Bioprinting細胞化は、組織特異的ヒドロゲルBioinkを使用して構築します

Summary

我々は、一緒に機能し、生存可能な3次元組織構築物はインビトロスクリーニング用途に使用するためbioprinted可能な組織を模倣ヒドロゲルbioinkを提供するプロトコルのセットを記述する。

Abstract

バイオプリンティングは、組織工学的な臓器構築物を作成するための汎用性の高いバイオファブリケーションアプローチとして登場しました。これらのコンストラクトは、患者への移植のための臓器代替物として、また、より小さなスケールで作成した場合、薬物および毒物学スクリーニングのためのin vitroシステムで使用できるモデル「オルガノイド」として使用される可能性があります。

多種多様なバイオプリンティング装置の開発にもかかわらず、バイオプリンティング技術の適用は、バイオプリンティング手順を迅速化し、組織特異的な手がかりを提供することで細胞の生存能力と機能をサポートする材料の利用可能性によって制限される可能性があります。ここでは、組織特異的な生化学的シグナルを提供し、in vivo組織の機械的特性を模倣できる、マルチクロスリンカー、2ステージ架橋プロトコルで構成される汎用性の高いヒアルロン酸(HA)およびゼラチンベースのハイドロゲルシステムについて説明します。

生化学的因子は、強力な成長因子を含む組織由来の細胞外マトリックス材料を組み込むことによって提供されます。組織の機械的特性は、さまざまな分子量、形状(直鎖状またはマルチアーム)、および官能基を持つPEGベースの架橋剤の制御された組み合わせであり、広範囲(100 Pa〜20 kPa)にわたって押出可能なバイオインクと最終コンストラクトせん断剛性値が得られます。これらのパラメータを使用して、ハイドロゲルバイオインクを使用して、肝臓特異的バイオインクで初代肝スフェロイドをバイオプリントし、高い細胞生存率と測定可能な機能的アルブミンおよび尿素出力を備えたin vitro肝臓コンストラクトを作成しました。この方法論は、幅広い組織構築物タイプのバイオファブリケーションのためのヒドロゲルの将来のカスタマイズに適応できる一般的なフレームワークを提供します。

Introduction

近年では、様々な技術は、それらを製造し、またはbiofabricateしようとしていることにより、機能の臓器や組織の代替エネルギー源の必要性に対処し、その利用可能になっています。 Bioprintingは、これらの技術の最も有望なの一つとして浮上しています。 Bioprintingが3次元でパターン生存器官状又は組織様構造を構築したりするために使用することができる生物学的部品のロボット添加剤製造の形態と考えることができる。多くの場合^{1、bioprinting} 3（3次元を使用しますこれにより、解剖学的に模倣生理的なアーキテクチャを反復する、正確な位置への細胞や生体材料を堆積するために、コンピュータによって指示される-D）印刷装置^。2これらのデバイスは、細胞凝集体の形態をとることができる「bioink」を、印刷、ヒドロゲルに封入された細胞または粘性流体、または細胞を播種したマイクロキャリア、ならびに無細胞PLAのような機械的な構造または行為を提供する無細胞ポリマーceholders ^3,4 bioprintingプロセスに続いて、得られた構造は、機能的な組織または器官の構造体へと成長することができ、その意図された最終用途に使用される^。5,6日に、完全な完全に機能する人間サイズの器官が印刷されていません、しかし、それは研究開発をbioprintingの主要な長期にわたる目標である^。2しかし、「オルガノイド「組織構築物は、現在病理学モデリング、薬剤開発、および毒性スクリーニングなどのアプリケーションの数に実装されている小規模な。

