マイクロ波照射を用いて潜在的な抗寄生虫治療薬としてのバックボーン環状ペプチドライブラリの開発

Summary

マイクロ波照射を用いた環状ペプチドの合成のための簡単で一般的な方法が概説されています。この手順により、側鎖とファーマコフォリック部分を保持しながら、異なるコンフォメーションの集合体を持つバックボーンサイクリックペプチドの合成が可能になり、したがって、生理活性コンフォメーションをスクリーニングすることができます。

Abstract

タンパク質 - タンパク質相互作用薬（PPI）は、ほぼすべての生物学的プロセスに密接に関与しており、多くのヒト疾患にリンクされています。そのため、基礎研究、製薬業界でのPPIを対象とする大規模な努力があります。タンパク質 - タンパク質界面は平坦、通常は大きく、多くの場合、そのような部位を標的とする小分子の発見を複雑に、ポケットを欠いています。抗体を用いた代替的な標的アプローチは乏しい経口バイオアベイラビリティ、低い細胞透過性、及び生産効率の悪さに起因する制限があります。

PPIインターフェースを標的にするペプチドを使用すると、いくつかの利点を有します。ペプチドは、より高いコンホメーションの柔軟性、高い選択性を有し、一般に安価です。しかし、ペプチドは、細胞膜を横切る乏しい安定性と非効率性などの独自の制限があります。このような限界を克服するために、ペプチドの環化を行うことができます。環化は、ペプチドの選択性を改善することが実証されています、代謝安定性、および生物学的利用能。しかし、環状ペプチドの生理活性立体構造を予測することは容易ではありません。この課題を克服するために、1つの魅力的なアプローチは、すべてのバックボーン環状ペプチドは、同じ一次配列を持っているが、そのような環の大きさや位置など、その立体構造に影響を与えるパラメータが異なるた画面に集中ライブラリーをスクリーニングします。

私たちは、特定の寄生虫のPPIをターゲットバックボーン環状ペプチドのライブラリーを合成するための詳細なプロトコルを記述します。合理的な設計アプローチを使用して、我々は、活性化Cキナーゼ（LACK）のための足場タンパク質のL eishmania受容体に由来するペプチドを開発しました。我々はではなく、哺乳動物宿主ホモログで、寄生虫に保存されているLACK中の配列は、寄生虫「生存のために重要であるタンパク質のための相互作用部位を表すことができるという仮説を立てました。環状ペプチドは、反応時間を短縮し、高めるためにマイクロ波照射を用いて合成しました。効率。別のリングサイズとバックボーン環状ペプチドのライブラリーを開発することは、ほとんどの生物学的活性コンホメーションのための体系的な画面を容易にします。この方法は、環状ペプチドを合成するための一般的で、速く、容易な方法を提供します。

Introduction

タンパク質-タンパク質相互作用薬（PPI）は、細胞内シグナル伝達の細胞死¹に、ほとんどの生物学的プロセスにおいて重要な役割を果たしています。したがって、のPPIを標的とする基礎研究および治療用途に基本的に重要です。 PPIは、具体的かつ安定的な抗体によって調節することができるが、抗体が低いバイオアベイラビリティを製造し、持っている高価では困難です。代替的に、のPPIは、小分子によって標的とすることができます。小分子は、抗体に比べて合成が容易、安価です。しかし、彼らは比較的柔軟で、大きなタンパク質-タンパク質インターフェース^2,3に比べて小さな空洞へのより良いフィット。多様な研究が単純で安価抗体よりも、小さな分子よりも柔軟であるペプチドは、タンパク質のインターフェースをバインドし、PPIは^{4,5を調節することができる}ことを実証しました。グローバル治療用ペプチドの市場は2013年に150億ドルの周りに評価され、10.5％のスズメノカタビラを成長していますLLY ^6。また、50以上の販売ペプチド、臨床試験の異なる段階で約270ペプチド、および高度な前臨床段階⁷で約400ペプチドがあります。多数のペプチドは薬として使用されているが、ペプチドがまだ乏しい生物学的利用能および安定性、細胞膜を横断中の非効率性、およびコンホメーションの柔軟性^8,9を含め、広範なアプリケーションを制限するいくつかの課題を提起します。これらの欠点を克服するための一つの代替は、ローカル（D-アミノ酸およびN-アルキル化）及びグローバル（環化）制約^8,10-12として異なる修飾を適用することです。これらの変更はまた、自然に発生します。例えば、シクロスポリンA、免疫抑制環状天然ペプチドは、単一のD-アミノ酸を含み、N-アルキル化修飾^{13,14を受けます} 。

