HIV誘導神経炎症のマウスモデルでは二光子顕微鏡を用いた脳血管のアーキテクチャの定量化

Summary

この論文は、in vivoおよびex vivoの2光子顕微鏡を使用して脳内の血管構造を定量化する方法について説明しています。

Abstract

Human Immunodeficiency Virus 1 (HIV-1) 感染は、頻繁にHIV-1関連神経認知障害 (HAND) を引き起こし、中枢神経系 (CNS) 内の慢性神経炎症状態を特徴とし、主にウイルスを介したミクログリアと脳内マクロファージの活性化によって引き起こされると考えられています。 HIV-1感染は脳血管血流(CBF)の変化も伴うため、HIV関連の慢性神経炎症がCBFや脳血管構造の変化につながる可能性が高まっている。この問題を解決するために、HIV誘発性神経炎症のマウスモデルを使用し、この炎症環境に長期間さらされると脳血管系が損傷し、毛細血管網の希薄化を引き起こすかどうかをテストしました。本稿では、神経炎症性疾患モデルマウス(HIV-1 Tat transgenic mics)における皮質毛細血管密度の変化を定量化する方法について述べる。 この一般化可能なアプローチは、薄い頭蓋骨皮質窓を介した皮質毛細血管のin vivo 2光子イメージングと、マウス脳切片の皮質毛細血管のex vivo 2光子イメージングを採用しています。これらの手順により、毛細血管ネットワークの画像とzスタックファイルがそれぞれ作成され、脳血管構造の変化を評価するために定量分析を行うことができます。

Introduction

ヒト免疫不全ウイルス1（HIV-1）ウイルス感染の急性期の間に脳に侵入し、かつ生産両方ミクログリア及び脳の常在マクロファージ、それらの活性化につながる感染 - 及び両方宿主由来の炎症性メディエーターおよび可溶性HIV-1の放出をそのような^（1,2に見直さ）Tatおよびgp120のようvirotoxins。その結果、慢性神経炎症状態は、HIV-1関連神経認知障害（手^）3-5の病因に寄与していると考えられるCNS、に設立されてしまいます。

HIV-1のTatまたはマウスのCNS ​​内のインターロイキン（IL）-17Aの慢性的過剰発現は、微小血管希薄^6,7をもたらすことが示されています。これには、慢性神経炎症が脳血管系への影響を介して手の病因に貢献するかもしれないという可能性を提起します。さらに、この問題を調べるために、我々は、脳血管STRUCを定量化する方法を開発しましたトゥーレス。

この論文では、セグメント長、総セグメントの長さを意味する毛細管の直径、及び薄い頭骨皮質窓を通して毛細管ネットワークのインビボイメージングに用いて全毛細管容積平均、毛細管ノード、キャピラリーセグメントの数を定量化するための方法を記載して（前述の修飾されましたプロトコル^）8,9、ならびに二光子顕微鏡を用いて脳切片の ex vivoイメージング。脳スライス内の毛細血管網の ex vivoイメージングは、三次元、完全な再構築を可能にしながら、in vivoでの薄頭蓋骨皮質ウィンドウは、脳環境の保全を可能にするので、この組み合わせアプローチは、脳血管のパラメータの全体的な定量を提供します毛細血管ネットワーク - 次に、市販のソフトウェアを用いて定量することができます。

