siRNA媒介サイレンシングによるマウス卵母細胞における減数分裂紡錘体の評価

サマリー

ここでは、マウス卵母細胞で減数分裂スピンドルアセンブリと組織を評価するために、免疫蛍光分析に続いて、特定のsiRNA媒介mRNAの枯渇のためのプロトコルを提示します。このプロトコルは、転写物のin vitroでの枯渇と異なるスピンドルおよび/ ​​または卵母細胞におけるMTOC関連因子の機能評価に適しています。

要約

配偶子の減数分裂中の染色体分離のエラーは、受精時に胚に伝染する異数性につながる可能性があります。発生中の胚に生じる異数性は、流産やダウン症候群などの先天性先天性欠損症の主な原因として認識されています。正確な染色体分配は、微小管紡錘体装置の形成に大きく依存していますが、このプロセスは哺乳類の卵子では十分に理解されていません。興味深いことに、減数分裂紡錘体は有糸分裂とは異なり、少なくとも部分的には、独自の微小管組織化センター(MTOC)によって調節されています。MTOC関連タンパク質の評価は、減数分裂紡錘体の形成と組織化を支配する制御メカニズムに関する貴重な洞察を提供することができます。ここでは、siRNAを介したテスト機能を用いて、マウス卵子を単離し、MTOC関連タンパク質を枯渇させる方法について説明します。さらに、減数分裂紡錘体の形成と組織を評価するための卵子固定および免疫蛍光分析条件について説明します。

概要

減数分裂は、配偶子（卵母細胞および精子）で発生する独特の分割処理であり、それぞれ^1、減数分裂Iと減数分裂IIの間に相同染色体と姉妹染色分体を分離するためにDNA合成を介在せずに2つの連続した部門が関与します。卵母細胞における減数分裂時の染色体分離におけるエラーは受精胚中に継承され異数性をもたらすことができます。特に、発展途上胚における異数性の発生率は、母体の加齢に伴って増加し、女性^1,2における妊娠損失だけでなく、先天性の先天性欠損症の主な原因である、したがって、減数分裂時の異数性の分子基盤を理解するための重要な必要性を強調。

細胞分裂の間、染色体分離は反対スピンドルへの正しい取り付けのための微小管スピンドル装置と安定した染色体微小管の相互作用の確立の組み立てに決定的に依存していますポール。重要なことは、哺乳動物の卵母細胞における減数分裂紡錘体の形成は、体細胞での有糸分裂とは異なり、中心小体^{3,4を欠いている}ユニークな微小管組織化センター（MTOCs）によって規制されています。微小管の核形成と組織のために必要不可欠なタンパク質は、微小管集合を触媒するγチューブリンを含む卵母細胞MTOCs、に局在します。また、MTOCs ⁵でバインド必須の足場タンパク質として機能し、アンカーγチューブリン、ならびにその他の要因ペリセントリン。注目すべきことに、我々の研究は、キーMTOC関連タンパク質の枯渇が....

プロトコル

このプロトコルは、ジョージア大学の施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって承認されました。

1.準備

1. 卵母細胞培養、購入やたての最小必須培地（MEM）を調製し、 表1で説明したように3 mg / mlのウシ血清アルブミン（BSA）で補うために。ロードバランス（ゼロに風袋）にポリスチレンボトルを置きます。ためには、BSAを除き、全ての試薬を追加し、250グラムの合計重量のMQ水で最終体積を持ち出します。その後、BSAを追加し、溶解し、フィルター滅菌することができます。
   注：記載のMEM培地を、5％CO _{2、5％O 2}および90％N ₂の医療用ガスの混合物で平衡化し、細胞のインキュベーションを必要とします。しかしながら、他の媒体（例えば、CZB）は大気条件下、5％CO ₂での細胞のインキュベーションを可能に使用することができます。
2. 卵母細胞のマイクロインジェクションのために、購入またはM2培地を準備します。
3. Pを準備します5 IU / 100μlの濃度に君臨するの牝馬の血清性性腺刺激ホルモン（PMSG）。
4. 1μMの作業濃度に対するsiRNAの株式を購入し、再構成します。

2.マウス卵母細....