天然アミノ酸の改変は、多くの場合、ペプチドに影響を与える、例えば、D-及びN-アルキル化のようなローカルな制約を誘導します9;の生物活性。しかし、目的の配列は同じまま可能な環化は、生物学的活性を保存する可能性が高いです。環化は、異なるコンホメーションの間の平衡を低減することにより、ペプチド立体配座空間を制限するための非常に魅力的な方法です。これは通常、一つだけの機能を仲介する活性コンホメーションにペプチドを制限することにより、生物学的活性および選択性を向上させます。環化はまた、より少ない分解酵素により認識されるコンフォメーションにペプチドを保持することによってペプチドの安定性を向上させます。確かに、環状ペプチドは、それらの線形対応^15-17に比べて代謝安定性、バイオアベイラビリティ、および選択性を改善していることが示されました。

いくつかのケースでは制限が生理活性コンフォメーションを達成することからペプチドを防止することができるので、環化は両刃の剣であることができます。このハードルを克服するために、集中ライブラリーは、全てのペプチドが同じプライマリsequencを持っていますEその結果、一定のファーマコフォアを合成することができます。ライブラリ内のペプチドは、その後、ほとんどの生物活性コンフォメーション^9,18をスクリーニングするために、このような環の大きさと位置と、その構造に影響を与えるパラメータが異なります。

ペプチドは、溶液中で、現在より一般的ペプチド合成法であり、さらに説明される固相ペプチド合成（SPPS）アプローチの両方によって合成することができます。 SPPSは、化学変換は、合成化合物¹⁹の広い範囲を調製するためにリンカーを介して固体支持体上で実施されるプロセスです。 SPPSは、N末端に、固体支持体に結合しているC末端から段階的にアミノ酸の連続的カップリングにより集合ペプチドを可能にします。 N-αアミノ酸の側鎖は、STごとに一つのアミノ酸の付加を確実にするために、ペプチド伸長の間に使用される反応条件に安定である保護基でマスクされなければなりませんEP。最後のステップでは、ペプチドを樹脂から放出され、側鎖保護基が同時に除去されます。ペプチドが合成されている間、すべての可溶性試薬は濾過によって、ペプチド固体支持体マトリックスから除去し、それぞれのカップリング工程の終了時に洗い流すことができます。そのようなシステムでは、高濃度での試薬 ​​の大過剰が完了するまで、カップリング反応を駆動することができ、全ての合成工程は、材料²⁰の任意の転送せずに、同じ容器内で行うことができます。

SPPSは、不完全な反応、副反応、不純な試薬、ならびに反応^{21を監視する}困難の生産など、いくつかの制限がありますが、SPPSの利点は、ペプチド合成のための「ゴールドスタンダード」行いました。これらの利点は、その結果、非天然アミノ酸を組み込むためのオプション、自動化、容易な精製、物理的損失を最小化し、過剰な試薬の使用を含みます高収率。 SPPSは難しいシーケンス^21,22、蛍光修正^23、及びペプチドライブラリー^24,25の合成において非常に有用であることが示されています。 SPPSはまた、このようなオリゴヌクレオチド^26,27、オリゴ糖^28,29、およびペプチド核酸^30,31などの他のポリチェーンアセンブリのための非常に便利です。興味深いことに、いくつかの場合において、SPPSは、伝統的に、溶液^32,33に形成されている小分子を合成するのに有利で ​​あることが示されました。 SPPSは、研究と教育^34,35のための小規模なだけでなく、大規模で業界^36〜38の両方で使用されています。

主にペプチドの合成のためのSPPS法で使用される2つの合成戦略は、ブチルオキシカルボニル（BOC）および9-フルオレニルメトキシカルボニル（Fmoc）です。 SPPSのために導入された元の戦略は、rからのペプチドの側鎖保護基を除去し、切断するために強い酸性条件を必要とするBocでしたESIN。 Fmocベースのペプチド合成は、しかしながら、適度な塩基条件を利用し、酸に不安定なBocでプロトコル³⁹に穏やかな代替手段です。 Fmocストラテジーは、酸性条件下で樹脂からペプチドを切断しながら、合成の最後の工程で除去され、直交t-ブチル（tBuで）側鎖保護を利用します。

固体支持体上のペプチド合成のための一般的な原理は、図1に示されている。N-α末端の一時的な保護基でマスクされ、最初のアミノ酸は、C末端から樹脂上にロードされます。 （ 図1、工程1）必要に応じて側鎖をマスクする半永久的保護基も使用されます。標的ペプチドの合成は、N-α-一時的保護基（ 図1、工程2）及び次の保護アミノ酸のカップリング（ 図1の脱保護の反復サイクルにより、N末端 ​​にC末端から組み立てられますオング>、ステップ3）。最後のアミノ酸は、（ 図1、ステップ4）にロードされた後、ペプチドを樹脂支持体から切断され、半永久的保護基は、（ 図1、ステップ5）を除去します。

固相ペプチド合成を 、図1 の一般的なスキームは、N-α保護アミノ酸を、樹脂（ステップ1）にリンカーを介してカルボキシル基を用いて固定されます。所望のペプチドは、N-α（ステップ2）およびアミノ酸のカップリング（工程3）からの一時的な保護基（TPG）の脱保護の反復サイクルによりN末端にC末端から直線的に組み立てられます。合成（ステップ4）を達成した後、半永久的保護基（SPG）は、ペプチド切断（ステップ5）の間に脱保護されます。= "_空白"を取得>この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

