Photoconvertible PSmOrangeシステムを用いたGFPトランスジェニックゼブラフィッシュで細胞を追跡

サマリー

私たちは、GFPトランスジェニック背景におけるin vivo細胞追跡のための強力で、簡単で、安価なツールとして、フォトコンバーチブルPSmOrangeシステムを確立しました。このプロトコルは、ゼブラフィッシュモデルシステムにおけるその応用を説明しています。

要約

透明なゼブラフィッシュの胚(Danio rerio)の急速な発達と、細胞や組織の蛍光標識の組み合わせにより、生きている動物で発生する発生過程を視覚化することができます。目的の細胞は、組織特異的なプロモーターを使用して、トランスジェニック株の生成のための蛍光タンパク質(FP)の発現を促進することにより、標識することができます。この目的のために蛍光光変換性タンパク質を使用すると、発現ドメイン内の定義された構造を正確に追跡することができます。目的領域のタンパク質を照射すると、その発光スペクトルが変化し、特定の細胞または細胞クラスターが強調表示され、他のトランスジェニック細胞が元の色に戻ります。主な制限は、ゼブラフィッシュの多数の組織に対する既知のプロモーターがないことです。逆に、遺伝子およびエンハンサートラップスクリーニングは、膨大なトランスジェニックリソースを生成し、文字通りすべての胚構造を主にGFPで、またはそれほど広範ではない赤色または黄色のFPで個別に標識しています。このようなトランスジェニックバックグラウンドで定義された構造をたどるアプローチは、目的の細胞で変換できるユビキタスな光変換性タンパク質を追加で導入することです。しかし、利用可能な光変換性タンパク質は、緑色および/または頻度は低い赤色の発光状態¹を含んでおり、したがって、既存のトランスジェニック系統のFPバックグラウンドの細胞を追跡するために使用できないことがよくあります。この問題を回避するために、ゼブラフィッシュ^2,3用のPSmOrangeシステムを確立しました。このタンパク質の核型をコードする合成mRNAの単純なマイクロインジェクションは、すべての細胞核をオレンジ/赤色の蛍光で標識します。タンパク質の標的光変換により、その発光スペクトルは遠赤色に切り替わります。このタンパク質の量子効率と安定性により、PSmOrangeはゼブラフィッシュや他の魚種にとって優れた細胞追跡ツールとなっています。

概要

指数関数的に改善されたイメージング技術により、最大で約^{4日間連続}した期間にわたって発達過程を追跡することができます。ゼブラフィッシュやその他多くの動物モデルシステムでは、特定の細胞、組織、軸索または血管構造がトランスジェニックグリーンまたは時には赤または黄色の蛍光タンパク質によってマークされ、可視化が容易になります。しかし、ほとんどのトランスジェニック系統では、導入遺伝子は目的の細胞に特異的に発現するのではなく、追加の構造にも発現しているため、例えば単一細胞や細胞群の正確な追跡が妨げられています。

蛍光光変換タンパク質は、胚発生中の細胞追跡によく適しています。このようなタンパク質の適用のための前提条件は、長寿命の性質、変換時の発光範囲が十分に分離されていること、および明るい蛍光です。利用可能な光変換性タンパク質は、Kaede⁴、KiGR⁵、mEos2⁶、PS-CFP2またはDendra2⁷などの変換時に発光範囲が変化するものと、光活性化時にのみ蛍光を発するもの(PAmCherry⁸、PAGFP⁹またはPATagRFP¹⁰)を含む。しかし、既存のFPトランスジェニック動物の細胞を追跡するための応用は、緑色蛍光状態を伴うことが多いか、上記の基準をすべて満たしていないかのどちらかであるため、限定的です。つい最近、Subachらは、光変換時に発光がオレンジ/赤から遠赤色に変化するPSmOrangeタンパク質を報告し、培養細胞およびマウスに注入した培養細胞にうまく適用されました²。

生きた胚の細胞追跡に対するタンパク質の適合性を調査するために、ゼブラフィッシュの胚に核タグ付きH2B-PSmOrangeをマイクロインジェクションするための発現コンストラクトを生成しました。その結果、このタンパク質は、ゼブラフィッシュの胚発生の最初の4日間(場合によってはそれ以上)にGFPトランスジェニックバックグラウンドで細胞追跡を成功させるためのすべての前提条件を満たしていることがわかりました。この間、ほとんどの細胞回遊イベントは魚で完了し、PSmOrangeシステムはゼブラフィッシュツールキットへの優れた追加となります。

