レーザ誘起脈絡膜血管新生のためのマウスモデル

サマリー

ここでは、マウスレーザー誘導性脈絡膜新生血管(CNV)プロトコル、つまり血管新生加齢黄斑変性症(AMD)の血管特性を再現する実験モデルを紹介します。習得すれば、CNVをモデルシステムとして確実かつ効果的に誘導し、さまざまな実験手段を試験することができます。

要約

マウスレーザー誘発脈絡膜新生血管(CNV)モデルは、血管新生加齢黄斑変性症(AMD)研究の重要な主力モデルとなっています。RPEとブルッフ膜に標的レーザー損傷を投与することにより、この手順は血管新生を誘導し、血管新生AMDで観察される特徴的な病理をモデル化します。

最初にヒト以外の霊長類で開発されたレーザー誘起CNVモデルは、他の多くの種にも実装されるようになりました。その中でも最も新しいのがマウスです。マウス実験は、費用対効果が高く、実験をはるかに速いタイムラインで実行でき、さまざまなトランスジェニックモデルの使用が可能です。しかし、マウスの目の小型化は、施術を行う際に特に課題となります。網膜を視覚化するために目を操作するには、レーザーを操作するための手と目と足の同時協調性だけでなく、優れた器用さのスキルの練習が必要です。ただし、一度習得すると、このモデルは、分子メカニズム、遺伝子操作の影響、薬物治療効果など、血管新生AMDの多くの側面の研究に適用できます。

レーザー誘起CNVモデルは有用ですが、病気の完全なモデルではありません。野生型のマウスの眼はそれ以外は健康であり、絨毛網膜環境はヒトAMDの病理学的変化を模倣していません。さらに、損傷による血管新生は、AMDのように加齢性および慢性疾患状態で発生する血管新生と同じ経路を反映していません。

その欠点にもかかわらず、レーザー誘起CNVモデルは、血管新生AMDの衰弱性病理を研究するために現在利用可能な最良の方法の一つです。その実施により、AMDの病因のより深い理解がもたらされ、現在利用可能な多くのAMD治療法の開発に貢献しています。

概要

加齢黄斑変性症（AMD）は50 ^1-3歳以上の個人における失明の主要な原因の1つです。萎縮（「ドライ」）AMDおよび血管新生（「ウェット」）AMD：AMDは二つの形態に分類することができます。前者は、後者は、漏れ、出血および線維症を引き起こす外網膜層への脈絡膜の異常な血管の侵入によって特徴付けられる一方で、網膜色素上皮（RPE）、脈絡毛細管板、及び光受容体の地図状萎縮によって特徴付けられ、最終的にされています失明^1,2につながります。二つの形式のうち、血管新生AMDは失明¹の大半を占めています。その萎縮相手には現在医療^{3を証明し}たのに対し、幸いなことに、この形式は、非常に多くの効果的な薬理学的管理の選択肢を持っていません。血管新生型が容易に動物モデルにおいて再降伏されているため、また、それは基本Aのより広くアクセス可能となっています新しい治療法^{4を開発するために} 、基礎となる病理学的メカニズムを探求するのMD研究。

実験的脈絡膜新生血管（CNV）の最初の動物モデルは、ライアンらによって開発されました。ヒト以外の霊長類^5インチこのモデルは、血管新生AMDに見られるものと同様の血管新生が生じる局所炎症反応を引き起こしたレーザー光凝固を介してブルッフ膜の破裂を誘発しました。血管形成後のレーザー誘導の組織病 ​​理学的進行は、モデルの妥....

プロトコル

全ての動物は、実験動物の管理と使用2013年版のガイドに従って処理され、ビジョンと眼科（ARVO）の眼科と視覚研究における動物の使用のための声明の研究のための協会、および動物実験によって承認されましたお手入れとノースウェスタン大学のための使用に関する委員会。