研究者はbioprinting技術を適用する際に発生した主な障害の1つは、非常にいくつかの材料がbioprintingの明示的な目的のために開発されているということです。効果的bioprintingで成功するために、生体材料は、4つの基本要件を満たす必要があります。生体材料の堆積を可能にする1）適切な機械的特性を有する必要がある（これは、ゲルまたはIのようなノズルを通して押し出すこと液滴としてnkjet）堆積後の3-D構造の構成要素としてその形状を保持するために、2）能力、3）2前の特性のユーザ制御、および4）セルフレンドリーで協力的な環境では、すべてのための機能bioprinting手順の段階^。7歴史的には、仕事をbioprintingことが多い代わりにbioprintingとその後のポスト印刷用途に必要な性質を持っている生体材料の設計、彼らの互換性を考慮せずにbioprintingデバイス内の既存の伝統的な生体材料を採用しようとしています。

bioinksの様々な堆積および製造ハードウェアとのより良いインタフェースに最近開発されてきました。彼らは一般的にどちらかの前駆体として不十分な機械的特性、または場合はノズルを詰まらせることができます印刷または押出プロセス時に壊れなっ重合ヒドロゲルと流体ソリューションを存在するため、標準的なハイドロゲルシステムは、重大な問題を提起します。私たちのチームだけでなく、パーソナルプラグインRSは、ヒドロゲル基質への細胞スフェロイド印刷、マイクロキャピラリーチューブから^5,8セルとハイドロゲルフィラメント押し出し、動的架橋特性を有する^9-11押出可能なヒアルロン酸（HA） -金ナノ粒子ヒドロゲルを含むこれらのbioprinting問題に対処するために、様々なハイドロゲル製剤を、模索しています、光重合性を使用して、ハイドロゲル剛性の¹²時間的制御は^、17 HAおよびゼラチン^、13フィブリノゲン-トロンビン系架橋^、14,15のイオン交換アルギン酸-コラーゲンゲル^、16をメタクリル化し、最近の急速な重合紫外線（UV）-initiated架橋

これらの例は、によって効果的にbioprintedことができる材料を生成することの実現可能性を実証します。しかし、成功した生存可能で機能的な3次元組織構築物を生成する、ハードウェアとの統合に加えて、生体材料は、細胞の維持に援助することを生化学的および機械的な手がかりが含まれている必要があります生存率および機能。これらの付加的な要因、生化学的および機械的なプロファイルは、bioprinted組織構築の成功の機能に大きな影響を持つことができます。

両方の細胞およびネイティブ細胞外マトリックス（ECM）は、成長因子および他の細胞の他のサイトカインなどのシグナル伝達分子の広い範囲を提示する責任があります。これらの信号の組み合わせは、組織への組織によって異なりますが、細胞や組織の行動を調節するのに非常に強力で影響力のあることができる^。18で検討されている異なる器官からの組織特異的なECM成分を採用し、ヒドロゲルとして、またはヒドロゲルの一部として実装します、与えられた組織を脱細胞化して粉砕し、それを溶解から構成されている成功^。19-21このアプローチは、任意の組織からの組織特異的生化学的シグナルを生成するために使用することができ、3次元ヒドロゲル構築物に組み込むことができる^。22

さらに、それは広く、体内の組織は剛性の広い範囲を占めることが文書化されている。このように^23、調整する能力、そのような弾性率E 'または剪断弾性率G'のような生体材料の機械的特性は、組織工学における有用なツールであります。上述したように、bioink機械的性質の制御は、次いで、さらに弾性率のレベルは標的臓器の種類のものと一致する達成可能な後の時点にて二次架橋することによって操作することができ、ソフトゲルを用いた押出によるbiofabricationを可能にします。例えば、生体材料は、天然の肝臓^、23のように5〜10キロパスカルの剛性を一致させるか、理論的には^24,25の中に機能するこれらのオルガノイドの能力を増加させ、ネイティブの心臓組織のような10〜15キロパスカルの剛性と一致するようにカスタマイズすることができましたその天然の組織の対応と同様に。細胞表現型への環境剛性の影響はEXPとなっています特に幹細胞については、近年lored。エングラーら基板弾性が基板のそれに一致する組織の弾力性と系統に向かって間葉系幹細胞（MSC）の駆動に支援することを実証した^。25この概念はさらに、筋肉、心臓機能、肝表現型、造血幹細胞の増殖への分化のために検討されています、および幹細胞治療可能性の維持^{。24,26-29が}同調することができることは、異なる弾性率のヒドロゲルは、組織構築物をbiofabricateするために使用される生体材料の重要な特徴である^。30

