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方法論記事

ヒト下垂体腺腫細胞の三次元アルギン酸ビーズ文化

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DOI:

10.3791/53637

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2016年2月18日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology, Biophysics and Neurosciences, Center for Research and Advanced Studies (CINVESTAV-IPN), 2Department of Experimental Pathology, Nacional Institute of Neurology and Neurosurgery

この記事について

サマリー

アルギン酸ビーズの三次元培養は、その単純さと再現性のために、下垂体腺腫細胞を維持するために選ばれました。手順には、腫瘍組織の最初の酵素消化と機械的解離が含まれ、その後の細胞懸濁液はアルギン酸ビーズにカプセル化されました。

要約

三次元培養法が記載されている主要な下垂体腺腫細胞をアルギネートビーズ中で増殖させます。アルギン酸塩は茶色の海藻由来ポリマーです。簡潔には、腫瘍組織を小片に切断し、コラゲナーゼ及びトリプシンで酵素消化に供します。次に、細胞懸濁液を得ました。腫瘍細胞懸濁液を1.2％アルギン酸ナトリウムと混合し、 塩化カルシウム溶液に滴下し、そしてアルギネート/細胞懸濁液を球状ビーズを形成するためのCaCl 2と接触してゲル化されます。アルギン酸ビーズに埋め込まれた細胞を、20％FBSを富化培地によって提供栄養分が供給されます。アルギン酸ビーズ内の三次元培養物は、4ヶ月まで、長期間腺腫細胞の生存率を維持します。また、細胞は、クエン酸ナトリウムでビーズを洗浄することにより、アルギン酸塩から遊離し、さらに免疫細胞化学的分析のためにカバーガラス上に播種することができます。 CELの使用リットル培養モデルは、最小限の解体とアクチン細胞骨格の固定と可視化を可能にします。要するに、アルギン酸ビーズは、下垂体腺腫細胞の維持のための信頼できる培養系を提供します。

概要

それらは、培養細胞および細胞-細胞コミュニケーション1の維持のための三次元構造的支持を提供するための三次元足場は、広範囲の細胞培養に使用されてきました。天然由来のポリマー材料は​​、I型コラーゲン、キトサンおよびアルギン酸塩を含む三次元の足場を作るために使用されています。アルギン酸塩は、褐色海藻Macrocystispyrifera（昆布）に由来する天然高分子です。このポリマーは、β-D-マンヌロン酸（M）及びα-L-グルロン酸（G）は、カルシウム及びバリウムのような特定の二価カチオンの存在下で、2及びフォーム安定なゲルの反復単位で構成されています。 塩化カルシウム（CaCl 2）溶液は、一般的にアルギン酸ビーズを形成するために、架橋試薬として使用されます。アルギン酸ソリューションは、すぐに3次元球状ゲルを形成するのCaCl 2に低下しました。アルギン酸塩溶液を細胞と混合されると、細胞は、アルギネートBに封入されていますEADS 3。

アルギン酸塩は、軟骨4を含む細胞、骨格筋芽細胞5及び神経幹細胞6の種々のカプセル化のためのマトリックスとして使用することを可能にしている特性を有します。これは、不活性材料であり、栄養素、酸素及び細胞の生存および機能を維持する代謝産物の拡散を可能にします。また、他のゲルベースの培養系とは異なり、アルギン酸ビーズ内の培養細胞は、例えば、クエン酸ナトリウムなどのカルシウムキレート化剤を使用して、骨格から遊離することができ、次いで細胞をさらに調査7のために回収することができます。

下垂体腺腫は、典型的には、低増殖速度と良性腫瘍です。ラット下垂体腺腫細胞系は、二次元系8で正常培養しました。しかし、分泌ヒト下垂体細胞腫瘍のこの文化は、効率的な開発ではありません。分散した腫瘍下垂体細胞は成長が悪いです培養において、細胞は、制限された付着および拡散を示し、細胞は、典型的には、培養皿9,10浮遊凝集体を形成します。

いくつかの試みは、酵素的、機械的分散手法11、単に機械的分散法12と腫瘍外植片10の培養を含む、腫瘍、下垂体細胞懸濁液を得るために行われています。これらのアプローチでは、別の著者は、異なる期間のために実行可能な接着培養を得ました。これらの2次元系で生き残るために腫瘍分泌細胞の能力は、腫瘍の種類とそれらの増殖率9に依存します。しかし、長期培養において、線維芽細胞の表現型を有する細胞が11,13が優勢 。本論文では、さらに以下の詳細な分析を可能にアルギン酸足場からそれらを遊離アルギン酸ビーズ中にカプセル化された下垂体腺腫細胞からの初代培養を得るための方法を説明しその細胞生物学、 例えば 、それらの細胞骨格の配置の側面。

