましたお手入れとノースウェスタン大学のための使用に関する委員会。

注意：次の手順は、1つの演算子で完全に行うことができます。しかし、より効率的に応じて分割するタスクを2つの演算子を用いて行われます。

1.レーザーとプリレーザー駅を準備

1. それは簡単にアクセスすることができ、レーザスリットランプを配置します。レーザーをオンにして、事前に決定されたパラメータ（例えば、75μmのスポットサイズ、100 mWのパワー、100ミリ秒の持続時間）に設定してください。
   注意：オペレータは、すべての動物、レーザー安全保護具及び適切なレーザー安全標識は、処置室の外に表示されている身に着けていることを確認。
   1. いずれの実験動物を使用する前に、キャリブレーション、非実験マウスを使用して理想的なパラメータを見つけます。レーザパラメータは、使用するレーザに依存するであろう。理想のパラメータが適切に焦点を当てたときに一貫して「バブル」形成を引き起こす最も低いレーザパワーの設定によって定義されています。適切な「バブル」形成を伴う病変の例は、ビデオを参照してください。
2. 麻酔、暖かい動物、組織ワイプ、およびすべての目薬（トロピカミド、テトラカイン、および人工涙液）がオペレータに手の届くところに簡単になるように事前にレーザーステーションを準備します。
   1. 暖かいその動物を確保することは、麻酔誘発性低体温を回避するために、第1のマウスに麻酔薬を注入する前に、温度（37°C）を修正するために予備加熱されます。
3. それは熱を保持し、レーザー手順が始まると暖かく保つことができるので、暖かい上でマウスの段階を置きます。

2.マウスの麻酔とプリレーザー準備

1. 注入前に麻酔をる、それは奇形や角膜の明瞭さ（例えば白内障）を減少させる異常を持っていないことを確認するために、巨視的に目を検査します。
2. マウスを計量。
3. 記録体重、性別、および動物ID番号。
4. 体重を使用して、機関によって与えられたガイドラインに基づいて、使用する麻酔薬の適切な量を計算する（例えば100ミリグラム/ kgの塩酸ケタミン、10mg / kgのキシラジンまたはトリブロモエタノールの250mg / kgで、20グラムのマウスのための0.20ミリリットルキシラジン/ケタミンカクテルを注入トリブロモエタノールのOR 0.25ミリリットル）。数学的なエラーを低減するために、1グラム単位で重量当たりの予め計算された投与量のテーブルがあります。
5. 首筋マウスとステップ2.4​​での計算に基づいて腹腔内に麻酔薬を注入します。
6. 暖かい動物の上でマウスを置き、マウスが完全につま先のピンチ（約3-5分）を介してペダル反射を確認することによって麻酔されるまで待ちます。
7. ワイプ組織をロールアップし、aspiratを防止するために、マウスの鼻の領域を保護液体ロールオフのイオン。ロールの側でマウスおよび局所麻酔のためにそれぞれの眼に塩酸テトラカインの低下（約30μl）を配置します。解決策を有効にするために2分を待ちます。
8. 瞳孔散大のための局所トロピカミドの一滴と手順を繰り返し2.7。また、拡張のためのフェニレフリン塩酸塩（2.5％）を使用します。
9. ソリューションを有効にするために2分待ち。この時間の間に暖かい上の動物を維持します。
10. 適切な時間が経過した後、すぐにマウスステージ上にマウスを置いて、スリットランプの顎当て上の段階を置きます。
11. 最低光の明るさにスリットランプをオンにして、瞳孔散大の程度を確認します。瞳が十分に（約2.5〜3ミリメートル）を拡張していない場合は、暖かい動物にマウスを返し、待ちます。また、トロピカミドの別のドロップを管理します。目が十分に拡張すると、レーザーの手順に進みます。

