生成CRISPR / Cas9媒介1アレル欠失マウス胚性幹細胞でエンハンサー機能を研究するために、

サマリー

エンハンサー活性の実験的検証は、機能喪失分析によって最もよくアプローチされます。ここで紹介するのは、CRISPR/Cas9を介した欠失を使用して、ハイブリッドゲノム(Mus musculus¹²⁹ x Mus castaneus)を含むF1 ES細胞における遺伝子転写の対立遺伝子特異的調節を研究する効率的なプロトコルです。

要約

Enhancersは、組織特異的な遺伝子発現を位置と向きに依存しない方法で制御することにより、細胞の同一性を制御します。これらのエンハンサーは、多くの場合、遺伝子間領域の調節遺伝子から遠位に位置したり、別の遺伝子の体内にさえ位置します。エンハンサー活性の位置に依存しない性質により、エンハンサーをそれらが調節する遺伝子と一致させることは困難です。エンハンサー領域の欠失は、エンハンサー活性の直接的な証拠を提供し、内因性遺伝子転写におけるエンハンサーの役割を明らかにするためのゴールドスタンダードです。従来の相同組換えに基づく欠失法は、近年のゲノム編集技術の進歩により、多数のモデル生物のゲノムを迅速かつ正確に位置特定することが可能になりました。CRISPR/Cas9を介したゲノム編集は、特注の発現プラスミドからのガイドRNAによってCas9をゲノムに標的化することが容易であるため、多くの細胞タイプや生物のゲノムを迅速かつコスト効率よく操作するために使用できます。必須遺伝子調節要素のホモ接合性欠失は致死性につながるか、細胞表現型を変える可能性がありますが、転写エンハンサーのモノアレル欠失は、この交絡問題なしに遺伝子発現のシス調節の研究を可能にします。ここに提示されるのは、F1マウス胚性幹(ES)細胞(Mus musculus¹²⁹ x Mus castaneus)におけるCRISPR/Cas9媒介欠失のプロトコルです。モノアレルの欠失、スクリーニング、および発現解析は、これらの細胞で平均125 bpごとに発生する2つの対立遺伝子間の一塩基多型(SNP)によって促進されます。

概要

転写調節エレメントは、異常な遺伝子発現²に起因する疾患をもたらし得る発展¹およびこれらの要素の変更時の遺伝子発現の時空間微調整のために重要です。ゲノムワイド関連解析により同定された多くの疾患関連領域は非コード領域にあり、転写エンハンサー^3-4の機能を備えています。エンハンサーを特定し、彼らはしばしば、数キロベース離れて、彼らが調節する遺伝子から位置しており、組織特異的様式^5-6で活性化することができるように複雑である調節する遺伝子とそれらをマッチング。エンハンサー予測は一般にヒストン修飾マーク、メディエーターコヒーシン複合体に基づいており、細胞型特異的転写因子^7-10の結合されています。予測エンハンサーの検証は、ほとんどの場合、エンハンサーは、レポーター遺伝子^11-12の発現を活性化するベクトルベースのアッセイを介して行われます。これらのデータは、Vを提供します推定されるエンハンサー配列の規制の可能性についてaluable情報が、それらの内因性のゲノムのコンテキストでそれらの機能を明らかにするまたはそれらが調節する遺伝子を特定するものではありません。ゲノム編集が機能喪失分析によってそれらの内因性コンテキスト内の転写調節エレメントの機能を研究するための強力なツールとして機能します。

ゲノム編集、すなわち、CRISPR / Cas9ゲノム編集システム....

プロトコル

1.設計とgRNAを構築

1. 転写エンハンサー領域は2 gRNAs、関心領域の1の5 '及び1 3'を使用して削除します。 （http://www.genome-engineering.org ^15）ユニークなgRNA配列を同定するために張研究室で生成されたマウスのUCSCゲノムブラウザトラックを使用します。次にこれらのgRNAsとサンガー研究所^{（www.sanger.ac.uk/sanger/Mouse_SnpViewer/rel-1211）27-28}が提供するオンラインツールを使用して、SNPおよびインデルのための彼らの隣接PAMを確認してください。同等の効率で両方の対立遺伝子を標的とするために、SNPやインデルを含んgRNA / PAMシーケンスを避けます。
   1. gRNAを選ぶ間、削除の遺伝子型を決定するための対立遺伝子特異的プライマーを設計の実現可能性を確認してください。対立遺伝子特異的プライマーの設計については、セクション5を参照してください。
2. マリら。2013 ¹⁵に記載されているプロトコルに基づいて2つのgRNAプラスミドを組み立てます。選択されたユニークな20 bp標的配列int型を組み込みます表7に示すように、61merオリゴヌクレオチドO（配列は5 'から3'方向に表示し、太字の塩基は、互いの逆相....