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プロトコル

この研究は、医療機関と国立工科大学の研究アドバンス研究センターの地域の倫理委員会によるヒト材料の使用が承認されました。

1.腫瘍サンプル取得

  1. トランス蝶形骨の外科処置14を介して患者から下垂体腺腫の組織生検を取得します。
  2. 下垂体腺腫サンプルを採取し、新鮮な10％​​ウシ胎児血清（FBS）で富化199培地（M199）、0.6 mg / mlで、炭酸水素ナトリウム、2.4 mg / mlでHEPESおよび1％の50 mlを含む滅菌ガラス瓶に置きpH7.4での抗生物質（ペニシリン/ストレプトマイシン）。氷の上のガラス瓶にサンプルを維持します。
    注：腫瘍組織は、手術後数時間を処理することができます。
  3. 氷の上のガラス瓶で研究室に腫瘍サンプルを輸送します。

酵素組織解離ソリューションの調製、トリプシン阻害剤溶液とアルギン酸ソリューション

注：前の細胞培養プロシージャに次の溶液を調製します。使用前に、0.22μmのメンブレンフィルターを使用して、すべてのソリューションをフィルタリングします。

  1. M199-無血清5mlにコラゲナーゼ（タイプI）5mgを溶解させることによりコラゲナーゼ1％溶液を準備します。
  2. PBS-EDTA、0.3％の10mlのトリプシン0.01グラムに溶解することによりトリプシン0.01％の溶液を調製します。
  3. M199-無血清20mlに大豆トリプシンインヒビターの2ミリグラムを溶解し、0.1％トリプシン阻害剤溶液を準備します。
  4. トリプシン阻害剤溶液の4ミリリットルでのDNAse I 134 U / mlの20μlのを溶解することによりDNase溶液を準備します。
  5. 155 mMのNaClを40ミリリットルにEGTAの22.8ミリグラムを溶解することによりEGTA溶液（1.2 M）を準備します。 pHを7.4に調整します。 50ミリリットルの最終容量に進みます。
  6. 155 mMのNaClを50ミリリットルで238ミリグラムのHEPESを溶解させることによってHEPES溶液（20 mm）を準備します。
  7. 1.2を溶解して1.2％のアルギン酸塩溶液を調製しますHEPES溶液100mlのGアルギン酸ナトリウム。アルギン酸塩溶液をオートクレーブ。
  8. pHを7.4に調整する50mlのHEPES溶液中のCaCl 2の750ミリグラムを溶解させることによってカルシウム溶液（102ミリモル）を準備