プロトコル

1. H2B-PSmOrange mRNAのin vitro転写およびmRNAの精製

1. 製造業者の指示に従ってNotI制限酵素を用いてPCS2 +プラスミドを含むH2B-PSmOrangeを線形。
   注：mRNAの汚染や劣化を防ぐために、手袋や白衣などの適切な保護を使用して、次の手順を実行します。
2. 製造業者のプロトコルに従ってPCR精製キットまたはフェノール - クロロホルムベースの方法を使用して線状化DNAを精製します。
3. 製造元の指示に従ってSp6の-mRNA転写のための線形化の鋳型DNA1μgのを使用してください。
4. 37℃で10-20分間、1.0 UのRNaseフリーのDNアーゼIを添加することにより、DNAを削除します。
5. RNAを製造業者のプロトコルに従ってキットをクリーンアップを使用したmRNAをクリーンアップします。
6. mRNAの純度および濃度を増加させるために、6μlの酢酸ナトリウム（3.0 M、pH5.2）を150μlの96％エタノールを添加することにより、mRNAを沈殿させます。メートルをインキュベート少なくとも30分間、および24時間まで-20℃でixedソリューション。
7. 4℃で45分間18.407×gで紡糸溶液により、mRNAを収集します。液体を捨て、150μlの70％エタノール中のmRNAを懸濁します。混合し、4℃でさらに15分間この溶液を遠心分離。 、液を捨て、氷上で5分間ペレットを乾燥し、20μlの超純RNaseを含まない水でのmRNAを懸濁します。
8. 100のmRNA希釈（99μlの超純RNaseを含まない水に1μlのmRNAの）：1の測光によるmRNAの濃度および純度を評価します。
9. 短期保存の場合、-20℃でのmRNAのソリューションを維持します。長期保存の場合、-80℃でのmRNAを保ちます。

ゼブラフィッシュ胚に2 H2B-PSmOrange mRNAのマイクロインジェクション

1. TG（foxD3：GFP）を使用して、注入前の交配ペア夜を設定します。 TG（FLH：GFP）ダブルトランスジェニック魚（または任意の他のGFPトランスジェニック魚）。スペーサーを配置することによって分離された魚を残しますそれらの間の交配の時間を制御します。
2. 注射の午前中にスペーサーを取り外し、20分間の魚の伴侶をしましょう​​。
3. 時間を交配時には、130頁の最終濃度にH2B-PSmOrangeのmRNAを希釈/ NLとmicroloaderチップを用いたマイクロインジェクションキャピラリーへの転送6μlの注射液（RNaseを含まない水で）。較正されたスライドガラスに注入量を確認してください。 2 NL mRNAの溶液（260頁）を注入する射出圧力を調整します。
4. 1xの胚（E3）培地を含む滅菌プラスチックペトリ皿に卵を収集します。
5. プラスチック製パスツールピペットを用いて射出皿に20〜30の胚を転送します。
6. 1細胞期¹¹で卵黄への細胞の細胞内へのまたはちょうど下の溶液を含む2 NLのmRNAを注入します。
7. 1×E3培地を含むペトリ皿に移す注入された胚は、未受精か正常に発達した胚を除去し、28℃でそれらを成長させます。
   注：ライトプロテクトO胚fを実験を通して必要とされていません。
8. 1×E3媒体にゼブラフィッシュの胚を高め、色素沈着を抑制するために、原腸形成した後、0.2 mMのPTU（1-フェニル2チオ尿素）を追加します。細菌汚染の危険性を最小限にするために1日2回培地を変更します。

3.胚の埋め込み

1. GFP（緑色）とPSmOrange（赤/オレンジ）蛍光ランプ及び適切な発光フィルターを装備した双眼顕微鏡を用いて共発現胚を選択します。 1×E3媒体を含む滅菌ペトリ皿に正の胚を移します。
2. 鉗子^12を用いて、実体顕微鏡下Dechorionate胚。
3. カット先端ピペット（P200）を用いて、超純水中で調製予め温めておいた1.0％低融点アガロース（LMA）の1.0ミリリットルを含む1.5ミリリットルチューブに1胚を転送します。注：80°CにLMAを温め、胚を埋め込む前に、室温で3〜5分間クールダウン。
4. 150μlのLMAに胚を移し微細なプラスチックチップを用いて、カバーガラスをチャンバー反転共焦点レーザー走査顕微鏡A1R +（または他の任意の適切な顕微鏡）について記載した実験においてダウン、例えば背側の胚の向きを調整します。 LMAが重合されると、麻酔のために0.2 mMのPTUと0.02％の3-アミノ安息香酸エチルメタンスルホン酸塩（トリカイン）を含む魚の水でチャンバーを埋めます。
5. サンプルを画像化する前に、トリカインの効果を確認するために15分を待ちます。麻酔は、明視野照明を装備した実体顕微鏡を使用してモニターすることができる胚の動きを、防ぐことができます。
   注チャンバは、二回再利用することができます。