Protocol

動物資源上ロチェスター大学の大学の委員会は、本論文で実行されたすべての手順を承認しました。

1.手術前の準備（およびマウス）

1. 必要なすべての機器と手術領域を準備します。事前に70％エタノールを使用して、手順の間に使用されるすべてのツールを滅菌します。必要に応じて、ツールを殺菌するためにガラスビーズ滅菌器やオートクレーブを使用します。
2. イソフルラン気化器に接続されたイソフルラン誘導チャンバー内にマウスを置きます。 1リットル/分の速度で4％イソフルランレベルを設定します。
   注意：アストロサイト固有のグリア線維性タンパク質（GFAP）プロモーター（HIVのTat-Tgマウス）で駆動ドキシサイクリン（DOX）誘導性HIV-1 Tatの導入遺伝子とここで報告された実験では、マウスで¹⁰ HIVの影響を調べるために使用されました以前に^{7,10に記載されているように} -1、脳血管構造の神経炎症を誘導しました。
3. 静かにマウスを観察するために、誘導室にチップ＆＃39; sの立ち直り反射。立ち直り反射が抑制された後、2％にイソフルランレベルを設定し、外科的なベンチでノーズコーンに誘導室からの空気流の方向を変えます。
4. すぐに水注入された加熱パッドに誘導室からマウスを移動します。ノーズコーンを介してイソフルラン（1.5から2パーセント）を適用し続けます。呼吸数（RR）モニタリングによって評価個々のマウスの許容範囲に応じて麻酔を調整します。
   注：RRのうつ病は脳の血流および血管径の評価を変更するガスの生理学的パラメータを乱すことができます。毎分55〜65呼吸の間RRを維持しようとしました。心拍数（HR）は、麻酔の深さを評価に使用することができます。血管径の生理学的変化を防止するために、毎分300〜450拍の間で人事を保ちます。一般的に、麻酔を与えられたマウスでは1リットル/分で1.5から2.0パーセントのイソフルランの間で十分です。
5. さらに、麻酔の深さを確認するためにつま先のピンチを実行します。マウスは、COMMが応答しない場合外科手術レンス。

薄頭蓋骨頭蓋窓の調製

1. マウスの目に人工涙ゲルを適用します。完全にハサミや電気かみそりを使用して、マウスの頭皮から髪を削除します。
2. ポビドンヨード溶液を適用することによって頭皮の殺菌。乾燥させます。その後、光学顕微鏡下で、完全にマーキング頭頂骨、尾正面の骨、およびブレグマを露出させ、マウスの頭皮から皮膚を除去。
3. 簡単に除去するための膜を乾燥させるために頭蓋骨に10％塩化第二鉄溶液の少量を適用します。静かに頭蓋骨をこすることによって＃45分の5鉗子で乾燥した膜を除去します。
4. ヘッドプレートウィンドウの周りに接着剤の薄層を適用します。静かにウィンドウの中央に関心領域を保ち、マウスの頭蓋骨に対してヘッドプレートを押してください。接着剤を重合するヘッドプレートに歯科用セメントの低下を適用します。
5. 薄く塗りますヘッドプレートウィンドウの端に沿って接着剤の生理食塩水を保持するリザーバを作成することができます。接着剤が乾燥した後、マウスのヘッドプレートハーネスにヘッドプレートをネジ止めします。
   注：この手順で使用したマウスのヘッドプレートハーネスは、金属ベースと二つの金属柱を持つ構造体です。各列の1春と1蝶ナットがあります。ヘッドプレートは、バネの上に配置され、ヘッドが水平であり、移動しなくなるまで蝶ナットが締め付けられます。
6. 6,000 rpmで設定microtorqueドリルに取り付けられたドリルビットを使用してヘッドプレートウィンドウから任意の接着剤を除去します。血管への構造的な損傷を与えることができ、マウスの頭蓋の過熱を防止するために、すべての10〜15秒を停止します。
   1. 新しいドリルビットを使用して、正中線（ヘッドプレートウィンドウの直径の三分の一）から横方向にmicrotorqueドリル1.5ミリメートルを配置します。 4,000 rpmで、この場所の周りに薄い頭蓋骨に開始します。直接的な下向きの圧力で頭蓋骨をそっとドリルを移動します。
   2. drilを中止マウスの頭蓋の過熱を防ぐために、玲ごとに10〜15秒。この時間の間に、圧縮空気の缶を使用して、蓄積された頭蓋骨のほこりを取り除きます。
   3. 5-10秒間頭蓋骨を冷却するためにRT生理食塩水の滴を使用してください。静かに頭蓋骨間伐を継続するために、軟組織とすべての液体を除去します。
7. 頭蓋骨の最終薄化のために、ヘッドプレートリザーバ内に生理食塩水の小さなボリュームを置き、軽く小さな血管がはっきりと見えるようになるまで関心のある領域にわたって歯科マイクロブレードを掃引。