結果

ここで説明するプロトコルは、CRISPR / Cas9ゲノム編集（ 図1）を使用して生成された1アレルエンハンサー削除細胞における遺伝子発現のシス -regulationを研究するためにF1 ES細胞を使用しています。遺伝子型決定および遺伝子発現のためのgRNAおよび対立遺伝子特異的プライマーの設計は、このアプローチにおける重要な要因です。各対立遺伝子特異的プライマーセットは、対立遺伝子特異性を確認するために、定量PCRによって検証されなければなりません。唯一のそれぞれのゲノムDNA標的を増幅対立遺伝子特異的プライマーは、（ 図2）理想的です。理想的には、これらのプライマーは、その3 '末端にSNPを持っています。それらは誤った遺伝子型²⁵対正確なそれらの増幅を5 Ct値の差の最小値を表示する場合、以下の対立遺伝子特異性プライマーを使用することができます。 3 '端から4 ^番目の塩基よりも5'より多くのSNPを運ぶプライ.......

ディスカッション

CRISPR / Cas9媒介ゲノム編集技術は、ゲノム改変のための、簡単で迅速かつ安価な方法を提供します。機能的エンハンサー特徴付けのために1アレルエンハンサーの削除を生成し、分析するために、ここで具体的な方法は、F1マウス細胞におけるSNPを利用しています。このタイプのアプローチの利点は次のとおりです。1）1アレルエンハンサー欠失は重要なエンハンサーは、 すなわち 、両方の対立遺伝子から致死性を細胞につながる調節遺伝子のタンパク質レベルの大幅な削減を削除または変更されたときに発生する交絡効果を生成しません表現型; 2）1アレル欠失の頻度が低いホモ接合性欠失を取得している場合には可能性が低いです。しかし、遺伝子発現解析における対立遺伝子特異的プライマーを用いて、一方が1アレル欠失を有するクローンを分析することができます。 3）1アレルの欠失をスクリーニングするためのプライマーの4セットを使用すると、混乱の一部または大きな欠失を含むクローンの排除を可能にします下流分析。

対立遺伝子特異的なプライマーの設計は、ジェノタイピングモノ/二対立遺伝子CRISPR欠失および.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase	NEB	M0530S	gRNAアセンブリに使用されるハイフィデリティDNAポリメラーゼ
Gibson Assembly Master Mix	NEB	E2611L
gRNA_Cloning	Vector Addgene	41824	このベクターに標的配列をクローニングしてgRNAプラスミドを作成します
pCas9_GFP	Addgene	44719	Codon-optimized SpCas9 and EGFP共発現プラスミド
AflII	NEB	R0520S
EcoRI	NEB	R3101S
Neon Transfection System 100 µL Kit	Life Technologies	MPK10096	Microporator トランスフェクション技術
prepGEM	ZyGEM	PT10500	ゲノムDNA抽出試薬
Nucleo Spin Gel &PCRクリーンアップ	Macherey-Nagel	740609.5
高速プラスミドミニキット	Geneaid	PD300
Maxi Plasmid Kit エンドトキシンフリー	Geneaid	PME25
SYBR selected mix for CFX	Life Technologies	4472942	qPCR reagent
iScript cDNA synthesis kit	Bio-rad	170-8891	逆転写試薬
0.25% トリプシン with EDTA	Life Technologies	25200072
PBS without Ca/Mg2+	Sigma	D8537
0.5 MEDTA	Bioshop	EDT111.500
HBSS	Life Technologies	14175095
1 M HEPES	Life Technologies	13630080
BSA フラクション V (7.5%)	Life Technologies	15260037
最大効率 DH5α コンピテントセル	Invitrogen	18258012
FBS	ES セル		FBSは、マウスES細胞の多能性について事前に試験を受けています
DMSO	Sigma	D2650
Glutamax	Invitrogen	35050
DMEM	Life Technologies	11960069
Pencillin/Streptomycin	Invitrogen	15140
ピルビン酸ナトリウム	Invitrogen	11360
非必須アミノ酸	Invitrogen	11140
β-メルカプトエタノール	Sigma	M7522
96ウェルプレート	Sarstedt	83.3924
シーリングテープ	Sarstedt	95.1994
CoolCell LX	Biocision	BCS-405	アルコールフリー細胞凍結容器
CHIR99021	Biovision	1748-5	F1 ES細胞培養用阻害剤
PD0325901	Invivogen	inh-pd32	F1 ES細胞培養用
阻害剤 LIF	Chemicon	ESG1107	F1 ES細胞培養用阻害剤