結果

siRNAのマイクロインジェクションは、in vitroで異なるターゲット因子の効率的かつ高度に特異的な機能テストを可能にした卵母細胞におけるmRNAの分解及びその後のタンパク質の枯渇に有効なアプローチを提供します。その後、免疫蛍光は、特定の表現型分析のために使用されるだけでなく、siRNAを注入した卵母細胞中のタンパク質の枯渇を検証します。現在の例では、抗チューブリンおよび抗ペリセントリン抗体とともにDAPIで個々の卵母細胞の蛍光標識有効：だけでなく、ペリセントリン枯渇の（ⅰ）確認（ii）のコントロールの両方のクロマチンと減数分裂スピンドル構成を総合的に評価し、 PCNT -枯渇した卵母細胞。

非特異的コントロールまたはPCNTのsiRNAをマイクロインジェクションした卵母細胞の代表的な免疫蛍光画像は、図^2〜図7に示されている。17時間の培養後、ほとんどの制御卵母細胞は中期-IIのクワガタに達しました整列した染色体と紡錘体極の明るいペリセントリン標識（ .......

ディスカッション

そのようなエレクトロポレーション及びトランスフェクションのような体細胞への外因性核酸の転写のための複数の方法があるが、マイクロインジェクションは、転写休止マウス卵母細胞へのRNA分子の送達のための最適な方法です。現在のプロトコルは、異なる主軸および/ ​​または卵母細胞におけるMTOC関連因子の機能テストを可能にする特定のmRNAのインビトロ枯渇のための効果的なアプローチを提供します。このアプローチは、効率的な転写産物の枯渇をもたらし、非常に適応可能です。 siRNAは特にPCNT転写産物を標的とするために使用されたが、同様の条件は、目的のほとんどすべての遺伝子を標的化するために使用することができます。

卵母細胞の収集、文化や操作など、このプロトコルのいくつかの態様は、卵母細胞の品質を維持するためと技術的成果物を避けるために、練習と経験が必要です。培地のpH及び/又は温度の変動は、作業eで避けなければなりませんxpediently、慎重に。卵母細胞の小グループのマイクロインジェクション、およびマイクロインジェクションシステム内の加熱されたステージ.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Reagents
妊娠中の牝馬の血清ゴナドトロピン(PMSG)	EMD Biosciences	367222
Minimal Essential Medium(MEM)			*表1に概説されているレシピ
Earle's Balanced Salt Solution (10x)	Sigma	E-7510
ナトリウム重炭酸	Σ	S-5761
ピルビン酸・ナトリウム塩	シグマ	P-5280
ペニシリンG、カリウム塩	Sigma	P-7794
ストレプトマイシン硫酸塩	Sigma	S-9137
L-グルタミン	Sigma	G-8540
EDTA、二ナトリウム塩二水和物	Sigma	E-4884
必須アミノ酸 (50x)	Gibco	11130-051
MEMビタミン混合物(100x)	シグマ	M-6895
フェノールレッド溶液	シグマ	P-0290
ウシ血清アルブミン(BSA)	シグマ	A1470
リノン	シグマ	M4659
シ胎児血清(FBS)	ハイクロン	SH30070.01
EmbryoMax M2培地(ヘプス付き	EMD Millipore	MR-015-D
siRNAs 標的 Pericentrin	Qiagen	GS18541
Negative control siRNAs	Qiagen	SI03650318
パラホルムアルデヒド (16% 溶液)	Electron Microscopy Sciences	15710
Triton-X	Sigma	T-8787
リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)	Hyclone	SH30028.02
Anti-Pericentrin (rabbit)	Covance	PRB-432C
Anti-acetylated a-tubulin (mouse)	Sigma	T-6793
ヤギ アンチラビット アレクサ フルーア 488	Invitrogen	A-21430
ヤギ アンチマウス アレクサ フロー 555	インビトロジェン	A-11017
<ストロング>主要機器
実体顕微鏡 (SMZ 800)	ニコン
アップライト 蛍光顕微鏡	ライカマイクロシステムズ
倒立顕微鏡	ニコン
Femtojet マイクロインジェクションシステム	Eppenforf
マイクロマニピュレーター	Eppendorf
マイクロインジェクションニードル (フェムトチップ)	Eppendorf	930000035
ホールディングピペット (VacuTip)	Eppendorf	930001015
プラスチック製品
35 mm 培養皿	Corning Life Sciences	351008
4 ウェルプレート	Thermo Scientific	176740
96 ウェルプレート	Corning Life Sciences	3367
0.45 mm CA フィルターシステム	Corning Life Sciences	430768

ミルウ)