生理的パラメータの3モニタリング

1. 頭蓋骨が完全に薄くされた後、ホルダーからマウスをデタッチし、その背中の上に置きます。ゆっくりはっきりと内側の太ももを露出するために、両方の後ろ足を下にテープで固定します。
2. ハサミや電気シェーバーで両方の内側の太ももの上に髪を削除します。ポビドンヨードで太ももを覆うことにより、手術部位を消毒します。
3. 大腿静脈上記内側右腿の皮膚をつまんで＃5ピンセットを使用して動脈。そっと上向きに皮膚を引っ張って皮膚をカットし、削除するためにハサミを使用しています。
   注：左大腿は、外科的合併症（血管奇形、破裂した血管）のイベントに予約されています。
4. 手術部位に0.9％生理食塩水の約3〜5滴を適用します。これは、血管のより大きな倍率だけでなく、血管のしっとりサイトを保ち、乾燥防止することができます。ぶっきらぼう2＃45分の5ピンセットを用いて大腿神経血管束に解剖することにより、動脈から大腿静脈を分離します。
5. 約1cm離れて大腿動脈の下手術用縫合糸の2、3センチメートルピースを置きます。カテーテル挿入時に過度の血液の損失を防ぐのに役立ちます血管止血帯を作成するために、上部の縫合糸を時計回りに回します。
6. 春のはさみを使用して大腿動脈に小さな切開を行います。カテーテルが動脈内に確実になるまで切開し、事前を通じて動脈にカテーテルを配置します。
7. が漏れ、適切なカテーテル留置のために評価するために、上部の縫合糸（止血帯を）のねじれを広げ。縫合糸を使用して血管内にカテーテルの周りに2ノットを結ぶことにより、大腿動脈にカテーテルを固定します。
8. 血液凝固を防ぐために、カテーテルを介してヘパリンを10μl（100 IU / ml）を注入します。次に、外科的に単純な中断パターンで4-0縫合糸と一緒に皮膚を縫合することにより、右腿を閉じます。
9. 腹腔内に右下腹部にウレタンを50μl（1.2ミリグラム/ g）を注入します。五分後に腹腔内ウレタン100μlの合計左下腹部に別の50μlの注入を繰り返します。同時に、麻酔の深さのために、マウスを再確認しながら、ゆっくりと約0.25％にイソフルランレベルを減少させます。
   注：それは腸を穿孔しないように後部腹壁に沿って腹腔内表面的な針を保管してください。これは、腹部直筋ムーをつまんで達成することができます離れて内臓から、その後注入scles。
10. 毛細管を使用して、カテーテルから動脈血の40μlのサンプルを収集します。生理食塩水で満たされた、四方コックとヘパリンを充填した注射器を装着し、血圧トランスデューサにカテーテルを取り付けます。
11. カテーテルの意図しない取り外しを防止するための外科用装置に血圧トランスデューサをテープ。平均動脈圧の監視を開始します。
12. 血液ガス分析装置の入口ポートへの血液充填したキャピラリーチューブを挿入します。すべての血液が抽出されると、入口から毛細管を削除します。 O _{2、CO 2、}血液ガスレベルは、血液ガス分析装置から印刷された紙の上に表示されます。