完全なペプチド鎖を組み立てた後、環化は、いくつかの選択肢によって達成することができる：（A）頭-尾環化-これは便利な方法ですが、それは環化のための唯一の選択肢（ 図2A）、（B）環化を提供するので、限られ生物活性官能基を含む、目的の配列からのアミノ酸を使用する-しかし、これらのアミノ酸の使用を妨げることなく、アミノ酸（またはその他のビルディングブロック）を添加することにより、生物学的活性（ 図2B）、及び（C）の環化に影響を与え得ます生理活性シーケンス。それは興味（ 図2C）の配列を変更することなく、集束ライブラリーを製造することができるように、これらの分子を導入することは広く行われています。

Figure 2. 代替ペプチド環化戦略尾環化（A）のヘッド、C末端およびN末端 ​​の間のペプチド結合を介して。 （B）N-するグルタミン酸/アスパラギン酸（2）、または側鎖に官能性システイン残基間のジスルフィド結合などの基（1）、又はリジンの側鎖間のアミド結合の間の環化またはC末端（3 -4）; （R0）の前と（R7）の生物活性シーケンスの後、たとえば、余分なアミノ酸またはアミノ酸誘導体または小分子を添加することにより、（C）環化。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

マイクロ波支援合成は、このように有機化学変換に^{40,41を加速} 、反応を加熱するためにマイクロ波照射を使用しています。マイクロ波化学は吸収する溶剤試薬/の能力に基づいていますマイクロ波エネルギーと^42を熱に変換します。技術が広まったの前に、主要な欠点は、合成プロトコルと適切な温度と圧力のコントロール^43,44のために利用可能なシステムの欠如の制御性と再現性を含めて、克服しなければなりませんでした。マイクロ波支援ペプチド合成の最初の報告は、カップリング効率および純度⁴⁵の有意な改善を有するいくつかの短いペプチドを合成するための台所のマイクロ波（7-10アミノ酸）を用いて行きました。また、マイクロ波エネルギーは、鎖の凝集を減少させる副反応を減少させる、ラセミ化を制限し、すべての困難および長いシーケンス^46-53に重要な結合率を改善することが示されました。

現在、固体支持体上のペプチドまたは関連化合物の合成のためのマイクロ波照射の使用は、有機溶剤⁵⁴の代わりに、水（A）合成を含む、広範です。 （B）ペプチドの合成とこのような合成により、立体障害されたアミノ酸誘導体のカップリング効率が低い、典型的には困難である糖ペプチド^55-58または^59-61ホスホペプチドなどの一般的な翻訳後修飾、。 （C）側鎖に接続されている窒素原子^62、またはペプトイドでのアミノ酸残基のC（α）の置換によって形成することができ、このようなアザペプチドなどの主鎖中に修飾を有するペプチドの合成むしろCα原子^63,64よりアミド窒素; （D）環状ペプチド^65-71の合成;コンビナトリアルライブラリー^51,72のと（E）の合成。多数の例では、著者らは、より高い効率が報告され、従来の手順と比較して、マイクロ波照射を使用して合成時間を減少させました。

合理的な設計^{73-75を使用して、我々は、fo}を足場のL eishmaniaの受容体から誘導された抗寄生虫性ペプチドを開発Rは、Cキナーゼ（LACK）を活性化しました。 LACKは、リーシュマニア感染⁷⁶の初期段階において重要な役割を果たしています。 LACKの低いレベルで発現する寄生虫はLACKが不可欠寄生虫シグナル伝達過程およびタンパク質合成⁷⁸に関与しているようであっても、免疫不全マウスに^77に寄生することができません。そのため、不足は重要な足場タンパク質^79、貴重な薬剤標的です。ではなく、ホストの哺乳類ホモログのラックに、寄生虫に保存されている欠如配列に着目し、8アミノ酸ペプチド文化にリーシュマニア属の生存率を減少させた（RNGQCQRK）を同定しました。

ここでは、上述のLACKタンパク質配列に由来する骨格環状ペプチドの合成のためのプロトコールを記載します。ペプチドは、Fmocの/にtBuプロトコルSPPS法によってマイクロ波加熱を用いて固体支持体上で合成しました。ペプチドは、アミド結合などを介してTAT _{47-57（YGRKKRRQRRR）}キャリアペプチドに結合させましたSPPSの一部。細胞内への貨物の様々なTATベースのトランスポートは、15年以上にわたって使用されており、細胞内小器官への貨物の配送には^80を確認されています。四つの異なるリンカー、コハク酸およびグルタル酸無水物、ならびにアジピン酸およびピメリンは、2〜5個の炭素原子のカルボン酸リンカーを生成するための環化を行うために使用されました。環化は、マイクロ波エネルギーを使用して行った、最終的な切断および側鎖脱保護工程は、マイクロ波エネルギーなしで手動で行われました。自動化されたマイクロ波シンセサイザーの使用は、生成物の純度を改善し、製品の収率が増加し、合成の持続時間を減少させました。この一般的なプロトコールは、in vitroおよびin vivoでの重要な分子機構を理解し、さらにヒト疾患のための潜在的な薬物を開発するためにペプチドを使用する他の研究に適用することができます。