4. PSmOrange光変換

1. 共焦点顕微鏡下でサンプルを置き、それぞれGFPとPSmOrangeを画像化するための488 nmおよび561 nmのレーザーを使用してphotoconvertする領域を特定するために、検体をスキャンします。
   注：反転STAに反転共焦点レーザー走査顕微鏡A1R +を使用GE顕微鏡イメージングソフトウェアによってTiEcontrolledと488 nmの、561 nmおよび光電およびイメージングのための640nmのレーザーを装備。しかし、アプリケーションが確実であれば変換し、イメージング用のレーザラインが利用可能であるように、この顕微鏡に限定されるものではありません。
   1. 所定の場所に（NA：0.75; WD：1.0ミリメートル; FOV：0.64 X 0.64ミリメートル）20X空気目標を置きます。
   2. 客観上記の焦点面で測定された0.74ミリワット、561 nmのレーザー：光変換前PSmOrangeタンパク質を検出するために、次の顕微鏡の設定を使用します。
      注：これは、このシステム上の40％に相当する（焦点面で測定することが効果的なパワーを決定する唯一の方法です）。 H2B-PSmOrange注入の効率などの実験の必要に応じてレーザパワーを調整し変更することができます。
   3. 関心領域を強調するためにズーム倍率を追加します。高い倍率は、画像取得時間、したがって、光毒性を減少させます。
2. 被覆構造zスタックを取得488 nmおよびシーケンシャルモード（ラインモード1-> 4）で561 nmのレーザーを使用して、関心の秒。 1.0と2.0ミクロンの間のzステップを修正しました。ライン平均及び走査周波数は、画質を最適化するために使用することができます。
3. サンプルをスキャンし、関心領域をphotoconvertにエリアをハイライトする（ROI）ツールを選択します。刺激領域としてROIを修正しました。写真アクティベーション/漂白モジュールを選択し、それぞれのチェックボックスをオンにして、488 nmのレーザーを活性化し、80％（客観的に測定された1 mWのレーザパワー）に488nmレーザーを設定します。 0.5秒/フレームへのスキャン速度を設定します。
4. 光変換ユーティリティ（ND刺激）を開き、光変換設定を指定します。
   1. 光変換プロトコルを指定するには、「追加」コマンドをクリックします。
   2. 「取得/刺激」メニューの「取得」の「フェーズ」1に設定し、画像の数が「ループ」メニュー内の光変換前に取得することを示しています。
   3. セント "に設定し、「フェーズ」2imulation「刺激イベントの数を入力するには、実行されます。
   4. 調整 "フェーズ" 3 "相" 1.オプションで説明したように、画像取得の最後のラウンド前に待機する時間を入力して、「フェーズ」2後の待機「フェーズ」を挿入します。
   5. すべてのパラメータを設定したら、刺激の設定を適用し、光変換を実行します。
      注意：レーザーパワーを、光変換の各ラウンドのためのスキャンおよび反復回数の周波数が変動し、胚から胚に異なる場合があります。で開始する設定を表1に示します。
5. 488 nmの、561 nmおよび上記のように設定を適用する640 nmのレーザーを使用して、最終的なzスタックを取得します。 （4.5 mWまで）高いレーザパワーを使用して、変換PSmOrangeを可視化するために640 nmのレーザーを設定します。

LMAから5.ディスマウント胚

1. 顕微鏡からチャンバーを含む胚を削除してください。慎重にアガロースのuから胚を削除鉗子を歌います。
2. 新しい滅菌プラスチックペトリ皿にまたは1x E3および0.2 mMのPTUを含む滅菌6ウェルプレートに胚を移します。開発の所望の段階まで、28℃で胚をインキュベートします。