ここでは、押出bioprintedできるヒドロゲル系を処方するために我々の研究室で使用される汎用性の高いアプローチを示し、特定の組織型の生化学的プロフィールを含み、2）その組織タイプの弾性率を模倣する、1）、カスタマイズプロトコルを記述する。これらの要件に対処することにより、我々は、pに目指しますin vivoでの物理化学的および生物学的特性を再現することができる材料をrovide組織^。31は、本明細書^に記載^のモジュール式のハイドロゲル複合システムは、押出可能のbioinksを得るために、マルチ架橋アプローチを活用し、安定させる二次架橋を可能にし、剛性を増加させます最終生成物は、組織タイプの範囲と一致します。生化学的なカスタマイズは、組織特異的なECM成分を使用することによって満たされます。デモンストレーションとして、我々は機能的肝オルガノイドの構築をbioprintするために、このヒドロゲル系の肝特異的多様性を採用しています。記載されているプロトコルは、カスタムの3-D bioprintingデバイスを使用しています。一般に、このプロトコルは、ほとんどの押出によるプリンタに適合させることができる、特定の印刷パラメータは、デバイスの種類ごとに劇的に変化し、ユーザによる検査を必要とします。

Protocol

1.ハイドロゲルBioink製剤と準備

1. 先に肝臓に記載のようなソリューションをダイジェスト、組織特異的な生化学的プロフィールを提供する組織特異ECMを調製するために^、20
   注意：一般的には、このECMダイジェストが使用される最終的なヒドロゲルbioink体積の40％を含むであろう。 ECM消化溶液の数百ミリリットルを調製等分し、そして将来の使用のために-80℃で凍結することができます。
2. （2-ヒドロキシエトキシ）-2-メチルプロピオフェノンを、水中0.1％のw / vの - 、製剤ヒドロゲル光開始剤を溶解し、2-ヒドロキシ-4 'の前。
   注：50〜100ミリリットルの範囲内のボリュームは、事前に準備することができ、数ヶ月間、4℃で遮光保存しました。
3. ヒドロゲルbioinksを形成するために、最初に水、光開始剤の溶液中のヒアルロン酸（HA）ハイドロゲルキットからの基材成分を溶解します。
   1. 水-Pで別々にチオール化HAおよびチオール化ゼラ​​チンを溶かしますVソリューション/ wの2％を作るためにhotoinitiator溶液（ステップ1.2）。
   2. 8％のw / v溶液を作るために水 - 光開始剤溶液（ステップ1.2）中のポリエチレングリコールジアクリレート（PEGDA）、ヒドロゲルキット中の架橋剤を溶解させます。
   3. 8％重量/容量の溶液を作るために水 - 光開始剤溶液（ステップ1.2）に、ポリエチレングリコール（PEG）8アームアルキン（10kDaのMW）を溶解します。
4. 追加のカスタマイズが可能であるが、一般的に、以下のスキームを使用して、ヒドロゲルを形成します。
   1. 一般的な非組織として2％のHAをチオール化4部、4部の2％チオール化ゼラ​​チン、1部の架橋剤1 1部の架橋剤2~8を有する部品組織のECM溶液および2部の肝細胞培養培地（HCM）（または10部の水を結合固有ヒドロゲル）。
      注：追加の未修正のHAまたはゼラチンがよりスムーズにbioink押し出しを作るために添加することができます。これは、以下に説明します。
5. 使用前に混合する10秒間ボルテックス高（速度10のうち10）上で得られた混合物を。
6. ヒドロゲルbioinkの使用
   1. 押出又はbioprinting試験のために、注射器またはプリンタカートリッジ内に混合物を移し、それを37℃で30分（ステージ1架橋）のために自然に架橋することを可能にします。
   2. レオロジー測定のために35mmのペトリ皿に混合物を移し、それを30分間架橋することを可能にします。
      注：この混合物は、直ちにチオール - アクリレート結合形成を介して架橋し始め、粘度が増加し始めます。混合物を転送中に、ピペットまたはシリンジの目詰まりを避けるために、10分以内に注射器、プリントカートリッジ、またはターゲットの場所に転送する必要があります。
   3. 二次架橋（ステージ2）が望まれる場合、チオール-アルキン重合反応を開始する段階に紫外線（波長365nm、18 W / cm ^2）を1架橋ゲルを照射します。
      注：照射時間は、材料の表面積に依存します。一般に、材料の平方センチメートルは1-必要ですこのUVパワーでUV露光の2秒。