Protocol

1.機器および試薬の準備

1. 準備設備
   1. 適切な個人用保護具を使用して、ヒュームフード内のすべての手順を実行します。
   2. 化学的にテフロン（登録商標）反応器（ガラスフリットと30 mlの）または使い捨てのポリプロピレンマイクロ波電力供給を制御するための光ファイバ温度プローブを装備した発見の追加のモジュールをマイクロ波ペプチド合成機を用いて固体支持体上のペプチドを合成しますカートリッジ（粗いフリットと12ミリリットル）。
   3. 適切な混合のために、反応容器に窒素供給を接続し、あるいはポリプロピレンカートリッジの両端を密封し、ロータリーシェーカー上に置き。
   4. 反応混合物または洗浄液を排出するために、廃棄物のトラップを経由してハウスバキュームに接続します。
   5. 反応容器内に光ファイバープローブを配置します。
2. 試薬の準備
   1. スケートリンクアミドAM樹脂100〜200メッシュを秤量することによって樹脂を準備し（0.204 mg）を適切に膨張し、そして排出するために2-4時間振る、ダウン樹脂を洗浄するために、反応容器/ポリプロピレンカートリッジにN 1の混合物、N-ジメチルホルムアミド （DMF）/ジクロロメタン（DCM）：1の5ミリリットルを追加します。
   2. DMF中の対応するFmoc-アミノ酸を溶解することにより酸性溶液アミノ0.2Mの9-フルオレニルメトキシカルボニル（Fmoc）を調製し、アミノ酸が溶解するまで混合物をボルテックスした（表1）。
   3. 100 mlのDMF中でN、N、N '、N' -tetramethyluroniumヘキサフルオロホスフェート（HBTU）および固体が溶解するまで混合物をボルテックス（ 表 - （ベンゾトリアゾール-1-イル） - 18.96グラムOに溶解し0.45 M活性剤溶液ミックスを調製します1）。
   4. 65.2 mlの1-メチル-2-ピロリジノン（NMP）（ 表1）と34.8 mlのN、N-ジイソプロピルエチルアミン （DIEA）を組み合わせることにより、2 M活性剤ベース液ミックスを調製します。
   5. 1-ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（HOBt）3.37グラムを溶解して、0.1M脱保護溶液ミックスを調製しますDMF中のピペリジンの20％（v / v）の溶液250mlで、固体が溶解するまで混合物をボルテックスした （表1）。

2. Fmoc保護アミノ酸のカップリング

1. アミノ酸カップリング
   1. アミノ酸（2.5 ml）を/活性剤（1 ml）を/活性剤ベース（0.5ml）を反応容器/ポリプロピレンカートリッジに添加し、反応を300秒（25 W、75°C、 表2）を進行させ。ソリューションを排出します。
   2. DMFで樹脂を洗浄します。 120秒（7ミリリットル、W 0、RT）用の樹脂に、DMFを追加して、解決策をドレイン。 5回繰り返します。
2. Fmocの脱保護
   1. 反応容器/ポリプロピレンカートリッジに、0.1MのHOBtとDMF中の20％ピペリジンの7ミリリットルを追加し、30秒（45 W、75°C、 表2）インキュベートします。
   2. 反応混合物を排出します。
   3. 反応容器/ポリプロピレンカートリッジに、0.1MのHOBtとDMF中の20％ピペリジンの7ミリリットルを加え、180秒間インキュベート（45 W、75°C、 表2）。
   4. 反応混合物を排出します。
   5. DMFで樹脂を洗浄します。 120秒（7ミリリットル0 W、RT）用樹脂に、DMFを追加して、解決策をドレイン。 5回繰り返します。
      注：必要に応じて、ここでの手順を一時停止し、後日再開。
3. アミノ酸のカップリング工程の後に、（ - 20℃で長期間記憶するための樹脂）を、4℃で少なくとも数日間DCMとストアで樹脂を洗浄します。
   1. ポリプロピレンカートリッジに反応容器から樹脂を移動します。
   2. DCMで樹脂を洗ってください。 （7ミリリットル0 W、RT）120秒間樹脂に、DCMを追加して、解決策をドレイン。 3回繰り返します。
   3. トップキャップとコックでしっかりとポリプロピレンカートリッジをシール。
   4. 新しい合成を開始する前に、DMF中の3-4時間（7ミリリットル）用の樹脂を膨潤させます。
4. 合成の監視
   1. 迅速の進行を決定するために、カイザー（ニンヒドリン）テストまたはクロラニル試験に使用合成。必要に応じて、合成されたペプチドの純度および質量を決定するために、小規模な開裂反応を行います。セクション9を参照してください。
      注意：以上のトラブルシューティングについては、表3を参照してください 。
5. ターゲットを絞ったペプチドを合成するために、必要に応じて繰り返して、2.1と2.2のステップ： Arg(Pbf)-Asn(Trt)-Gly-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Lys(Mtt)-Gly-Gly-Tyr(But)-Gly-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf).