蛍光色素の4注入

1. ＃5ピンセットを用いて、内側左太ももの皮膚をつまんで。そっと上向きに皮膚を引っ張って皮膚をカットし、削除するためにハサミを使用しています。デキストラン共役赤色発光ローダミン色素を準備（70キロダルトン）（生理食塩水に溶解した10mg / kgの）。
2. 付属の30 G針で1mlシリンジをvein.Using大腿骨を見つけ、シリンジの130μlのラインへのイメージングのための適切な蛍光色素の先に調製した溶液を描画します。注射器に完全に染料を描画し、しっかりとシリンジ壁をフリックして、すべての気泡を除去します。
   1. ベンド硬質表面ベベル面を上に押し付けることで約30度の角度で30 G針。染料で針を記入し、余分な液体を捨て、100μlのサンプルを残します。
3. ゆっくりと大腿静脈に色素の100μlのサンプルを注入します。針を除去した後、任意の出血を止めるために注射部位に安定し、静かに圧力をかけます。色素が5分間循環させます。
   注意：代替的に、右大腿静脈に別の手術部位の創出を通じてさらなる血液損失を防止するために、蛍光色素の注入のために代わりに使用することができます。加えて、もし動物は、これはあまりにも多くのヘパリンは、カテーテルをフラッシュするために与えられたことを示している可能性があり、手術部位から制御不能出血しています。そこには凝固が10〜15分以内でないとマウスがまだ出血している場合は、新しいマウスを用いた実験を再開することを検討してください。
4. その胃の上にマウスを反転し、マウスのヘッドプレートハーネスにそれを置き、慎重に、その後、4-0縫合糸と一緒に皮膚を縫合することにより、左太ももを閉じます。

生体内二光子イメージング5.

1. 連続麻酔レベルを維持するために確認して、二光子顕微鏡に手術装置を移動します。ヘッドプレートのリザーバに0.9％生理食塩水の少量を置き、生理食塩水と接触するように、顕微鏡対物レンズを下げます。明視野対物レンズを用いて、関心領域の位置を確認します
2. 蛍光色素のために適切な波長の二光子レーザー励起を設定します。 25X Oを用いた2光子イメージングを開始しますbjective。
   これらの実験で、我々は波長780nmで励起した赤色発光ローダミン色素に結合させたデキストランを使用することに注意してください。色素からの蛍光を検出するための発光フィルタをバンドパス、および20分の480バンドパス放射フィルタは、動脈自己蛍光を検出するために使用した36分の607
3. ビュー画面上の毛細血管床を見つけて、光学ズームを2光子イメージングソフトウェアを使用して、毛細血管の2獲得画像を使用して、このエリアを拡大。
4. イメージングが完了した後、断頭続いて頸椎脱臼によりマウスを生け贄に捧げます。