6. Photoconverted PSmOrangeタンパク質発現細胞の運命を分析

1. ポイント3.3と3.4で説明したように、胚を再埋め込みます。
2. 共焦点顕微鏡下でサンプルを置き、関心のGFPトランスジェニック構造（488 nm）の中でphotoconverted細胞（640 nm）を識別するための試料をスキャンします。
3. 488 nmの、561 nmおよびシーケンシャルモード（ラインモード1-> 4）で640 nmのレーザーを使用して、関心の構造をカバーzスタックを取得します。 1.0と2.0ミクロンの間のzステップを修正しました。ライン平均及び走査周波数は、画質を最適化するために使用することができます。
4. これは共発現GFPとphotoconvertedタンパク質、細胞を同定するために、次のいずれかの方法を使用します。
   1. カスタム作られた自動フィジーイメージJマクロ³
      1. コンボリューション「GaussianBlur」プラグインを使用して、元のスタック（→プロセス→GaussianBlur→フィルター）と「画像電卓」プラグイン（→プロセス→イメージ電卓）を使用して、元からのスムーズなスタックを引きます。関心の構造を視覚化し、分析のための計算時間を短縮するために、この手順を使用します。
      2. photoconvertedセルを強調表示するために、緑と遠赤チャンネルに特定のしきい値を適用します（→イメージ→→しきい値を調整します）。適切な設定で、閾値領域を検出するために、「粒子の分析」ツールを使用します（→粒子を分析→分析）。
      3. 「イメージ電卓」プラグインを開き、黄色（→プロセス→イメージ電卓）に緑と遠赤​​のチャンネルに重複の関心領域を表示します。
   2. 3Dデータ評価のための顕微鏡イメージング・ソフトウェア
      1. スタックを表示しますショーのボリュームビューオプション（→3Dビジュアライゼーションメニュー→表示ボリュームビュー）を使用して3D。 、緑、赤と遠赤色のチャンネルを選択明るさとコントラストを調整し、photoconvertedエリア（ 図1）を強調するために3Dスタックをトリミングするグラフィックインターフェースを使用してください。
         注：データを分析するための同様の方法は、画像解析のための一般的なソフトウェアのほとんどで利用可能です。

結果

図1は、PSmOrange光変換システムの一例を示す図です。松果体複合体は、脊椎動物の背側間脳に保存された構造です。多くの他の脊椎動物のように、この複合体は、間脳の中心部にある松果体器官および左側parapineal細胞で構成されています。エレガントが、時間のかかるアンケージング実験はparapineal細胞が松果体臓器¹³の前部に由来することを示しました。 Tgの（foxD3：GFP）; TG（FLH：GFP）トランスジェニック胚は、松果体とparapineal両方の細胞は、開発中に標識されています。 PSmOrangeシステムの適合性を評価するために、我々は報告松果体複雑な開発を再現するためにこれらの胚を使用していました。 PSmOrange、H2B-PSmOrangeの核型をコードする260のPG mRNAは、すべての細胞核においてタンパク質を発現させるために1細胞期の二重トランスジェニック胚に注入しました。注入された胚を24時間後fertilizatまで28℃でインキュベートしました。イオン（HPF）、GF...

ディスカッション

蛍光レポーターを有するトランスジェニック胚は、胚の発達を理解するために根本的に貢献しています。しかし、特定の構造の特定の視覚化を容易にするプロモーターに必須の必要性が依然として存在します。彼らの不在下では、研究者が興味のある構造の起源と発展について調べるために、このような蛍光タンパク質の光変換などの技術に依存しています。これにより、その発達に関与する分子機構を同定するための重要な前提条件です。ゼブラフィッシュ分野における技術の進歩は、現在のアプローチ^14,15にCRISPR-Cas9媒介ノックを使用して、インスタンスのためのトランスジェニック系統、photoconvertibleタンパク質でFPを交換することができます。しかし、この技術は、比較的時間がかかり、常に成功していません。これとは対照的に、普遍的にGFPにH2B-PSmOrangeを表明し、おそらく他のトランスジェニック背景の適用は、EMを介して細胞を追跡する単純明快な技術でありますbryonic開発。

例えば、ゼブラフィッシュ腹habenulaの複数形の起源、脊椎動物の背側間脳内の保存された神経伝導...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
PCR精製キット	Qiagen	28104
mMESSAGE mMACHINE SP6 転写キット	Ambion	AM1340
RNeasy MiniElute クリーンアップキット	Qiagen	74204
プラスチックパスツール	アルファ研究所	LW4000
オリジナルH2B-PSmOrange プラスミド	Addgene	31920	論文に記載されているプラスミドは次のとおりです。Carl lab
FemtoJet Microinjector	Eppendorf	5247 000.013
Forceps (5 Inox)	NeoLab	2-1633
Lab-Tek II Chambered #1.5 German Coverglass System	Nunc	155382
Nikon A1R+	Nikon GmbH ドイツ	No Number
Nikon PLAN Apo & lambda; 20X air objective	Nikon GmbH Germany	No Number
NIS Elements AR Software (v. 4.30.02)	Nikon GmbH Germany/Laboratory Imaging	No Number