2.プリンタの互換性テスト

1. 標準の注射器と小さなゲージの針先端（20〜30ゲージ）を使用して、簡単な押出試験で実験台上bioprintingデバイスとの統合テスト、テスト押出特性に先立ち。
   1. いくつかまたは全くバンプ付きヒドロゲルの円滑押し出されたフィラメントを達成するために、標準的な注射器を介してbioinkを押してください。線または単純なパターンの押出は、成功を決定するのに十分です。
2. bioprinterの統合については、プリンタのカートリッジにそれらをピペットで準備をbioinkロード、およびbioinkのための30分は、カートリッジ内に自発的なステージ1の架橋を受けることができます。
   注：bioinkの体積が特定のアプリケーションに依存し、ユーザによって決定されるべきです。プリンタのカートリッジは、似ているかbioprinterデバイスと互換性のある注射器であってもよいです。
3. 押し出しの互換性を評価しますbioinkを使用して単純なパターンを印刷することによってbioprintingため。例えば、平行線で構成される7×7ミリメートルのパターンを印刷します。約300mm /分の速度でXY平面内でプリントヘッドを移動しながら、圧力（ 例えば、20 kPaの空気圧）を適用します。
   注：様々なサイズのプリントヘッドのノズル径を用いることができるが、400〜500μMの直径の開口を有する円錐形のノズルは250〜350μmの範囲のスフェロイドを印刷するために最適です。
   1. 押出材がゴツゴツまたは不規則である場合は、ステップ2.4​​を参照するか、ステージ1架橋された材料を軟化させるPEGDAの量を減らします。適切に準備bioink製剤は、所望のパターンまたはアーキテクチャで正確な堆積を可能にする、スムーズに押し出します。
      注意：使用に特に組織構造物の印刷のために家に設計されたカスタムの3-D bioprintingデバイスを記載bioprinting手順を³²など、特定の印刷パラメータは、デバイスの種類ごとに劇的に変化し、TESTINを必要とするように。ユーザーによるグラム。
4. 押出特性を改善するために、（それぞれ、1.5 mg / mlで、30 mg / mlで）bioinksに未修飾HAおよびゼラチンを補います。