3.無水物/酸カップリング

1. 無水カップリング
   1. NMPで樹脂を洗浄します。 120秒間樹脂に（7ミリリットル、W 0、RT）を、NMPを追加して、解決策をドレイン。 3回繰り返します。
   2. NMP中の対応する酸無水物の10当量（5ml）に溶解し、溶液（ 表1）に1当量の4-ジメチルアミノピリジン（DMAP）および10当量のDIEAを加えます。
   3. （25 / DIEA樹脂に無水物/ DMAPの混合物10と300秒間インキュベート：1：10を追加W、75°C、 表2）。ソリューションを排出します。
   4. NMPで樹脂を洗浄します。 120秒間樹脂に（7ミリリットル、W 0、RT）を、NMPを追加して、解決策をドレイン。 3回繰り返します。
2. 酸結合
   1. DMFで樹脂を洗浄します。 （7ミリリットル0 W、RT）120秒間樹脂に、DMFを追加して、解決策をドレイン。 3回繰り返します。
   2. DMF中の対応するジカルボン酸の10当量（5ml）に溶解します。溶液（ 表1）に1当量のDMAPおよび10当量のN、N '-Diisopropylcarbodiimide（DIC）を追加します。
   3. 30分間混合して混合物を予備活性化します。
   4. 樹脂に混合物を追加し、300秒（25 W、75°C、 表2）インキュベートし、溶液を排出します。
   5. DMFで樹脂を洗浄します。 120秒間樹脂に（7ミリリットル、W 0、RT）およびドレインソリューションを、DMFを追加します。手順を繰り返し3回。

グループ脱保護の保護4. N-メチルトリチル（MTT）イオン

注：リジン側鎖は、N -メチルトリチル^{（MTT）81、}酸に不安定な条件の下で^82,83を選択的に脱保護することができる保護基で保護しました。マイクロ波エネルギーなしでシェーカー上で手動で保護基を脱保護のMtt。

1. キャッププラグとコックを備えたポリプロピレンカートリッジに樹脂を転送します。
2. DCMで樹脂を洗ってください。 （7ミリリットル0 W、RT）120秒間樹脂に、DCMを追加して、解決策をドレイン。 3回繰り返します。
3. 樹脂1グラム当たりのポリプロピレンカートリッジに、DCM、1％トリフルオロ酢酸（TFA）の混合物15〜25 mlを加え、5％トリイソプロピルシラン（TIS）、および94％。
   注意：TFAは強酸であり、腐食性及び皮膚、眼、および肺組織に非常に刺激します。
   1. すべての回で、フード中のTFAの濃縮溶液を保管してください。
   2. よく換気フード内で適切な個人用保護具（眼の保護、白衣と手袋）と作業を使用します。速やかに手袋を変更彼らは、TFAとすぐにクリーンアップ任意の流出に触れた場合。皮膚や目が酸に触れた場合は、すぐに水で患部をフラッシュし、さらに15分間洗います。
4. シェーカー上ポリプロピレンカートリッジを置き、室温で5分間振とうします。
5. 真空を適用することにより、ポリプロピレンカートリッジからソリューションを排出します。
6. 繰り返しは4.3から4.5、3回繰り返します。
7. DCMで樹脂を洗ってください。 （7ミリリットル0 W、RT）120秒間樹脂に、DCMを追加して、解決策をドレイン。 5回繰り返します。

線状ペプチドの環化5.

1. DCMで樹脂を洗ってください。 （7ミリリットル0 W、RT）120秒間樹脂に、DCMを追加して、解決策をドレイン。 5回繰り返します。
2. 50ミリリットルポリプロピレンチューブでは、ジブロモメタン中の5当量のベンゾトリアゾール-1- LY-オキシ-トリス-ピロリのヘキサフルオロホスフェート（PyBOPの）（DBM、5 ml）に溶解し、溶液（ 表1）に10当量のDIEAを追加します。
3. は、樹脂に混合物を追加し、300秒（25 W、75°C、 表2）インキュベートします。ソリューションを排出します。
4. DCMで樹脂を洗ってください。 （7ミリリットル0 W、RT）120秒間樹脂に、DCMを追加して、解決策をドレイン。 3回繰り返します。