3.レーザー手順

注：他のPを確認してくださいersons部屋にレーザーで保護されたスリットランプアイピースから離れるとき保護用眼鏡を着用

1. それは理想的な視神経の可視化（3.1.2を参照）のために配置されるように、マウスステージ上のマウスの位置を調整します。
   1. それが水平になるよう、他の1つの側に頭と尾と、ランプの光をスリットに垂直なホルダー上でマウスを向けます。理想的なマウスの配置は、カバースリップが適用されると非常に簡単視神経の可視化を行います。
   2. それはレーザーオペレータに近いヘッドで〜170°の角度になるようにマウスをわずかに回します。
   3. そのマウスは、ランプをスリットにできるだけ近いが、それでもそれは安定しており、どこにオペレータの手が細かい操作のための十分なスペースを持っています位置に確認してください。
2. マウスが理想的に配置された後、25ミリメートル×25ミリメートルのガラスカバースリップ上の人工涙液の一滴を置きます。
   1. マウスのOPPに人工涙液の一滴を置きosite目 - この目が水和されていることを確認し、白内障形成を遅らせるのに役立ちます。
3. 親指とポインタ指の間カバーグラスの角を持ち、位置ガラスは両方の指の先端との間で圧搾されるようになっています。
4. 優しくサポートと手の安定化のために、動物の体の周り残りの3本の指を包みます。位置手ようにカバーガラスを容易に、マウスの眼に配置することができます。
   1. 手首は​​手の震えを減少させるために、しっかりした面に安定していることを確認してください。
5. 安定した位置が得られると、慎重にマウスの眼に（まだ付着した人工涙の滴で）カバーガラスを押してください。
   1. カバーガラスは、レーザ光散乱または反射を防止するために、レーザービームにできるだけ垂直に位置づけされていることを確認します。カバースリップは、角膜を平坦化するコンタクトレンズとして機能します。
6. トグルUNT集中スリットランプを通って、フリーハンドで見てIL網膜を可視化することができます。網膜は可視化位置に応じて淡黄色/赤色を持っていますが、明確な、赤い血管が見えるようになります。
7. ゆっくりと慎重に視神経を視覚化するまで、マウスの頭部および/またはカバースリップを操作します。視神経は、それから放射複数の容器と色が黄色になります。
8. オペレータは視神経の可視化を確認した後、ビームを集束レーザーをオンにします。
9. レーザービームがオンにされた後、所望の位置に（視神経から約1ディスク径）ビームを集束レーザーを操縦。
10. 眼底のRPEにレーザー光の焦点を合わせます。適切な焦点は、最も鮮明かつ明確なレーザービームを有することにより達成されます。ビームを目指している場合は、楕円形やフォーカス、トグルスリットランプフォーカスまたは再位置カバーガラスの外に見えます。
11. 照準ビームがRPEに集束されると、レーザーの足のトリガーを用いたレーザ管理を開始します。
    1. 眼内彼を防止するために、網膜血管を避けてくださいmorrhage。
12. すぐにレーザー投与後の泡の出現を監視します。レーザーショットの輪郭がはっきりとどのような方法でかすんでいないでなければなりません。
    1. レーザーショットは、泡の形成をもたらさない場合、または衝撃の面積は（対成功した影響を明確に、はっきりと定義された境界線不明確な円形境界線で曇った外観）かすんで見える、または出血がレーザー投与後に見られている場合、しないでください将来の分析のためにこれらの病変が含まれます。
13. 繰り返しは、すべての希望CNV位置の3.10から3.12（通常は3で、6、9、および視神経の周りの12時の位置）を繰り返します。レーザー誘導は、視神経からほぼ同じ距離で適用された場合、リフォーカスは必要ありません。しかし、マウスの眼の網膜に存在する可能性が小さい変動の強い曲率に、ビームを再集束することは連続したレーザー投与の間必要になることがあります。
14. ノートブックのレコードの電子の位置と結果ACHのレーザーショットの管理と結果（成功、かすんで、出血など ）、眼用の各投与ショットの。使用しないときは、スタンバイモードでレーザーを配置してください。
15. 必要に応じて安定化して、新しいカバースリップのための反対側の手を使用して、マウスのもう片方の目のための3.1から3.14を繰り返します。
16. すべての所望のレーザショットが投与された後、レーザーをオフにして、スリットランプを。
17. カバースリップを破棄し、麻酔からの回復のための暖かい上にマウスを置きます。肉眼傷害のために目を検査し、水和目を維持し、潜在的に将来の白内障の発症を予防するために人工涙液の液滴を配置します。マウスは麻酔から回復した後、ケージに戻します。

