ここでは、in vivoおよびex vivoの特定の生理学的応答に関与するニューロン集団の同定に使用される古典的な技術であるc-FOSタンパク質免疫組織学的検出に基づくプロトコルを紹介します。
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この記事について
サマリー
要約
多くの研究は、特定の生理的な規制に関与する脳領域を特定し、マップしようとしています。癌原遺伝子C-FOS、前初期遺伝子は、種々の刺激に応答してニューロンで発現されます。タンパク質生成物は、容易にそれらの活性の変化を表示するニューロンのグループをマップするC-FOSの検出の使用につながる、免疫組織化学的技術を用いて検出することができます。この記事では、低酸素症または高炭酸ガスに換気の適応に関与脳幹ニューロン集団の同定に焦点を当てました。 2つのアプローチが、動物の生体内で関与する神経細胞集団を同定することが記載され、ex vivoでの求心路遮断脳幹準備インチインビボ 、動物は。高炭酸ガスまたは低酸素ガス混合物にさらされたex vivoで 、求心路遮断準備が低酸素や高炭酸ガス人工脳脊髄液で灌流しました。両方の場合において、いずれかの制御インビボ動物またはE でX vivoでの製剤は、正常酸素とnormocapnic条件下で維持しました。これら二つのアプローチの比較は、インビボにおいて 、末梢および/ または中枢ニューロンの活性化、すなわちの起源の決意を可能にし、 エクスビボ 、brainstemsを集め、固定し、切片にスライスしました。切片を調製した後、C-FOSタンパク質の免疫組織化学的検出は、低酸素または高炭酸ガス刺激によって活性化された細胞の脳幹のグループを識別するためになされました。標識された細胞は、脳幹の呼吸器の構造で計数しました。対照条件と比較して、低酸素症または高炭酸ガス血症は、c-FOSの数を増加させ、したがって、中央呼吸ドライブの適応に関与するニューロン経路の構成されているいくつかの特定の脳幹部位で細胞を標識しました。
概要
C-fosの遺伝子は、1980 1,2の初めに初めて同定し、その産物は、遺伝子活性化剤の特性3,4を有する核タンパク質として1984年に特徴づけられました。これは、ニューロンの刺激に関連した長期的なメカニズムに参加しています。実際に、ニューロンの活性の変化は、転写因子のc-FOSの産生を誘導する前初期遺伝子c-FOSの発現を誘導する二次メッセンジャーシグナル伝達カスケードにつながります。後者は、後期遺伝子の発現を開始し、したがって、刺激4多くの異なる種類の神経系の適応応答に関与しています。したがって、1980 5,6の端部から、C-FOSタンパク質の検出は、しばしば、ニューロン経路をマッピングするための一般的な4および中枢神経系（CNS）の活性に遺伝子転写の外因性因子の効果を研究するために使用されています異なる生理学的に関与アル条件。
基底のc-fosの発現は、マウス、ラット、ネコ、サル、およびヒトの4を含む様々な種において研究されています。これにより、その発現の動態は比較的よく知られています。転写活性化は、（5〜20分）7,8迅速であり、かつmRNA蓄積を刺激9の発症後30〜45分の間で最大に達し、12分の短い半減期で低下します....
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プロトコル
注：C-FOSの検出は、いくつかのステップ（ 図1）を含む標準化された手順です。全ての実験は、ラットまたはマウスで行いました。実験プロトコルは、動物実験チャールズ・ダーウィン（CE5 / 2011/05）に倫理委員会によって承認された動物のケアのために9月22日の欧州共同体理事会、2010（63分の2010 / EU）に基づいて行われ、に従って行いました動物のケアのためのフランスの法律に。
ソリューションの調製
- 0.2 Mリン酸ナトリウム緩衝液を準備します。攪拌しながら、6.24グラムののNaH 2 PO 4・2H 2 Oおよび22.56グラムのNa 2 HPO 4 *のH 2 Oを1リットルの蒸留水を追加します。
- 4％パラホルムアルデヒド（PFA）を準備します。蒸留水150ミリリットルにPFAの20グラムを追加します。攪拌しながら80℃に溶液を加熱します。解決策をクリアするには、熱を削減し、パラホルムアルデヒドが溶解を助けるために1 NのNaOHの1または2滴を追加します。 250ミリリットルへの完全な蒸留水で0.2 Mリン酸バッファー（pH 7.4）250 mlで加えます。 4℃で保存。これらの試薬を使用する際に適切な注意を払ってください。化学ボンネットの下に手袋、白衣....