6. エクスビボ二光子イメージング

1. 極細ハサミを使用して、マウスの正面骨に壁間の骨から頭皮に切開を行います。ポインタ指と親指で頭蓋骨の側面に皮膚を保護します。
2. 内側頭頂間骨の下極細ハサミを置き、矢状縫合に沿って頭蓋骨をカット。ブレグマをマーキングした後、約3mmの頭蓋骨を切断停止します。
   注：脳を切断しないようにする頭蓋骨を切断する際に上向きの圧力を適用します。
3. ＃5鉗子を使用して、脳から頭蓋骨を分離し、慎重に脳の表面から髄膜を除去します。残りの髄膜は、誤って脳を切ることができます。細心の注意は、これを避けるために注意すべきです。脳が頭蓋骨から外れるまで静かに前方にゆっくりと進行する脳の下の＃5鉗子をスライドさせます。
   注意：下向きの圧力が脳を刺さないようにするために使用されるべきであること。
4. マウスのための特定の脳切片ツールで脳を置きます。脳の上に人工脳脊髄液の液滴を適用することにより、脳を洗ってください。
5. ブレグマにブレグマ0から脳の2ミリメートル冠状断面を取り外し-2。上を向い0ブレグマと人工脳脊髄液を含む凹状のスライドガラス上に冠状断面（断面の最も頭側の部分）を配置します。静かに脳SLをカバーガラスカバースリップと氷。
   注：これは、血管アーキテクチャを変形させることのように一度脳部に配置されたガラスを押す避けてください。
6. 顕微鏡ステージにスライドを移し、カバースリップ上の0.9％生理食塩水を少量入れます。それは生理食塩水に接触するまで、顕微鏡の対物レンズを下げます。明視野対物レンズを用いて脳の正中線の位置を確認します。
7. 二光子イメージングを開始し、再び25倍対物レンズを用いて正中線を探します。冠状断面の皮質表面に縦亀裂を探して、これを達成します。正中線の撮影画面の右端を置き、横方向に3完全なフレーム（正中線から約1.5 mm）をビューア画面を上に移動。
   これらの実験では、撮像パラメータは、ステップ5.2でノートに記載されたものと同一であったことに注意してください。
8. 毛細血管がビュー画面上でかろうじて見えるれる深さの位置を確認します。焦点さらに20の平面を下げますμmでは、zスタックの先頭を決定します。
9. 1μmの画像の厚さを設定します。 100ミクロンのビュー画面を下げて、各画素の1％未満が過飽和となるように全体にレーザーパワーを調整します。
   注意：zスタック画像は100の連続した​​500x500x1ミクロン一連の画像からコンパイルされます。より正確な後処理の計算がされるzスタック大きいです。一般的には、100μm以上のzスタックを収集しようとします。
10. 隣接するX-Yのアイコンが続くXYリピートアイコンを押します。 zスタックが完了すると、 シリーズ完了アイコンを押して、ファイルを保存します。

7.データ処理

1. ImageJソフトウェアにおける in vivo毛細血管画像を開きます。手動で二光子ソフトウェアから得られた値に基づいて距離比のピクセルを設定します。
   1. [ツール]メニューから*ストレート*アイコンを選択します。親しい同僚に1毛細血管壁から伸びる線を引きサイトの毛細血管壁、とのImageJで提供さ長さを記録します。
      それは明らかに毛細血管壁のエッジを可視化するために、画像にズームインする必要があるかもしれないことに注意してください。
   2. 繰り返しキャピラリーに沿った異なる位置でのステップ7.1.1と同様に、画像内の複数のキャピラリ。
2. そのようなアミラなどの分析ソフトウェアにzスタックファイルを開きます。サブアプリケーションツールバーからフィラメントエディタのアイコンを選択
   1. 約20に、視聴者の厚さを設定zスタックの上部または下部のいずれかにビューアを移動します。
   2. トレースアイコンを選択し、ロードされた画像の上にカーソルを移動します。 図2Cに記載された場所での毛細血管上のノードを配置します。セグメントは自動的に隣接するノード間で表示されます。全体zスタック全体に毛細血管をトレースします。
      注：これは毛細血管を追跡するために、エンドポイントと分岐点との間のノードを配置する必要があるTHRzスタックoughout。
   3. これらのノードを削除するには、 中間のアイコンを削除]をクリックします 。
      注：これは、 選択1つのアイコンを使用してループを選択することにより、手動で削除する必要があり、誤ったループセグメントを作成し、[削除選択アイコンを選択することができます。ループがトレース中に同じ領域に表示し続ける場合は、ノードが別の毛細血管に配置した可能性があります。
   4. トレースが完了すると、自動的に抽出された血管のパラメータを含むスプレッドシートを開くために、グラフ情報]アイコンを選択します。ノードとセグメントの数は、メインビュー画面で利用可能です。

Results

薄頭蓋骨皮質ウィンドウは、皮質毛細血管の in vivo二光子イメージング（ 図1）を可能にします。画像に適した領域は、多数の、明確な毛細血管（ 図1A）を示しています 。同じ視野において、いかなる動脈細胞壁の自己蛍光が存在しない、第二高調波^11（ 図1B）によって誘導されるコラーゲンの蛍光などの他の蛍光信号があってもよいです。

脳切片の準備が完了すると、約1.5ミリメートル正中線からが配置されている撮影領域（ 図2A）。100μmのzスタックは、アミラ解析ソフト（ 図2B）での分析のために使用される三次元画像を生成します。毛細血管網は、手動で開始し、毛細血管の終わり、または任意の場所1キャピラリーbにノードを配置することによって追跡されます他に...