3.初代細胞培養およびアルギン酸塩カプセル化

  1. クリーンベンチ内部には、約20ミリリットルを含まないPBSのCa 2+およびMg 2+、pH7.4の（PBS *）のを含む35ミリメートルペトリ皿に腫瘍組織を置きます。
  2. 手術用ピンセットで組織を取り、新鮮なPBS *を含む別のペトリ皿に置き、静かに組織を洗います。赤血球および破片が削除されるまで、この手順を繰り返します。
  3. 手術用ピンセットを使用して、下垂体腺腫の組織を保持し、小さな手術用ハサミで小片にそれをカット。丸みを帯びたエッジをパスツールピペットを用いて、RTで10分間68×gで、15mlチューブに遠心分離した組織フラグメントおよびPBS *を転送します。
    注：パスツールのエッジを丸くするにはピペットは、わずかにブンゼンバーナーでピペットの先端を火炎。
  4. パスツールピペットを使用して、* PBSを削除し、コラゲナーゼ溶液（組織の65ミリメートル3に対して約5ミリリットル）3〜5mlのを追加し、反転させて2〜3回混ぜます。一定の回転で37℃で30分間コラゲナーゼで組織をインキュベートします。
  5. RTで10分間、68×gでチューブを遠心し、パスツールピペットでコラゲナーゼを削除します。
  6. DNアーゼの5ミリリットルを追加し、反転させることにより2〜3回混ぜ、次いで、室温で10分間68×gでチューブを遠心します。
    注：組織が完全に解離していない場合は、37℃で3分間トリプシンで第二の酵素消化を行います。トリプシン阻害剤溶液の2倍量の添加によって消化を停止します。
  7. パスツールピペットで上清を吸引し、廃棄します。 EGTA溶液の1体積でペレットを再懸濁し、アルギン酸塩溶液の2倍量と混合。
  8. 静かに細胞懸濁液とアルギン酸塩を混ぜますパスツールピペットでピペッティングすることもできます。 21 G針で無菌注射器を取り、プランジャーを削除します。アルギン酸塩および細胞溶液で注射器をロードするためにピペットを使用しています。
  9. ゆっくりシリンジにプランジャーを挿入し、慎重に約30ミリリットルのカルシウムが豊富なソリューションのを含有するガラスビーカーにアルギン酸細胞液滴ずつを分注します。
  10. 約5cmまでのCaCl 2溶液に注射器の針を置きます。球状のビーズを形成するためのCaCl 2と接触するアルギネート細胞懸濁液ゲル。 5分間カルシウム溶液中にアルギン酸ビーズを保管してください。
    注：ビーズがドロップされたガラスビーカーをかき混ぜます。互いに付着するのを防ぐために、円を描くように手でゆっくりと移動します。
  11. 慎重にパスツールピペットでカルシウム溶液を除去し、FBSの20％で強化されたM199 3〜5ミリリットルで二回ビーズを洗浄します。
  12. 定期的なT25組織培養にアルギン酸ビーズを転送無菌スパチュラを用いてフラスコを5％CO 2の加湿インキュベーター中、37℃でM199 4-5ミリリットル、20％FBSで富化インキュベート加えます。二日おきに培地を変更します。

4.アルギン酸からの細胞を解放します

注：前のアルギン酸ビーズから細胞を遊離するために、ポリ-D-リジンでコート直径13mmのカバースリップを。

注意：SULPHURIC ACIDは、腐食性の高い酸であり、APTSは目と皮膚への炎症を引き起こす可能性があります。これらの試薬を処理するためにゴム手袋を使用しています。

  1. 、ドラフト内でポイントピンセットを用いて室温で1時間、20％の硫酸水溶液を含むガラスペトリ皿にカバースリップを浸します。
  2. 硫酸をデカントし、5分毎に、蒸留水でカバーガラスを5回洗浄します。ポイントピンセット場所RT 15で5分間、0.1MのNaOHを含むペトリ皿の中のきれいなカバーグラスを使用。
  3. NaOHをデカントし、蒸留で1回洗います水を吸引し、カバースリップを乾燥、水を導きました。
  4. 4分間のAPTS（アミノプロピルトリエトキシシラン）で被覆するためにカバーグラスをマイクロピペットを使用して蒸留水でペトリ皿をフラッディング（6カバースリップのための500μLを使用します）。すばやく水を吸引し、水が下に浸透することを可能にする点ピンセットでカバースリップを移動し、蒸留水で洗浄し続けています。
  5. 水を吸引し、カバースリップを乾燥、清潔なペトリ皿にカバースリップをポイントピンセットの場所を使用し、3回、45秒のそれぞれの間にマイクロ波の内側にそれらを滅菌します。ポリ-D-リジン（0.1 mg / mlで）を100μgに滅菌水1000μLを加えます。
  6. 室温で5分間、ポリ-D-リジンの約50μlのカバースリップをインキュベートします。完全にポリ-D-リジンを吸引します。
    注：培地中の可溶性ポリ-D-リシンが細胞増殖を阻害することができるので、これは重要です。
  7. 5分ごとにカバースリップを滅菌水で5回洗浄します。目を吸引erile水とカバースリップは、クリーンベンチ内部に乾燥させます。
  8. アクチン細胞骨格を分析するために、アルギン酸塩から下垂体細胞を遊離させます。 1ミリリットルピペットチップを用いて培養フラスコからアルギン酸ビーズの一部を取り、15mlチューブに入れます。
  9. 55 mMクエン酸ナトリウムの5 mlを加え、室温で10分間、68×gで遠心分離（323.6のNa 3 C 6 H 5 O 7 mgの、2 H 2 O 20 mLのHEPES溶液を溶解します）。上清を吸引し、廃棄します。
  10. 20％FSBで富化暖かいM199の1ミリリットル中にペレットを再懸濁;静かにパスツールピペットで細胞懸濁液を混ぜます。
    注意：ファロイジンおよびDAPIは有毒です。これらの試薬を扱うために手袋を使用します。
  11. 細胞をカウントし、1.5ミリリットルチューブに0.4％トリパンブルー溶液の125μlのを転送します。 M19975μlのと最後のステップ（希釈係数= 5）で得られた50μlの細胞懸濁液を追加します。完全に混合。
  12. PLACするためにマイクロピペットチップを使用します血球計数器チャンバー内のトリパンブルー細胞懸濁液の電子約10μlの。
  13. 位相コントラスト照明付き倒立顕微鏡を用いて、血球計数器カウンターで細胞をカウントします。 1ミリメートルの中央広場、4 1ミリメートル角の正方形のすべてのセルを数えます。希釈係数により平方あたりの平均数を乗算してミリリットル当たりの細胞密度を得る- 。10 4、例えば平方あたりの平均数は45セル×5×104 = 2.25×10 6細胞/ mlである場合。
    注：血球計数器室の10乗で細胞をカウントします。下と右の両側に中央の線に触れて細胞をカウントしないでください。
  14. ポリ-D-リジンで被覆された直径13mmのカバーガラス上で35,000細胞をシード。