原発性肝構築とBioprinting 3.検証

1. 細胞成分³³ ​​としてハンギングドロップ法により3次元一次細胞、肝スフェロイドを準備
   注：Bioprintingは、同様にハイドロゲルbioinksに懸濁させ、個々の細胞を用いてスフェロイドずに行うのではなく、することができます。スフェロイドは、細胞 - 細胞相互作用を促進し、機能性を構築するためにここで使用されています。使用スフェロイドまたは細胞の数は、特定の用途に依存し、ユーザによって決定されるべきです。これらの手順は、滅菌用品を使用して、無菌条件下で行うべきです。
   1. 肝細胞基本培地（HBM）および滅菌フィルタにHCMサプリメント成分キットの解凍内容を追加することで、HCMを準備します。
      1. サプリメント成分未解凍液体ゴマ。
      2. 硫酸ゲンタマイシン/アンホテリシンBを0.5ml;ヒドロコルチゾン21-ヘミスクシネート0.5 mlであり、インスリンは0.5 mlで10 mlのウシ血清アルブミン[脂肪酸フリー]; 0.5mlの補助成分（アスコルビン酸を追加したヒト組換え上皮成長因子、0.5ミリリットル、転送、0.5ミリリットル）500ミリリットルHBMへ。
      3. ボトルトップフィルターユニットまたはシリンジチップフィルターを使用して、0.45μmのか、0.22μmのフィルターを通して滅菌濾過します。
   2. 各細胞型は、製造業者の指示に従って、解凍された後、血球計数器で計数することによって、一次ヒト肝細胞、クッパー細胞、および星細胞の細胞密度を決定します。
   3. コニカルチューブ中で37℃に温めされたHCM培地中の細胞数で80:10:10の割合で、一次ヒト肝細胞、クッパー細胞、および星状細胞を組み合わせます。
      注：使用するメディアの量は、アプリケーションに固有の全体的な細胞数に依存し、第によって決定されるべきですEのユーザ。
   4. 20℃で520×gで5分間、細胞懸濁液を遠心します。
   5. 細胞ペレットを残し、上清を吸引除去します。
   6. 40μlの培地あたり1,000個の細胞を含む細胞懸濁液を得HCM培地中で細胞ペレットを再懸濁します。総容積が生成されるスフェロイドの数に依存しています。
   7. ドロッププレートを吊り96ウェルフォーマットに細胞懸濁液を移します。多細胞スフェロイドを形成している間に3日間、5％CO ₂で、HCMで各ウェルに約1,000セルの合計を追加し、37℃で維持します。
   8. ピペッターを使用して、懸滴プレートから肝スフェロイドを収集します。滅菌15ミリリットルコニカルチューブに移します。
2. 肝臓特異的ヒドロゲルbioinkでBioprint肝スフェロイド
   1. 架橋剤として8％PEGDAと8％の8アームPEGのアルキンを用いて、ステップ1で説明したように、肝臓のECM含有ヒドロゲルbioinkの製剤を準備します。 RESUにその能力のために、この組み合わせを使用しますネイティブの肝臓組織にずり弾性率の近いヒドロゲル中にlting。
   2. スフェロイドは、それらが、ステップ3.1.7に配置された円錐管の底に沈殿してみましょう。これは、回転楕円体の大きさや密度に基づいて変化するが、一般的に1〜2分以内に起こります。慎重に吸引することにより、またはピペットですべてのメディアを削除します。
   3. スフェロイドを含むコニカルチューブに新たに調製されたヒドロゲルbioink液の所望の体積を転送します。一般に、適切な量は、印刷される3次元構造物の体積の10％-25％大きいです。慎重ヒドロゲルbioink溶液中でスフェロイドを再懸濁するために上下にピペットと。ピペットまたは血清学的ピペットを用いてbioprinterカートリッジに移します。
   4. bioprinterカートリッジの内部に、溶液を30分間、最初の架橋段階（チオール - アクリレート反応）を受けることを可能にします。
      注：回転楕円体のサイズに応じて、カートリッジがあることが必要になることがあり、ゆっくりと回転または内容と混合する必要があるかもしれませんステージ1の架橋中にbioink全体に分布してスフェロイドを維持するための無菌へら。これは、懸濁された細胞の代わりに、スフェロイドを用いて調製bioinksの必要性が少ないです。
      注：ステージ1の架橋に続いて、ユーザーは数時間の操作ウィンドウを持っています。しかし、細胞生存率を改善するために迅速にbioprinting処理を行うことが推奨されます。
   5. ステージ1の架橋後、原発性肝スフェロイド（または他の細胞）を含む、所望のヒドロゲル構造を作成するbioprintingデバイスを使用します。
      注：この技術は、構造体の様々なbiofabricatingためのシステムを提供します。そのような総容積のようなパラメータは、細胞またはスフェロイドの数、印刷構造体の幾何学的形状、および構築物が印刷された基板は、ユーザの目的に大きく依存しています。
   6. 所望の形状に堆積した後、共安定化、二次架橋メカニズムを開始するために2-4秒間UV光を管理しますnstructsと所望のレベルまでの剛性を高めることができます。
      注：PEG-アルキンの濃度、ひいては全体的な最終の架橋密度は、主に、最終的な構築物の剛性を制御します。
   7. 多層構造を作成するために、ステップ3.2.4と3.2.5を繰り返します。