側鎖グループの6切断および脱保護

1. DCMおよびジエチルエーテルで樹脂を洗浄します。
   1. （7ミリリットル0 W、RT）120秒間樹脂に、DCMを追加して、解決策をドレイン。 2回繰り返します。
   2. （7 mlの、0 W、RT）120秒間樹脂にジエチルエーテルを加え、溶液を排出します。 2回繰り返します。
2. 水酸化カリウム（KOH 1〜10 g）を超える少なくとも3時間、室温で真空デシケーター中で樹脂を乾燥させます。
3. 乾燥した樹脂を計量し、ポリプロピレンカートリッジに転送します。
4. 樹脂の一つ一つグラムに予備冷却トリフルオロ酢酸（TFA）開裂カクテル（例えば、90％TFA、2.5％水、2.5％TIS、5％フェノール）を10mlを加えます。
5. 3時間シェイクRTで。
6. 50ミリリットルのポリプロピレンチューブに樹脂をフィルタリングすることにより、TFA切断ソリューションを収集します。ろ過のために、12ミリリットルのポリプロピレンカートリッジであるフリットを使用しています。
7. チューブに冷ジエチルエーテル（35ミリリットル）を追加します。
8. 4℃で1207×gで5分間遠心。
9. エーテル層をデカント。
10. 繰り返しステップ6.7から6.9まで、5回。

7.バックボーン環状ペプチドを乾燥

1. 同じチューブに沈殿したペプチドを維持し、30分間フード内でそれを乾燥させてください。
2. 水とアセトニトリル（ACN）の1：1混合物中のペプチドを溶解します。
3. 液体窒素中での最終生成物溶液をフリーズします。
4. 最終製品を凍結乾燥。

8.バックボーン環状ペプチドの特徴付け

1. 水（400μL）中の生成物の少量サンプル（1 mg）を溶解します。
2. 逆相高速液体chromatograpに溶解したペプチド（10〜200μl）を注入HY（RP-HPLC）システムは、ペプチド純度^{34をテストします。}
3. 質量分析マトリックス支援レーザー脱離イオン化^{（MALDI-MS）84を}用いてペプチドの質量を確認してください。
   1. アセトニトリルの1（v / v）の混合物：1で1μL（100μM）のペプチドを混ぜた水を、マトリックスの1μL（5 mg / mlの、αシアノ-4-ヒドロキシ桂皮酸）と1：1（Vアセトニトリル/ v）混合物：TFA（0.1％）を含む水。
   2. MS-MALDIプレート上のスポット1μL。
   3. サンプルを乾燥し、質量分析計に入れてください。
4. ペプチドを計量し、パーセント収率を計算します。
5. -20℃で保存してください。

9.合成の監視

1. カイザー（ニンヒドリン）テスト⁸⁵
   1. 試薬溶液を準備します。
      1. 25mlの蒸留水にシアン化カリウム（KCN）の16.5 mgの溶解することにより溶液Aを準備します。ピリジン49ミリリットルで上記溶液1mlを希釈します。
      2. 溶液Bを準備エタノール20ml中のニンヒドリンの1グラムを溶解することもできます。
      3. 20ミリリットルのエタノールに40gのフェノールを溶解して溶液Cを準備します。
   2. アミノ酸カップリングや保護基の脱保護が完了したことを確認するにはカイザー試験を使用してください。
      1. 試験管に樹脂からいくつかのビーズを転送します。
      2. 各溶液の3滴（〜100μl）を（A、BおよびC）を加え、混合します。
      3. 5分間、110℃の加熱ブロックに試験管を加熱します。
         注：ブルー色のビーズ（陽性の結果）が不完全なカップリング反応またはFmoc保護基の脱保護を示しています。
2. クロラニル試験⁸⁶
   1. 各テストのために新鮮な以下の試薬を準備します。
      1. DMF、溶液A中2％クロラニル溶液を調製します
      2. DMF中2％のアセトアルデヒドの溶液を調製し、溶液B.
   2. アミノ酸カップリング、またはTの完了を確認するためにクロラニル試験を行います彼は、保護基の脱保護。
      1. 1.5mlチューブに溶液B100μlの溶液Aの100μLを混ぜます。
      2. ビーズを落とし、ゆっくりと5分間振ります。
         注意：ダークブラウン色のビーズ（陽性の結果が）Fmoc保護基の脱保護または不完全なカップリング反応を示しています。
3. 小規模開裂反応
   1. キャッププラグとコックを装備した3ミリリットルのポリプロピレンカートリッジに少量の樹脂を除去します。
   2. 95％TFA、2.5％水及び2.5％TISの2 mlの混合物を用いて治療します。
   3. RTで30分間混合物を振ります。
   4. ポリプロピレンカートリッジのフリットを用いて濾過することにより樹脂を除去し、窒素気流により溶剤を蒸発させます。
   5. 残渣を水に溶解し、HPLCを用いて、製品および/またはMSを分析します。

