私たちは3無傷の蝸牛ターン（頂点、ミドル、ベース）としてコルチ大人の臓器を分離する手法を提案します。また、蛍光タグ付き抗体で免疫染色するための手順を示しています。一緒に、これらの技術は、蝸牛に見出さ有毛細胞、支持細胞、および他の細胞型の研究を可能にします。
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この記事について
サマリー
要約
内耳の蝸牛に収容されているコルチの器官は、機械感覚有毛細胞と周囲の支持細胞を含み、それらはらせん状に組織化されており、音検出のためのトノトピック勾配を持っています。マウスの蝸牛の長さは約6mmで、分析のために3つのターン(頂点、中央、基部)に分割されることがよくあります。細胞の消失、細胞分裂、またはモザイク遺伝子の発現を調べるには、蝸牛の全体マウントまたは表面処理が有用です。この解剖法は、免疫染色および共焦点顕微鏡法と組み合わせてz軸の異なる平面で細胞を画像化することにより、コルチ器官内のすべての細胞を可視化することを可能にする。これらのzスタック画像から複数の光学断面積も取得できます。さらに、走査型電子顕微鏡法には、ホールマウント解剖法を使用できますが、別の固定方法が必要です。ここでは、コルチの臓器を無傷の3つの蝸牛ターン(頂点、中、基部)として分離する方法を紹介します。この方法は、生後1週間から成人期までのマウスに使用でき、蝸牛の石灰化が不完全な新生児サンプルに使用される手法とは異なります。わずかに変更されたバージョンは、ラット蝸牛の解剖に使用できます。また、蛍光標識付き抗体による免疫染色の手順も示しています。
概要
側頭骨内に含まれている内耳の螺旋状の蝸牛は、コルティ、哺乳類における聴覚感覚終末器官の器官を収容します。蝸牛はtonotopically編成、一般頂端、中間に分割され、基礎ベースの高周波音検出と頂点1における低周波検出に異なる周波数領域に対応するオン。れます有毛細胞、コルチ器官の機械刺激細胞は、マウス2,3で約6mmの長さである蝸牛の長さを実行します。これらの細胞は、中枢聴覚構造によって処理された神経信号に、液体で満たされた膜迷路を介して送信された音波の機械的エネルギーを変換します。ここに記載された技術は、蝸牛の石灰化は、（1週齢から成人期までのサンプルのため）が完了した後にコルチ器官の全体のマウントを製造する方法を提供します。また、immunostaための方法を提示全体ining蝸牛組織を搭載しています。蝸牛全体のマウントは、その自然の空間配置内のすべての有毛細胞と周囲の支持細胞の可視化のために重要であると共焦点顕微鏡を用いた三次元で分析が可能。
博士。ハンス・エングストロームハーローアデスは、もともと彼らは急速に顕微鏡分析4のためにコルチ器官の短い無傷のセグメントを維持し、固定し、哺乳類の様々な液体に浸さ石灰化蝸牛を分析する手法を詳述し1966年に全体のマウント蝸牛切開法を説明しました。未固定、石灰化したラットの蝸牛の解剖も教育ビデオ5に示されています。博士。バーバラBohneとワシン....
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プロトコル
倫理の声明：動物を対象とする手順は、医学のサザンイリノイ大学での施設内動物管理使用委員会によって承認されています。
頭骨の1の抽出
- マウスの頭蓋骨13のベースに頭骨を識別し、標準パターン鉗子を使用して脳神経を削り取ります。
- カプセル化された蝸牛を取り除くために、耳のカプセルの先端に、下後部三半規管に反対ハンドプレスの親指で標準パターン鉗子を置きます。
- 親指と人差し指で、または10.5センチメートル細かいハサミを使用して手動で頭蓋骨から頭骨の下半分を解放します。
2.ポストフィックス頭骨
- 10mMのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）pHが7.4とincubで希釈し、500μlの4％パラホルムアルデヒド（PFA） - 250を含む2 mlのマイクロ遠心チューブに頭骨を配置20時間 - 2 RTで食べました。
注：円形または楕円形のウィンドウにPFAの頂端キャップまたは注射のいかなる開口部は必要ありません。ガラスバイアル中に16％の濃度で購入することができ、メタノール無料、超純、電子顕微鏡（EM）グレードPFAを使用することをお勧めします。バイアルを開け、1に希釈された後：PBS中4 4 O C（いくつかの抗体は、短い固定等を必要とする/ O（O / Nを許容することができるで保存....