	AVERTIN	AVERTIN	AVERTIN	XYL / KET	XYL / KET
マウスの重量（g）	用量（MG /キログラム）	溶液濃度（mg / mlで）	麻酔投与量（ミリリットル）	用量（MG /キログラム）	麻酔投与量（ミリリットル）
15	250	20	0.1875	100mgの/ kgのケタミンを、 10mg / kgのキシラジン	0.15
16	250	20	0.2	100mgの/ kgのケタミンを、 10mg / kgのキシラジン	0.16
17	250	20	0.2125	100mgの/ kgのケタミンを、 10mg / kgのキシラジン	0.17
18	250	20	0.225	100mgの/ kgのケタミンを、 10mg / kgのキシラジン	0.18
19	250	20	0.2375	100mgの/ kgのケタミンを、 10mg / kgのキシラジン	0.19
20	250	20	0.25	100mgの/ kgのケタミンを、 10mg / kgのキシラジン	0.2
21	250	20	0.2625	100mgの/ kgのケタミンを、 10mg / kgのキシラジン	0.21
22	250	20	0.275	100mgの/ kgのケタミンを、 10mg / kgのキシラジン	0.22
23	250	20	0.2875	100mgの/ kgのケタミンを、 10mg / kgのキシラジン	0.23
24	250	20	0.3	100mgの/ kgのケタミンを、 10mg / kgのキシラジン	0.24
25	250	20	0.3125	100mgの/ kgのケタミンを、 10mg / kgのキシラジン	0.25
26	250	20	0.325	100mgの/ kgのケタミンを、 10mg / kgのキシラジン	0.26
27	250	20	0.3375	100mgの/ kgのケタミンを、 10mg / kgのキシラジン	0.27
28	250	20	0.35	100mgの/ kgのケタミンを、 10mg / kgのキシラジン	0.28
29	250	20	0.3625	100mgの/ kgのケタミンを、 10mg / kgのキシラジン	0.29
30	250	20	0.375	100mgの/ kgのケタミンを、 10mg / kgのキシラジン	0.3

表1：XyIKet投与チャート。

結果

CNV病変の定量化は、CNVの血管を標識するために免疫蛍光染色を使用してフラットマウント脈絡膜の分析を介して実行することができます。組織標本の二つの最も頻繁に使用される方法は、すぐに動物の犠牲、または内皮細胞のマーカーで死後の免疫染色の前に灌流を介して行わFITC-デキストランラベルです。これらの方法の両方を詳細^13,14,21に以前に記載されている、それぞれ、それぞれの1及び2に示す例を図 。共焦点顕微鏡画像を取得した後、領域（2次元）またはボリューム（3次元）のいずれかを計算することができ、ImageJソフトウェアまたはVolocityで可視化しました。定量化に加えて、OCT画像は 、生体内でのCNV病変を可視化するために使用することができます。得られたCNV ​​と網膜の断面画像の一例が図3に示されています。

ディスカッション

成功したレーザー誘導後にレーザ送出し、得られたCNV病変の発達に影響を与えることができ、複数の要因があります。これらの要因には、のために制御し、最も信頼性の高い結果を得るために標準化されるべきです。これらの要因の中で最も適切なマウスの選択（遺伝子型、年齢、性別）、麻酔薬の選択、及びレーザーの設定です。

使用される特定のマウスモデルは、CNVの開発の過程に大きな影響を与えることができます。最も広く使用されている遺伝子型C57BL / 6マウスです。動物が得られるから、ベンダーは、得られたCNVの大きさに影響を与えることができます。悪いら。タコのマウスは他の二つのベンダー⁴よりCNVかなり大きな発展と、ジャクソン、チャールズ川、そしてタコの研究室からのC57BL / 6マウスでは、最終的なCNV病変の大きさの有意差を示しました。そのため、一つの会社から購入し、その同じベンダーからのすべてのマウスを使用すると、外部の差を最小にするのに役立ちますCNV病変サイズの。マウスの年齢および性別も実験を設計する際に考慮すべき重要な因子であることが示されています。メスのマウスは...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
532 nm(緑)アルゴン眼科用レーザー	IRIDEX	GLx	任意の眼科用532 nm(緑)アルゴンレーザーは、
スリットランプ	カールツァイス	30SL-M	互換性がある限り、任意のスリットランプを使用することができます
	麻酔薬を作るために使用される	Sigma	T48402-25G
tert-アミルアルコール	Sigma	152463-1L	薬を作るために使用します
琥珀色のガラスバイアル+セプタ	ートン	WH-223696	トリブロモエタノール貯蔵
ティッシュワイプVWR		82003-820	その他
1% トロピカミド	ファルコン ファーマシューティカル	RXD2974251	瞳孔拡張
0.5% テトラカイン 塩酸塩	アルコン	0065-0741-12	局所麻酔
人工涙液	アルコン	58768-788-25	水分補給
熱療法ポンプ(動物温暖化用)	ケントサイエンティフィック	HTP-1500	体温保
温パッド	トサイエンティフィック	TPZ-0510EA	動物の体温を維持します
30Gインスリン針		328418	IP麻酔注射
スケール	体重計	AWS-1KG-BLK	マウス計量
カバースリップ(25 mm x 25 mm)	VWR	48366089	膜を平らにしてマウスの網膜を視覚化します
xylazine		機関から得られる	麻酔
タミン	から	得られる 麻酔から得られる	Volocity
	PerkinElmer		積測定再構築に使用される
ImageJ	画像解析に使用した	国立衛生