注意：次の手順は、1つの演算子で完全に行うことができます。しかし、より効率的に応じて分割するタスクを2つの演算子を用いて行われます。

1.レーザーとプリレーザー駅を準備

1. それは簡単にアクセスすることができ、レーザスリットランプを配置します。レーザーをオンにして、事前に決定されたパラメータ（例えば、75μmのスポットサイズ、100 mWのパワー、100ミリ秒の持続時間）に設定してください。
   注意：オペレータは、すべての動物、レーザー安全保護具及び適切なレーザー安全標識は、処置室の外に表示されている身に着けていることを確認。
   1. いずれの実験動物を使用する前に、キャリブレーション、非実験マウスを使用して理想的なパラメータを見つけます。レーザパラメータは、使用するレーザに依存するであろう。理想のパラメータが適切に焦点を当てたときに一貫して「バブル」形成を引き起こす最も低いレーザパワーの設定によって定義されています。適切な「バブル」形成を伴う病変の例は、ビデオを参照してください。
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結果

CNV病変の定量化は、CNVの血管を標識するために免疫蛍光染色を使用してフラットマウント脈絡膜の分析を介して実行することができます。組織標本の二つの最も頻繁に使用される方法は、すぐに動物の犠牲、または内皮細胞のマーカーで死後の免疫染色の前に灌流を介して行わFITC-デキストランラベルです。これらの方法の両方を詳細^13,14,21に以前に記載されている、それぞれ、それぞれの1及び2に示す例を図 。共焦点顕微鏡画像を取得した後、領域（2次元）またはボリューム（3次元）のいずれかを計算することができ、ImageJソフトウェアまたはVolocityで可視化しました。定量化に加えて、OCT画像は 、生体内でのCNV病変を可視化するために使用することができます。得られたCNV ​​と網膜の断面画像の一例が図3に示されています。

ディスカッション

成功したレーザー誘導後にレーザ送出し、得られたCNV病変の発達に影響を与えることができ、複数の要因があります。これらの要因には、のために制御し、最も信頼性の高い結果を得るために標準化されるべきです。これらの要因の中で最も適切なマウスの選択（遺伝子型、年齢、性別）、麻酔薬の選択、及びレーザーの設定です。

使用される特定のマウスモデルは、CNVの開発の過程に大きな影響を与えることができます。最も広く使用されている遺伝子型C57BL / 6マウスです。動物が得られるから、ベンダーは、得られたCNVの大きさに影響を与えることができます。悪いら。タコのマウスは他の二つのベンダー⁴よりCNVかなり大きな発展と、ジャクソン、チャールズ川、そしてタコの研究室からのC57BL / 6マウスでは、最終的なCNV病変の大きさの有意差を示しました。そのため、一つの会社から購入し、その同じベンダーからのすべてのマウスを使用すると、外部の差を最小にするのに役立ちますCNV病変サイズの。マウスの年齢および性別も実験を設計する際に考慮すべき重要な因子であることが示されています。メスのマウスは.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
532 nm(緑)アルゴン眼科用レーザー	IRIDEX	GLx	任意の眼科用532 nm(緑)アルゴンレーザーは、
スリットランプ	カールツァイス	30SL-M	互換性がある限り、任意のスリットランプを使用することができます
	麻酔薬を作るために使用される	Sigma	T48402-25G
tert-アミルアルコール	Sigma	152463-1L	薬を作るために使用します
琥珀色のガラスバイアル+セプタ	ートン	WH-223696	トリブロモエタノール貯蔵
ティッシュワイプVWR		82003-820	その他
1% トロピカミド	ファルコン ファーマシューティカル	RXD2974251	瞳孔拡張
0.5% テトラカイン 塩酸塩	アルコン	0065-0741-12	局所麻酔
人工涙液	アルコン	58768-788-25	水分補給
熱療法ポンプ(動物温暖化用)	ケントサイエンティフィック	HTP-1500	体温保
温パッド	トサイエンティフィック	TPZ-0510EA	動物の体温を維持します
30Gインスリン針		328418	IP麻酔注射
スケール	体重計	AWS-1KG-BLK	マウス計量
カバースリップ(25 mm x 25 mm)	VWR	48366089	膜を平らにしてマウスの網膜を視覚化します
xylazine		機関から得られる	麻酔
タミン	から	得られる 麻酔から得られる	Volocity
	PerkinElmer		積測定再構築に使用される
ImageJ	画像解析に使用した	国立衛生

を使用することができます は、レーザートリブロモエタノールと 麻酔ムウィズ 動物のケンはBD アメリカン角、ケ、機関 容研究所