Results

上記の手順が正しく実行されると、ヒドロゲルは、標的組織型に特異的な生化学的プロファイルが含まれている必要があり^、20は bioprintingと、最終的な弾性率^、34を超える高度の制御を可能にし、組織構築物中の生存機能セルをサポートしています。

ハイドロゲルのカスタマイズ
最良模倣ネイティブ肝臓に、ヒドロゲルbioinkが肝臓ECM溶液および増殖因子配列によって補充した^、20 ECMソリューションは、成長因子およびサイトカイン（pg / mlで示す、 図1A）の多種多様を含みます。これらは、脳由来神経栄養因子（BDNF）、bFGFを、骨形成タンパク質5（BMP-5）、FGF-4、インスリン様増殖因子結合タンパク質2（IGFBP-2）、TGF-b1を、BMP-7、EGFを含みます...

Discussion

ヒトでまたはin vitroスクリーニングアプリケーションのための最終的な使用のために、3次元組織構築をbiofabricateしようとしたときに考慮することが重要であるいくつかのコンポーネントがあります。 biofabricationデバイス自体が終了コンストラクトに到達するための一般的な方法論を決定しながら、適切な細胞成分を採用することにより、エンド潜在的な機能性を決定します。それは二重の役割を果たすように、第3の成分、生体材料は、同様に重要です。具体的には、生体材料の成分は、biofabricationハードウェア（ すなわち 、bioprinters）の両方と互換性があり、また、潜在的に脆弱な生体細胞のコンポーネントをサポートしている必要があります。 bioprintable材料はいくつかの重要なパラメータを満たすために必要があるとして、これらの要件の両方を最適化することは、困難な場合があります：1）効率的で邪魔されない印刷を容易にするために、適切な化学的、機械的、および時間的特性を有しています。 2）準備段階とbioprin中に細胞生存率をサポートティン手順と、 3）と最高bioprinti...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ヒアルロン酸	シグマ	53747
ラチン	シグマ	G6144
2-ヒドロキシ-4&プライム;-(2-ヒドロキシエトキシ)-2-メチルプロピオフェノン	シグマ	410896
ヒアルロン酸およびゼラチンハイドロゲルキット(HyStem-HP)	ESI-BIO	GS315	キットには、ヘプラシル(チオール化およびヘパリン化ヒアルロン酸)、ジェリン-S(チオール化)が含まれていますゼラチン)、およびExtralink(PEGDA)
PEG 8アームアルキン、10 kDa	Creative PEGWorks	PSB-887
初代ヒト肝細胞	トライアングル研究所	HUCPM6
初代ヒト肝臓 星状細胞	ScienCell	5300
初代ヒトクッパー細胞	ライフテクノロジー	ズ HUKCCS
肝細胞基礎培地 (HBM)	ロンザ	CC-3199
肝細胞培地サプリメントキット	ロンザ	CC-3198	HCM シングルクォートキット (アスコルビン酸含有、0.5 ミリリットル;ウシ血清アルブミン[脂肪酸フリー]、10 ミリリットル;硫酸ゲンタマイシン/アムホテリシンB, 0.5 ミリリットル;ヒドロコルチゾン21-ヘミスコハク酸、0.5 ミリリットル;インスリン、0.5 ミリリットル;ヒト組換え上皮成長因子、0.5 ミリリットル;転送中、0.5 ml)
トリトン X-100	シグマ	T9284	他のメーカーは大丈夫です。
水酸化アンモニウム	フィッシャーサイエンティフィック	A669	他のメーカーは大丈夫です。
新鮮な豚の死体組織	n/a	/a
凍結乾燥機	any	n/a
冷凍庫 ミル	any	n/a
バイオプリンター	n/a	n/a	ここに記載されているバイオプリンターは、社内でカスタムビルドされました。一般に、他のデバイスは、ハイドロゲル材料のコンピュータ制御の押出ベースの印刷をサポートしている限り、十分です。
吊り下げ式ドロップセル培養プレート	InSphero	CS-06-001	InSphero GravityPlus 3D培養プラットフォーム