文化アッセイで10 ドノバンリーシュマニア前鞭毛生存率

1. ドノバンリーシュマニア （L.ドノバン ）の成長と処理条件
   1. 文化L. 26℃で4.5グラム/ Lのグルコース、L-グルタミンおよびピルビン酸ナトリウムを有するイーグル培地（DMEM）のダルベッコ改変でドノバンの前鞭毛期。
   2. L.トリートドノバンは、26℃で24時間環状ペプチド（100μM）でプロマスチゴート。
2. ドノバン・リーシュマニア （L.ドノバン ）生存率アッセイ
   1. 製造業者のプロトコルに従って、アラマーブルー20μlの寄生虫の生存率を評価します。
   2. （570nmの励起および590nm発光での）蛍光を測定することにより、アラマーブルーの削減を決定します。より高い蛍光値は、より高い代謝活性および増加した寄生虫の生存率を示しています。

Results

ここでは、特にリーシュマニア寄生虫の重要なのPPIを対象とし、（駆虫薬⁸⁷としてのPPIを対象とするペプチドについてのレビューのために）駆虫剤として作用バックボーン環状ペプチドの集中小さなライブラリの開発について説明します。小説の骨格環状ペプチドの合成により、ファーマコフォアは、拡張可能な大きさの足場に保存されています。ここで提案されている集中ライブラリーの強さは、環化反応を介して、立体配座の自由の制限度を可能にしながら、ペプチド足場の大きさを変化させる能力です。主鎖環状ペプチドの全合成は、のFmoc / tBuでのプロトコルに従って、固体支持体上に自動化されたマイクロ波合成装置を用いて行きました。環化は、リンカー、酸無水物/酸及びリジンの側鎖アミンとの間のアミド結合を作成することによって行いました。最終的な切断および側鎖の脱保護は、合成スキームおよびfのため（マイクロ波エネルギーなしで手動で行われましたinalの製品構造は、 図3）を参照してください 。生成物は、-20℃で保存し、白色粉末25mgを得、分取HPLCにより分析しました。生成物の試料は、MS（

Discussion

完全に自動化されたマイクロ波合成装置を用いてリーシュマニア寄生虫の欠如タンパク質由来の骨格環状ペプチドの集中ライブラリーの合成が記載されています。環状ペプチドの集中ライブラリが保存されたファーマコフォアと様々なリンカーを開発しました。そのような無水グルタル酸、無水コハク酸、アジピン酸、ピメリン酸、リジン、オルニチン、および他のビルディングブロックのような種々のリンカーの付加は、環状ペプチドのコンフォメーション空間の多様性を増加させることができます。フォーカスされた環状ペプチドライブラリーの合成は、研究者が最適な立体配座空間をスクリーニングすることができます。環状ペプチドの立体配座は、環の大きさや位置などのパラメータに依存して変化するので、異なる立体構造を有する多様な類似体は、生物学的構造-活性関係で有用であり得る、生成された^88を研究することができます。