Discussion

ここに記載された方法は、実験モデル/設定の広範囲の脳微小血管構造を分析するために適用することができます。この方法の成功のために、3つの重要なステップを習得する必要があります。まず、薄頭蓋骨窓は、頭蓋骨または基礎脳に損傷を与えてはなりません。それは間伐時に頭蓋骨に穴を開け、または熱誘導性の血管漏出を引き起こすことは容易です。蛍光色素は、焦点面に漏出し、毛細血管を不明瞭になりますので、これは画像に干渉することがあります。頭蓋骨が頻繁に薄い頭蓋骨の準備中に壊れた場合は、最も可能性の高い大きすぎる下向きの圧力によって引き起こされます。バリにできるだけ近いmicrotorqueドリルを保持することは頭蓋骨に下向きの圧力を低下させる大きな触覚制御を可能にします。

第二に、動脈カテーテル法は、可能な限り迅速に動脈が切断された後に発生する必要があります。すぐにカテーテルを挿入しないと、コンプます過度の血液損失を引き起こす可能性がありますマウスの生理的な整合性をromise。カテーテルを挿入する難しさは、大腿動脈に比べて、通常、カテーテルの比較的大きなサイズに起因しています。それは、その直径を減少さ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ライカ顕微鏡	ライカ株式会社	MZ8
高輝度イルミネーター	Dolan-Jenner	180
ヒーティングパッド	ストライカー	TP3E
T/PUMP	ゲイマー・インダストリーズ(株)	TP-500
TEC-4 イソフルラン気化器	Datex Ohmeda	447
人工涙液	バトラー AHS	7312
ポビドン-ヨウ素溶液	Aplicare	52380-1855-9
エクストラファインボンはさみ	ファインサイエンスツール	14084-08
デュモン #5 鉗子	ファインサイエンスツール	11295-10
デュモン #5/45 フォーセプス	ファインサイエンスツール	11251-35
塩化第二鉄溶液	リッカケミカルカンパニー	3120-16
ロックタイト 454 プリズムインスタント接着ゲル	ヘンケル	45404
歯科用セメント	ストールティング	51459
マイクロトルケIIハンドピースキット	ピアソンデンタル	R14-0002
ドリル用005バリ	ファインサイエンスツール	19007-05
ノーランドブレード(歯科用マイクロブレード)	サルビンデンタル	6900
ウレタン	シグマアルドリッチ	U2500	グループ2B 発がん性物質
編組縫合	糸エチコン	735G
ヴァンナス春はさみ	ファインサイエンスツール	15000-03
動脈カテーテル	SAI Infusion Technologies	MAC-01	カテーテルの直径を小さくするために、カテーテルの端を手動で伸ばしました。
血圧モニター	ワールド精密機器	SYS-BP1
血圧トランスデューサーとケーブル	ワールド精密機器	BLPR2
RAPIDLab 血液ガス分析装置	シーメンス	248
40 Μl 毛細管	VWR	15401-413
テキサス レッドデキストラン (70,000 MW, 10 mg/kg 生理食塩水溶解)	Invitrogen	D-1830
成体マウス脳スライサー マトリックス	Zivic Instruments	BSMAS001-1
オリンパス Fluoview 1000 AOM-MPM 多光子顕微鏡	Olypmus	FV-1000 MPE
MaiTai HP DeepSee Ti:Saレーザー	スペクトル-物理学
ImageJ Software	National Institutes of Health (NIH)		は、
http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html Amira Software	Visage Imagingで入手可能