5.アクチン細胞骨格のアレンジメント

  1. 培養48時間後、パスツールピペットで培地を除去し、素早くPBSのカバースリップあたり500μlを添加、直ちにPBSを削除します。
  2. トンを修正し、透過処理37℃で10分間固定緩衝液（0.1M PIPES、pHが6.75、4％PEG-6000、1mMのEGTA、1mMの硫酸マグネシウム、0.5％トリトンX-100および2％ホルムアルデヒド）のカバースリップあたり500μlの彼の細胞C言語
  3. 固定バッファを削除し、RTで30分間、PBS中の3.5％パラホルムアルデヒドのカバースリップあたり500μlを添加します。パラホルムアルデヒド溶液を除去します。
  4. 5分ごとに、PBSのカバースリップあたり500μLを添加することにより、カバーグラスを3回洗浄します。一定の撹拌で、室温でカバースリップを洗い流します。
  5. 、10分間、50mMの塩化アンモニウムで細胞をインキュベート塩化アンモニウム溶液を吸引し、ステップ5.4を繰り返します。
  6. 、30分間、PBS中の1％BSA（IgGのフリー、プロテアーゼフリー）で細胞をインキュベートし、BSA溶液を除去し、ステップ5.4を繰り返します。
  7. RT、リピートステップ5.4で7分間、ローダミン結合ファロイジンの50μMで細胞をインキュベートします。
  8. RT、リピートステップ5.4で5分間、PBSで希釈したDAPIの255μMで細胞をインキュベートします。最後にトンをマウント彼は、封入剤でカバースリップし、マニキュアでそれらを封印。
  9. 541 nmの励起波長で63X対物レンズを用いて共焦点レーザー走査顕微鏡を用いて、アクチン細胞骨格の構成の画像を取得します。

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結果

このプロトコルは、異なる期間のためアルギン酸ビーズに腺腫下垂体細胞の培養および維持に正常に適用された3ヶ月後、アルギン酸ビーズ中の細胞を埋め込 ​​ま1に示す図 。これらの細胞は、倒立光学顕微鏡（ 図1）の下で、双屈折丸みを帯びた形状を示す。 図2は、アルギン酸塩に埋め込 ​​まれたラット下垂体腺腫細胞におけるN-カドヘリンの局在を示します。 N-カドヘリンは、細胞-細胞接触（ 図2A および 2C）に局在し、核は（ 図2B および 2C）拡張クロマチンを示しました。

アルギン酸ビーズ中の腫瘍細胞は、培養中の最大4ヶ月間生存し続けます。従って、細胞は、さまざまな側面の分析を可能にする、異なる時間にアルギン酸ビーズから遊...