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結果
c-FOSの検出は、 生体内 （ 図2A） における低酸素および高炭酸ガス血症として、またはこれらの条件のex vivo（ 図2B）を模倣する状況では、特定の条件下で活性化された細胞の識別グループを可能にする便利なツールです。 インビボ 、新生児、若いです、または成人の齧歯類は、ガス環境が継続的に正確に30〜180分13,25,26（ 図2A）のために定義された組成物との混合ガスにより更新された気密箱に入れました。全身に刺激作用したように、C-FOSの関連変化は、中枢および末梢活性化される経路の両方を反映している可能性が。 エクスビボは 、延髄と脊髄を含む求心路遮断準備が連続して異なるレベルのaCSFので灌流チャンバーに入れました低酸素や高炭酸ガスの条件をモデル化するために、O 2またはpHの（ 図2B）30分
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ディスカッション
C-FOSの前初期遺伝子であり、その生成物の検出は、C-FOSタンパク質は、古典的なインビボ 11,13,25,28 内の特定の呼吸応答に関与する神経細胞集団を同定するために使用され、 エクスビボで 16-18、 27,32,33。
議定書の中で重要なステップ
灌流工程の間には注意してください。 4％PFA溶液が十分に準備しなければならないと固定および定着後のステップは、最適なスライスと染色を得るのに十分な長さでなければなりません。さらに、啓示は、手順の中で最も重要なステップです。染色の強度は、バックグラウンドノイズを回避するように制御されるべきです。
既存の方法に関して技術と意義の利点
い.......
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開示事項
著者らは開示するものは何もない。
謝辞
この作業はパリ13大学が支援しました。ASPTは、パリ第13大学のフェローシップと「Association Française pour le Syndrome d'Ondine」の支援を受けました。FJは、Laboratory of Excellence GR-Exフェローシップの支援を受けました。GR-Ex(参照ANR-11-LABX-0051)は、フランス国立研究機関のプログラム「Investissement d'avenir」(参照ANR-11-IDEX-0005-02)によって資金提供されています。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 細胞培養プレート12ウェル | コスタ | 35/3 | |
| 15ミリメートルネットウェルインサートメッシュポリエステル膜 | コーニング | 3477 | 15ミリメートルの井戸インサートは74µを持っています。ポリスチレンインサートに取り付けられたmポリエステルメッシュボトム一次 |
| 抗体(c-Fosタンパク質に対するウサギポリクローナル抗体) | サンタクルーズ | バイオテクノロジーsc-52 | |
| ベクタステインエリートABCキット | ベクターラボ | PK-6101 | |
| (Rabbit IgG-secondary antibody) | |||
| NaH2PO4*2H2O | Sigma | 71505 | |
| Na2HPO4Sigma | S7907 | ||
| パラホルムアルデヒド | Σ | P6148 | |
| NaOH 0.1N | Σ | 43617 | |
| ポリビニルピロリドン | ΣPVP-360 | ||
| ショ糖 | Σ | S7903 | |
| NaCl | Σ | S7653 | |
| エチレングリコール | Σ | 33068 | |
| Triton X100 | Σ | T8787 | |
| Trisma HCl Σ | T5941 | ||
| トリズマベース | シグマ | T1503 | |
| 3.3-ジアミノベンジジン四塩酸塩 | Rockland | DAB50 | |
| ニッケル アンモニウム 硫酸塩 | Alfa Aesar | 12519 | |
| H2O2 | Sigma | H1009 | |
| キシレン | Sigma | 33817 | |
| Entellan Neo | Merck Millipore | 107961 | |
| スライド | サーモサイエンティフィック | 1014356190 | スーパーフロスト ウルトラプラス |
| カバーガラス | サーモサイエンティフィック | サイエンティフィック Q10143263NR1 | 24 x 60mm |
| BSA | シグマ | A2153 |
参考文献
- Curran, T., Teich, N. M. Identification of a 39,000-dalton protein in cells transformed by the FBJ murine osteosarcoma virus. Virology. 116, 221-235 (1982).
- Curran, T., MacConnell, W. P., van Straaten, F., Verma, I. M.
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再版と許可