SPPSの主な課題は、SYNTを診断されましたhetic進歩と問題解決なし中間体は単離されないからです。したがって、いくつかの比色試験は、カイザーとクロラニル試験により遊離アミンを識別する...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
試薬
固体サポート、リンクアミドAM樹脂ML	CBL	BR-1330	ローディング:0.49 mmol / g
Fmoc-Ala-OH	Advanced Chemtech	FA2100
Fmoc-Arg(Pbf)-OH	Advanced Chemtech	FR2136
FMOC-ASN(TRT)-OH	Advanced Chemtech	FN2152
Fmoc-ASP(OBut)-OH	Advanced Chemtech	FD2192
Fmoc-Cys(Trt)-OH	Advanced Chemtech	FC2214
Fmoc-Gln(Trt)-OH	Advanced Chemtech	FQ2251
Fmoc-Glu(OtBu)-OH	Advanced Chemtech	FE2237
Fmoc-Gly-OH	Advanced Chemtech	FG2275
Fmoc-His(Trt)-OH	Advancedケミテック	FH2316
Fmoc-Ile-OH	アドバンストケミテック	FI2326
Fmoc-Leu-OH	アドバンスドケミテック	FL2350
Fmoc-Lys(Boc)-OH	アドバンスドケミテック	FK2390
Fmoc-Met-OH	アドバンスドケミテック	FM2400
Fmoc-Phe-OH	アドバンスドケミテック	FF2425
Fmoc-Pro-OH	Advanced Chemtech	FP2450
Fmoc-Ser-(tBu)-OH	Advanced Chemtech	FS2476
Fmoc-Thr(tBu)-OH	Advanced Chemtech	FT2518
Fmoc-Trp(Boc)-OH	Advanced Chemtech	FW2527
Fmoc-Tyr(But)-OH	Advanced Chemtech	FY2563
Fmoc-Val-OH	Advanced Chemtech	FV2575
1-メチル-2-ピロリジノン(NMP)	シグマ	328634	注意有毒/非常に可燃性/刺激性。
N,N-ジメチルホルムアミド (DMF)	Alfa Aesar	43465	Caution Toxic. 高品質のDMFを使用して、DMF分解によるジメチルアミンの痕跡によるFmoc除去などの副反応を排除します。
ジクロロメタン(DCM)	Σ	D65100	<強>注意 有害な
ジブロモメタン(DBM)	Σ	D41868	<強>注意有害な
トリフルオロ酢酸(TFA)	Σ	T62200	<強>注意腐食性/有毒
なトリフルオロ酢酸、HPLCグレード(TFA)	Σ	91707	<強い>注意腐食性/有毒
なジエチルエーテル	Sigma	31690	<強い>注意非常に可燃性/有害な
トリイソプロピルシラン(TIS)	シグマ	233781	<強い>注意刺激性/可燃性
水、HPLCグレードの	シグマ	270733
アセトニトロ、HPLCグレード(ACN)	フィッシャーScientific	A998-4	注意 可燃性/刺激性/有害
N,N-ジイソプロピルエチルアミン(DIEA)	Sigma	3440	<強い>注意腐食性/高可燃性
ピペリジン	シグマ	W290807	<強い>注意有毒/非常に可燃性
ピリジン	シグマ	270970	<強い>注意 引火性/有害
エタノール(EtOH)	シグマ	459844	<強い>注意 引火性/刺激性の高い
1-ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物(HOBt)	シグマ	157260	<強い>注意非常に可燃性/刺激性/有害
O-(ベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N′,N′- テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロリン酸 (HBTU)	Sigma	12804	Hazardous
Benzotriazole-1-ly-oxy-tris-pyrrolidinophosphonium hexafluorphosphate (PyBOP)	Advanced Chemtech	RC8602	Caution 刺激性
ニンヒドリン	Σ	454044	Caution 有害
フェノール	シグマ	P3653	注意腐食性/有毒
なシアン化カリウム(KCN)	シグマ	11813	注意非常に有毒
水酸化カリウム(KOH)	シグマ	221473<	strong>注意有毒
N、N'-ジイソプロピルカルボジイミド (DIC)	シグマ	38370	注意 可燃性/有毒
4-ジメチルアミノピリジン (DMAP)	シグマ	522805	注意 有毒/刺激性
水グルタル酸	シグマ	G3806	注意 可燃性/刺激性/有害な
無水コハク酸	シグマ	239690	注意刺激性/有害な
アジピン酸	Sigma	A26357	注意有毒/刺激性
ピメリック酸		ΣP45001	注意有毒/刺激性の
クロラニル		Σ23290	注意有毒/刺激性
アセトアルデヒド	シグマ	402788	注意 可燃性/有毒
<強い> 機器
遠心分離機	ベックマン・コールター	アレグラ 6R 遠心分離
機 凍結乾燥機	Labconco	freezone 4.5
真空ポンプ	フランクリン 電気	モデル1101101416 3/4 HP	アルカテルフランクリンモーターのポンプ
ポリプロピレンカートリッジ 12 ml	適用分離	2419
12 ml ポリプロピレンカートリッジ用キャッププラグ	適用分離	8157
ポリプロピレンカートリッジ 3 ml	適用分離	2413
3 ml ポリプロピレンカートリッジ用キャッププラグ	適用分離	8054
ストップコック PTFE	適用分離	2406
チューブフラット、50 ml	VWR	21008-240
抽出マニホールド、20 極、16 x 100 mm チューブ	ウォーターズ	WAT200609
シェーカー、BD アダムス ニューテーター ミキサー	フィッシャー サイエンティフィック	22363152
Nalgene HDPE ナロー マウス IP2 ボトル、125 ml	フィッシャーサイエンティフィ	03-312-8
三角フラスコ	フィッシャーサイエンティフィック	FB-501、500 ml
加熱ブロック	サーモリン	1760 ドリバス
プレーンエンド付き使い捨てホウケイ酸ガラス管	フィッシャーサイエンティフィック	14-961-25
マイクロピペットとチップ フィンピペット	サーモ	20–200と100–1,000 &MU;l
HPLCバイアル - micro vl pp 400 µl PK100	VWR	69400-124
HPLCバイアル - ブルースナップイットキャップ	VWR	66030-600
分析HPLCカラム	Peeke Scientific	U1-5C18Q-JJ	ultro 120 5 & マイクロ;m C18Q、内径 4.6 mm 150 mm
分取 HPLC カラム、XBridge	ウォーターズ	OBD C18 5 µm カラム	19 mm × 150 mm
質量分析計	Applied Biosystems	Voyager DE-RP
窒素ボンベ
デシケーター
分析用RP-HPLCシステム 島津製作所LC-20			搭載機器:CBM-20Aシステムコントローラー、SPD-20A検出器、CTO-20Aカラムオーブン、2 x LC-20AD溶媒送液ユニット、SIL-20ACオートサンプラー、DGU-20A5デガッサー(米国メリーランド州島津製作所)。
CBM-20Aシステムコントローラー、SPD-20A検出器、CTO-20Aカラムオーブン、2 x LC-6AD溶媒送液ユニット、FRC-10Aフラクションコレクター	分取RP-HPLCシステム島津製作所LC-20