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ディスカッション

このプロトコルは、いくつかの重要なステップがあります。最初は、細胞培養のすべての中の栄養素とガスの拡散の同じ条件を維持するために必要とされるビーズサイズの均一性です。我々の経験では、アルギン酸ビーズを作るために21 G針の使用は、均一なビーズサイズの効率的な文化の取得を可能にします。第二の重要な要素は、針からの距離です。この距離は、カルシウム溶液の表面にアルギン酸塩/細胞溶液の流れの衝突による変形真珠や死細胞を回避するために、カルシウム溶液からわずか5センチメートルでなければなりません。第三の重要なステップは、ビーズが互いに付着するのを防止するために廃棄されるガラス撹拌あります。不均一な細胞カプセル化に結果を貼り付けます。

このプロトコルにいくつかの変更は、当社の経験では、例えば、研究の質問に依存wを混合することができるアルギン酸ナトリウムの溶液を行うことができますIV型コラーゲンなどの基底膜タンパク質番目、および前述のプロトコルに従って、三次元アルギネート足場を得ます。別の可能性は、直径15mmのウェル中に浮遊アルギン酸クッションを作ることです。これらのゲルの内部に、細胞は、上ま...

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

技術支援をしてくださったO.リオス氏に感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
<ストロング>試薬 
199培地 インビトロジェン 31100-027文化のために、37°Cで暖かく。使用前のCウォーターバス 
ウシ胎児血清 PAAA15-751
重曹 (NaHCO3)Merck106329
N-(2-ヒドロキシエチル) ピペラジン-N´-2ethanesulfonic acid (HEPES)Sigma H-4034
ペニシリン/ストレプトマイシンPAAP11-010
PBS(ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水)Invitrogen 21600-044
コラゲナーゼI型Worthington4176
トリプシン インビトロジェン 27250-018
エチレンジアミン四酢酸 (EDTA)Research Organics3002E
ソルビーントリプシン阻害剤 インビトロジェン 17075-029
DNAseWorthington2139
アルギン酸、Macrocystis pyrifera (昆布)シグマから A-2158
塩化カルシウム (CaCl2)J.T. Baker1332
クエン酸ナトリウム (Na3C6H5O7)J.T. Baker3646
Piperazine-N,N′-bis(2-ethanesulfonic acid) (PIPES)Research Organics9624P
ポリエチレングリコール 6000 (PEG 6000)Calbiochem528877
Ethyleneグリコール四酢酸 (EGTA)Research Organics9574E
硫酸マグネシウム (MgSO4)J.T. Baker2500
Triton-X 100SigmaX100
ホルムアルデヒドJ.T. Baker2106
パラホルムアルデヒドΣP6148
塩化アンモニウム (NH4Cl)J.T. Baker660
BSA ウシ血清アルブミン IgG-FreeJackson Immuno Research001-000-161
ファロイジン;テトラメチルローダミンBイソチオシアネートシグマP1951毒性。この試薬の取り扱いには手袋を使用してください 
4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール、二塩酸塩(DAPI)Invitrogen D1306有毒。この試薬の取り扱いには手袋を使用してください 
硫酸 (H2SO4)J.T. Baker9681腐食性が高い。この試薬の取り扱いには手袋を使用してください 
水酸化ナトリウム(NAOH)メルク1.06498、目や皮膚の炎症を引き起こす可能性があります。この試薬の取り扱いには手袋を使用してください 
(3-アミノプロピル)トリエトキシシラン(APTS)SigmaA-3648
Poly-D-リジン臭化水素酸塩SigmaP7280
トリパンブルー溶液Σ T8154 
名前  会社 カタログ番号 strong<>コメント
Equipment 有毒:がんを引き起こす可能性があります。この試薬の取り扱いには手袋を使用してください 
ローテーター Boekel ScientificModel 230300
遠心分離機ポンコーポレーション モデルソーバルTC6
シェーカー ラボライン機器Model 314-820 
はデュ

参考文献

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  13. Thompson, K. W., Vincent, M. M., Jensen, F. C., Price, R. T., Schapiro, E. Production of hormones by human anterior pituitary cells in serial culture. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 102 (2), 403-408 (1959).
  14. Cappabianca, P., Cavallo, L. M., Solari, D., Stagno, V., Esposito, F., de Angelis, M. Endoscopic endonasal surgery for pituitary adenomas. World neurosurg. 82 (6 Suppl), S3-S11 (2014).
  15. Aplin, J. Model Matrices for Studing Cell Adhesion. Measuring cell adhesion. Curtis, A. S. G., Lackie, J. M. , John Wiley & Sons. 110-111 (1991).
  16. Guiraud, J. M., et al. Human prolactin-producing pituitary adenomas in three-dimensional culture. In. Vitro. Cell. Dev. Biol. 27 (3), 188-190 (1991).
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