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結果
我々は、開発の出生後第1週の間に。の石灰化を図1に示すキー解剖の手順で、石灰化である蝸牛組織から3無傷の蝸牛ターン（頂点、ミドル、ベース）とコルチ器官を単離するための方法を提示マウス蝸牛は不完全であり、より簡単な切開方法13を使用することができます。新生児全体を使用すると、P7から蝸牛と涙とコルチ器官の細断の高齢マウスの結果と解剖法をマウントします。スパイラル靭帯/側壁は今より強固に結合しており、ダメージを与えることなく、離れ感覚上皮から剥離することはできません。このように「大人」全体マウント解剖方法は、P6より古いサンプルのために必要とされます。我々は解剖し、有毛細胞と支持細胞のマーカー（ 図2）を用いて免疫染色されたP15マウス蝸牛のミドルターンの例を提示します。光クロスセクションCまた、全体のマウント技術（ 図3）で得られたこと。
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ディスカッション
成功した全体のマウント解剖および免疫染色のためにいくつかの重要なステップがあります。これらの方法のいずれかが実行される前に、しかし、蝸牛組織の適切な固定が必要とされています。我々は、超純粋な遊離メタノール、EMグレードPFAを使用することをお勧めします。 PFAは、メタノールおよび免疫蛍光の品質を低下させる不安定なpH値の痕跡を持つことができる粉末から作られました。他のグループも同様の解剖ホルムアルデヒド14-16を含まない固定剤を使用して可能であることを示しました。固定の長さも重要であり、特異的な抗体です。他の人がPFAでわずか1時間（ただし、これは稀である）とうまく動作しませんがいくつかの抗体は、O / Nの固定を許容することができます。組織が崩壊してしまうよう下で固定した組織は、解剖法に問題がある可能性があります。我々の経験では3から4時間の固定が十分な固定を提供し、一般的に聴覚分野で使用される一次抗体の大半を妨げることはありません。
jove_contentは ">これは、EDTAは一次抗体に干渉する可能性もある。このようにいくつかの抗体は、新生児組織ではなく、P7または.......アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
開示事項
著者らは開示するものは何もない。
謝辞
この作業は、Office of Naval Research（N000141310569）からの助成金によって部分的に支援されました。南イリノイ大学医学部研究イメージング施設の機器は、National Center for Research Resources-Health(S10RR027716)の支援を受けました。
....アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 標準 パターン鉗子 | ファインサイエンスツール | 11000-12 | は他のベンダーから購入することができます |
| 10.5cmの細かいはさみ | ファインサイエンスツール | 14060-11 | は他のベンダーから購入することができます |
| 2mlの微量遠心チューブ | MidSci | AVSS2000 | は他のベンダーから購入することができます |
| 16%ホルムアルデヒド、メタノールフリー、超高純度、EMグレードの | ポリサイエンス | 18814 | TOXIC - 手袋を着用し、流しに捨てることはできません。他のベンダーから購入できます。 |
| PBSのpH 7.4 | シグマ | P3813-10PAK | は他のベンダーから購入することができます |
| EDTA | フィ | ッシャーBP118-500 | は他のベンダーから購入することができます |
| エンドオーバーエンドチューブローテーター | フィ | ッシャー05-450-127 | 他のベンダーから購入することができます |
| 60mmペトリ皿 | フィ | ッシャー50-202-037 | は他のベンダーから購入することができます |
| ダウコーニングシルガード184シリコーン封止材キット | エルスワース 接着剤 | 184 SIL ELAST キット 0.5KG | |
| 活性炭 | フィッシャー | AC134372500 | 他のベンダーから購入できます |
| ステレオ解剖顕微鏡 | ツァイス | ステミ 2000 | 他のベンダーから購入できます |
| デュモン #4 宝石商の鉗子 | ファイン サイエンス ツール | 11241-30 | |
| デュモン #5 宝石商の鉗子 | ファイン サイエンス ツール | 11251-20 | |
| 2.5 mm バンナス スプリングはさみ | ファイン サイエンス ツール | 15001-08 | 湾曲 |
| 5 mm Vannas-Tubingen スプリングはさみ | ファインサイエンスツール | 15003-08 | ストレート |
| 48 ウェルプレート | フィッシャー | 08-772-52 | 他のベンダーから購入可能 |
| 8 ウェルチャンバースライド | フィッシャー | 1256518 | 他のベンダーから購入可能 |
| トリトン X-100 | シグマ | X100-500 | 他のベンダーから購入可能 |
| BSA、フラクション V | Fisher | BP1605 | は他のベンダーから購入できます |
| NGS | Vector labs | S-1000 | は他のベンダーから購入できます |
| NHS | Vector labs | S-2000 | は他のベンダーから購入できます |
| 3Dローテーター | Midsci | R3D-710 | は他のベンダーから購入できます |
| Western blot incubation box XL | Licor | 929-97401 | |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | は他のベンダーから購入できます |
| Prolong gold antifade mounting media | Life Technologies | P36930 | は他のベンダーから購入できますが、マウントメディアは光退色から保護する能力が異なります |
| Superfrost Plus スライド | フィッシャー | 12-550-15 | 他のベンダーから購入できます |
| カバースリップ 22 x 22 x 1 | フィッシャー | 12-548-B | は他のベンダーから購入できます |
| クリアマニキュア | 地元のドラッグストア | は他のベンダーから購入できます | |
| 段ボールスライドフォルダー | フィ | ッシャー12-587-10 | は他のベンダーから購入できます |
| プラスチック製のスライドボックス | フィ | ッシャー03-448-10 | は他のベンダーから購入できます |
参考文献
- Robles, L., Ruggero, M. A. Mechanics of the mammalian cochlea. Physiol Rev. 81 (3), 1305-1352 (2001).
- Ehret, G., Frankenreiter, M. Quantitattive analysis of cochlear structures in the house mouse in relation to mechanisms of acoustical information process....
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